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1、关于菌种选育方法关于菌种选育方法1第一页，本课件共有57页22.2 菌种选育菌种选育主要内容主要内容n自然选育自然选育n诱变育种诱变育种n抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育n杂交育种杂交育种n原生质体融合技术原生质体融合技术nDNA重组技术重组技术n菌种保藏菌种保藏第二页，本课件共有57页3n经典育种经典育种：n自然选育自然选育n诱变育种诱变育种n带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。n定向育种定向育种：n转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。定向的育种方法。n国内这些方法
2、成功地用在生产上的例子较少，发达国家比较普遍国内这些方法成功地用在生产上的例子较少，发达国家比较普遍育种方法育种方法第三页，本课件共有57页42.2.1 自然选育自然选育n自然选育自然选育n自然突变自然突变n自然分离自然分离第四页，本课件共有57页51 自然选育自然选育n自然选育：自然选育：不经过人工处理，利用菌种的自然突变不经过人工处理，利用菌种的自然突变(spontaneous Mutation)而进行菌种筛选的过程叫做自然选而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。育。n自然突变：自然突变：是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。些突变。n自然突变
3、的原因自然突变的原因n自然突变的频率自然突变的频率n正突变和负突变正突变和负突变第五页，本课件共有57页62 自然突变的原因自然突变的原因n多因素低剂量的诱变效应多因素低剂量的诱变效应n多因素低剂量的诱变效应：由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质(如过氧化氢)的作用等。n互变异构效应互变异构效应第六页，本课件共有57页7n四种碱基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶四种碱基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤和鸟嘌呤(G)可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶可以酮式或烯醇
4、式出现，胞嘧啶(C)和腺瞟呤和腺瞟呤(A)可以氨可以氨基式或亚氨基式出现。平衡一般倾向于酮式和氨基式，因基式或亚氨基式出现。平衡一般倾向于酮式和氨基式，因此，在此，在DNA双链结构中以双链结构中以AT和和GC碱基对为主。碱基对为主。n可是在偶然情况下可是在偶然情况下T也会以稀有的烯醇式形式出现，因而也会以稀有的烯醇式形式出现，因而在在DNA复制到达这一位置的一瞬间，通过复制到达这一位置的一瞬间，通过DNA多聚酶的作多聚酶的作用，在它的相对位置上就不出现用，在它的相对位置上就不出现A而出现而出现G。n如果如果C以稀有的亚氨基形式出现，在新合成的以稀有的亚氨基形式出现，在新合成的DNA单链的单链的
5、相对位置上就将是相对位置上就将是A而不是而不是G。自然突变自然突变-互变异构效应互变异构效应第七页，本课件共有57页8n n互变异构效应互变异构效应-可以被诱变剂激发可以被诱变剂激发第八页，本课件共有57页9间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂:5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU）n5-BU是是T的代谢类似物。当把某一微生物培养在含的代谢类似物。当把某一微生物培养在含5-BU的培的培养液中时，细胞中有一部分新合成的养液中时，细胞中有一部分新合成的DNA的的T就被就被5-BU所取所取代。代。5-BU一般以酮式状态存在于一般以酮式状态存在于DNA中中，因而仍可正常地与，因而仍可正常地与A配对，这
6、时并未发生碱基对的转换。配对，这时并未发生碱基对的转换。有时有时5-BU会以烯醇式会以烯醇式状态出现在状态出现在DNA中，于是当中，于是当DNA进行复制时，在其相对位置进行复制时，在其相对位置上出现的就是上出现的就是G，而不是原来的而不是原来的A，因而引起了碱基对从原因而引起了碱基对从原来的来的AT变至变至G C的转换。的转换。第九页，本课件共有57页105-BU在以酮式或烯醇式状态存在时引起在以酮式或烯醇式状态存在时引起的的ATG C的转换的转换n A:T G:Cn A:T A:Buk G:Bue G:Cn G:Bue A:T G:C A:Bukn A:BU G:C A:T A:BU第十页，
