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1、病毒感染力的滴定一、病毒一、病毒TCIDTCID5050的测定的测定操作步骤操作步骤在在青青霉霉素素瓶瓶中中将将病病毒毒作作连连续续1010倍倍的的稀稀释释，从从1010-1-1-1010-10-10。将将稀稀释释好好的的病病毒毒接接种种到到9696孔孔微微量量培培养养板板中中，每每一一稀释度作稀释度作8 8孔，每孔接种孔，每孔接种100100l l。在在每每孔孔加加入入细细胞胞悬悬液液100100l l，使使细细胞胞量量达达到到3103105 5个个/ml/ml。设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。逐日观察并记录结果，一般需要观察逐日观察并记录结果，一
2、般需要观察5-75-7天。天。结果的计算，按结果的计算，按Reed-MuenchReed-Muench两氏法或两氏法或KarberKarber法法TCIDTCID5050的计算方法的计算方法Calculation of TCIDCalculation of TCID5050 Use of Reed&Muench method(if 50 ul of virus dilution is added to each well)病毒液病毒液CPE孔数孔数无无CPE累累计计出现出现CPE孔孔稀释度稀释度孔数孔数CPE孔数孔数无无CPE孔数孔数所占的所占的%10-180270100（27/27）10-2
3、80190100（19/19）10-37111191.6（11/12）10-4354640（4/10）10-5171130.7（1/14）10-6080210（0/21）Reed-MuenchReed-Muench两氏法两氏法距距离离比比例例（高高于于50%50%病病变变率率的的百百分分数数-50%-50%）/（高高于于50%50%病变率的百分数病变率的百分数-低于低于50%50%病变率的百分数）病变率的百分数）（91.6-5091.6-50）/（91.6-4091.6-40）0.80.8lgTCIDlgTCID5050=距距离离此此例例稀稀释释度度对对数数之之间间的的差差+高高于于50%50
4、%病变率的稀释度的对数病变率的稀释度的对数 =0.8(-1)+(-3)=0.8(-1)+(-3)=-3.8 =-3.8 TCID TCID5050=10=10-3.8-3.80.1ml0.1mlKarber法法病毒液稀释度病毒液稀释度 出现出现CPECPE孔的比率孔的比率10-18/8=110-28/8=110-37/8=0.87510-43/8=0.37510-51/8=0.12510-60/8=0lgTCIDlgTCID5050=L-d(s-0.5)=L-d(s-0.5)L:L:最高稀释度的对数最高稀释度的对数D D：稀释度对数之间的差：稀释度对数之间的差S S：阳性孔比率总和：阳性孔比率
5、总和lgTCIDlgTCID5050=-1-1(3.375-0.5)=-1-1(3.375-0.5)=-3.875 =-3.875 TCID TCID5050=10=10-3.875-3.875/0.1ml/0.1ml 二、病毒蚀斑技术二、病毒蚀斑技术病毒蚀斑（病毒蚀斑（plaque)plaque)又又称称空空斑斑，指指病病毒毒在在已已长长成成的的单单层层细细胞胞上上形形成的局限性病灶。成的局限性病灶。原理：原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基纤维素）的作用
6、下，病毒在最初感染的细胞内增殖后，纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后，只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局限性的病灶。限性的病灶。plaquesProceduresProcedures操作步骤操作步骤将敏感细胞在平皿或将敏感细胞在平皿或6 6孔板内培养成单层孔板内培养成单层吸弃培养液，加入含钙、镁的吸弃培养液，加入含钙、镁的PBSPBS（pH7.4pH7.4）洗）洗1-21-2次。次。用维持液将病毒液作连续用维持液将病毒液作连续1010
7、倍的稀释，选择适当稀倍的稀释，选择适当稀释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量约为原培养液的约为原培养液的1/10-1/51/10-1/5，以覆盖住细胞单层为宜，以覆盖住细胞单层为宜，每个稀释度接种每个稀释度接种2-32-3孔。孔。将培养板置将培养板置37 5%CO37 5%CO2 2培养箱吸附培养箱吸附1h1h，吸弃病毒液，吸弃病毒液，用含钙、镁的用含钙、镁的PBSPBS（pH7.4pH7.4）洗）洗3 3次。次。取取1.6%-2%1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-4238-42，与等量预热至与等量预
8、热至38-4238-42含含6%-10%6%-10%犊牛血清的无酚红犊牛血清的无酚红DMEMDMEM混合，注入细胞培养板中。混合，注入细胞培养板中。室温放置直至琼脂糖凝固，或于室温放置直至琼脂糖凝固，或于44冰箱放置几冰箱放置几分钟至琼脂糖凝固，然后于分钟至琼脂糖凝固，然后于37 5%CO37 5%CO2 2培养箱培养箱继续培养。继续培养。每天于显微镜下观察细胞病变情况。每天于显微镜下观察细胞病变情况。出现空斑后（出现空斑后（2-32-3天），用含钙、镁的天），用含钙、镁的PBSPBS将将0.1%0.1%的中性红贮存液的中性红贮存液1010倍稀释后滴加到细胞培养倍稀释后滴加到细胞培养板上。板上
9、。于于37 5%CO37 5%CO2 2培养箱中作用培养箱中作用1h1h，吸弃染液，继，吸弃染液，继续于温箱中培养续于温箱中培养2-3h2-3h。TKTK-突变株与野毒形成的空斑的比较突变株与野毒形成的空斑的比较如果是测定如果是测定PFUPFU，则直接记取一定稀释度的病，则直接记取一定稀释度的病毒所形成的空斑数，然后根据公式计算毒所形成的空斑数，然后根据公式计算PFUPFU。如果是作病毒纯化如果是作病毒纯化 挑取空斑于挑取空斑于200L200L维持液中，反复冻融维持液中，反复冻融3 3次，接次，接种于种于PK-15PK-15细胞已长成单层的细胞已长成单层的2424孔细胞培养板，孔细胞培养板，再
10、于再于37 5%CO37 5%CO2 2培养箱培养至完全发生病变。培养箱培养至完全发生病变。一般的毒种纯化：一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，测定收集病变的细胞悬液，测定TCIDTCID5050，然后选，然后选TCIDTCID5050较高者再作几轮空斑纯化，较高者再作几轮空斑纯化，获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。筛选重组病毒：筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，收集病变的细胞或病毒悬液，通过通过PCRPCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下一轮空斑纯化。如此一轮空斑纯化。如此3-53-5轮空斑纯化后即可得到轮空斑纯
11、化后即可得到纯化的病毒粒子。纯化的病毒粒子。噬斑技术的应用：噬斑技术的应用：用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株测定病毒悬液中感染病毒的含量测定病毒悬液中感染病毒的含量噬斑形成单位噬斑形成单位（plaque forming unit,plaque forming unit,PFUPFU）概念：概念：每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液中每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液中的感染性病毒浓度。的感染性病毒浓度。计算方法：计算方法：如用如用PRVPRV接种接种PK-15PK-15细胞，每孔接种了细胞，每孔接种了0.4ml0.4ml，结，结果果1010-5-5孔形成了孔形成了208208个空斑，而个空斑，而1010-6-6孔形成了孔形成了2222个空斑，个空斑，则该病毒在则该病毒在PK-15PK-15细胞上的空斑形成单位（细胞上的空斑形成单位（PFUPFU）为：）为：221022106 6/0.4ml=5.510/0.4ml=5.5107 7个个/ml/ml。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