7、本课件共有57页11碱基的置换碱基的置换 直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A.THe.THk.THk.CA.THk.CG.CCOH次黄嘌呤(He)第十一页，本课件共有57页12n大量统计分析后，发现大量统计分析后，发现碱基对发生自然突变的机率约为碱基对发生自然突变的机率约为10-8-10-9。n自然突变有两种情况：自然突变有两种情况：n一种是生产上所不希望有的，表现为菌种的衰退和生产质一种是生产上所不希望有的，表现为菌种的衰退和生产质量的下降，称为量的下降，称为负突变负突变；n另一种是对生产有益的，表现为菌株生产性能的上升，称另一种是对生产有益
8、的，表现为菌株生产性能的上升，称为为正突变正突变。自然突变的频率，正突变和负突变自然突变的频率，正突变和负突变第十二页，本课件共有57页133 自然分离自然分离n自然分离自然分离:生产菌株经过一定时期的使用后须纯化，淘汰生产菌株经过一定时期的使用后须纯化，淘汰衰退的；保存优良的菌种。衰退的；保存优良的菌种。n从高生产水平批号中取样进行单菌落分离，从中选出比较从高生产水平批号中取样进行单菌落分离，从中选出比较稳定的菌株，用于生产。稳定的菌株，用于生产。n突变株自然分离突变株自然分离:经诱变的突变株会继续发生变异。其经诱变的突变株会继续发生变异。其结果往往导致菌株不同类型的比例的改变，结果往往导致
9、菌株不同类型的比例的改变，而低单位而低单位菌株在传代过程中往往占优势，菌株在传代过程中往往占优势，必须进行自然分离。必须进行自然分离。第十三页，本课件共有57页14n自然选育简单易行，可以纯化菌种，防止菌种衰退、稳定生自然选育简单易行，可以纯化菌种，防止菌种衰退、稳定生产、提高产量。产、提高产量。n缺点是效率低、进展慢。自然选育和诱变育种交替使用，效果好。缺点是效率低、进展慢。自然选育和诱变育种交替使用，效果好。n自然选育自然选育(自然分离自然分离)的一般程序的一般程序n把菌种制备成单孢子悬浮液，经过适当的稀释以后，在固体平板上进行把菌种制备成单孢子悬浮液，经过适当的稀释以后，在固体平板上进行
10、分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定，经反复筛选，以确定生产分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定，经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株。能力更高的菌株代替原来的菌株。自然分离自然分离第十四页，本课件共有57页152.2.2 诱变育种诱变育种 n诱变育种的基本原理诱变育种的基本原理n诱变育种的一般步骤诱变育种的一般步骤 n诱变育种工作中几个应该注意的问题诱变育种工作中几个应该注意的问题n几种物理、化学诱变剂的使用方法几种物理、化学诱变剂的使用方法第十五页，本课件共有57页161 诱变育种的基本原理诱变育种的基本原理n诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染诱变育种的理论
11、基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。n染色体畸变和基因突变。染色体畸变和基因突变。n染色体畸变（染色体畸变（chromosomal aberration)：是指染色体或是指染色体或DNA片断的插入（片断的插入（insertion)、缺失缺失(deletion)、易位易位(translocation)、倒位倒位(inversion)、重复重复(duplication)等。等。n基因突变基因突变(gene mutation)：是指是指DNA分子结构中的一对分子结构中的一对或几对碱基发生变化或几对碱基发生变化(又称
12、点突变又称点突变)。第十六页，本课件共有57页17倒置易位缺失点突变突变类型突变类型第十七页，本课件共有57页18突变发生的原因突变发生的原因n可分为自然突变和诱发突变。可分为自然突变和诱发突变。n自然突变自然突变是指在自然条件下出现的基因突变是指在自然条件下出现的基因突变n诱发突变诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。n诱变因素有物理的、化学的和生物的三大类，见诱变因素有物理的、化学的和生物的三大类，见表表6-1。第十八页，本课件共有57页19常用诱变剂及其类别常用诱变剂及其类别 第十九页，本课件共有57页20n从从Watson和和C
13、rick的的DNA双双螺旋结构模型中可看出，螺旋结构模型中可看出，虽然两条单链之间的碱基虽然两条单链之间的碱基受着互补规律的制约受着互补规律的制约(即即A必须和必须和T，C必须和必须和G配对配对)，但就一条单链来说四种，但就一条单链来说四种碱基的排列顺序是不受限碱基的排列顺序是不受限制的。制的。nDNA的多样性即碱基排列的多样性即碱基排列方式的多样性是遗传性千方式的多样性是遗传性千差万异的内在原因。差万异的内在原因。突变发生的原因突变发生的原因第二十页，本课件共有57页21第二十一页，本课件共有57页222 诱变育种的一般步骤诱变育种的一般步骤 n诱变育种整个流程主要是诱变育种整个流程主要是诱
14、变诱变和和筛选筛选两部分。两部分。n诱变：诱变：包括由出发菌株开始，制出新鲜孢子悬浮液包括由出发菌株开始，制出新鲜孢子悬浮液 （或细菌悬液）经过诱变处理以后以一定稀释涂平（或细菌悬液）经过诱变处理以后以一定稀释涂平板，至平板上长出单菌落等各步骤。板，至平板上长出单菌落等各步骤。n诱发所形成的突变与菌种本身的遗传背景、诱变剂诱发所形成的突变与菌种本身的遗传背景、诱变剂种类及其剂量的选择和合理使用方法均有密切关系。种类及其剂量的选择和合理使用方法均有密切关系。第二十二页，本课件共有57页23诱变育种诱变育种n筛选：筛选：包括经单孢子分离长出单菌落后随机挑至包括经单孢子分离长出单菌落后随机挑至斜面，
15、经斜面，经初筛和复筛初筛和复筛进行生产能力测定和菌种保存进行生产能力测定和菌种保存(即将筛选出来的高产菌种保藏好即将筛选出来的高产菌种保藏好)。n诱变育种的整个过程主要是诱变和筛选的不断重诱变育种的整个过程主要是诱变和筛选的不断重复，直到获得比较理想的高产菌株。复，直到获得比较理想的高产菌株。第二十三页，本课件共有57页24诱诱变变育育种种的的一一般般步步骤骤第二十四页，本课件共有57页253 诱变育种应该注意的问题诱变育种应该注意的问题n选择好出发菌株：选择好出发菌株：产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。广。n复合诱变因素的使用复合诱变因素的使用：对野生型
16、菌株，单一诱变因素有对野生型菌株，单一诱变因素有时也能取得好的效果，但对老菌种，单一诱变因素重复使用时也能取得好的效果，但对老菌种，单一诱变因素重复使用突变的效果不高，这时可利用复合因素来扩大诱变幅度，提突变的效果不高，这时可利用复合因素来扩大诱变幅度，提高诱变效果。高诱变效果。n剂量选择：剂量选择：凡既能增加变异幅度又能促使变异向正变范围凡既能增加变异幅度又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适的剂量。移动的剂量就是合适的剂量。n变异菌株的筛选：变异菌株的筛选：营养缺陷型、抗反馈抑制营养缺陷型、抗反馈抑制/阻遏、组成阻遏、组成型型n高产菌株的筛选需要筛选条件的配合高产菌株的筛选需要筛选条件的
17、配合第二十五页，本课件共有57页264 诱变剂的使用方法诱变剂的使用方法 l紫外线l快中子l氮芥l亚硝酸lN甲基-N硝基N亚硝，基胍(NTG)第二十六页，本课件共有57页27A 紫外线紫外线n紫外线的辐射光源便宜，危险性小，诱变效果好，应用最紫外线的辐射光源便宜，危险性小，诱变效果好，应用最广泛。广泛。n对诱变最有效的波长仅仅是对诱变最有效的波长仅仅是260nm左右左右(253265 nm)一一般诱变时用菌般诱变时用菌(孢子孢子)悬浮液进行处理，紫外灯的功率为悬浮液进行处理，紫外灯的功率为15W，距离固定在距离固定在30cm左右。左右。n紫外线的作用机制：紫外线的作用机制：主要是形成主要是形成
18、胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体以改变以改变DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。生物活性，造成菌体死亡和变异。第二十七页，本课件共有57页28紫外线对紫外线对DNA的损伤的损伤n对紫外线来说，嘧啶要比嘌呤敏感得多。嘧啶的光化产物主对紫外线来说，嘧啶要比嘌呤敏感得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。要是二聚体和水合物。紫外线的主要作用是使同链紫外线的主要作用是使同链DNADNA的相的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。n二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构发二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构发生扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，
19、从而有可能引起突变生扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。或死亡。n在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响了会妨碍双链的解开，因而影响了DNADNA的复制和转录，并使细的复制和转录，并使细胞死亡。胞死亡。第二十八页，本课件共有57页29第二十九页，本课件共有57页30紫外-NaNO2复合诱变育种复合诱变育种优势菌群紫外线辐射NaNO2处理驯化培养正突变菌株 性状菌株氧化活性/LO2L-1min-1比生长速率/h-1传代时间/h在矿物表面吸附平衡时间/h原始菌0.10.130.058-
20、0.1166122428改良菌0.91.10.1783.917改良菌的性状远优于原始菌改良菌的性状远优于原始菌第三十页，本课件共有57页31紫外线对紫外线对枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应的诱变效应n菌悬液的制备菌悬液的制备（a）取培养取培养48小时的枯草芽孢杆菌小时的枯草芽孢杆菌BF7658（产产淀粉酶）的斜面淀粉酶）的斜面4-5支，用无菌生理支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌分钟，以打碎菌块。块。（b）将上述菌液离心（将上述菌液离心（3000r/min，离心离心15分钟），弃
21、去上清液，将菌体用无菌生分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液。次，最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。个。n平板制作平板制作n将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至45左右时倒平板，凝固后待用。左右时倒平板，凝固后待用。第三十一页，本课件共有57页32紫外线诱变紫外线诱变n紫外线处理紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约将紫外线灯开关打开预热约20分钟。分钟。（b）取直径取直径6cm无菌平皿无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液套，分别加入上述菌悬液5ml
22、，并放入无菌搅拌棒于平皿并放入无菌搅拌棒于平皿中。中。（c）将盛有菌悬液的将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为功率为15W的的紫外线灯下分别搅拌照射紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及分钟及3分钟。分钟。n稀释稀释n在在红灯红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成倍稀释法稀释成10-1-10-6（具（具体可按估计的存活率进行稀释）。体可按估计的存活率进行稀释）。n涂平板涂平板n取取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加只，每只平板
23、加稀释菌液稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。的菌稀释液涂平板作对照。第三十二页，本课件共有57页33n培养：培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37培养培养48小时。注意每小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。个平皿背面要标明处理时间和稀释度。n计数计数：将培养：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理算出
24、每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、分钟、3分钟后的存活细胞分钟后的存活细胞数及其致死率。数及其致死率。n观察诱变效应观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。接到试管斜
25、面上培养。此斜面可作复筛用。第三十三页，本课件共有57页34 B 快中子快中子 n中子产生中子产生：中子可由回旋加速器、静电加速器或原子反应堆产生。中子可由回旋加速器、静电加速器或原子反应堆产生。中子中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子来，因而快中子的不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子来，因而快中子的生物学效应，几乎完全是由质子造成的。生物学效应，几乎完全是由质子造成的。n快中子快中子：中子分为快中子和慢中子。慢中子的效应同中子分为快中子和慢中子。慢中子的效应同射线、射线、射线和电射线和电子等照射时引起的基本相同，快中子较子等照射时引起的基本相同，快中子较
26、X射线、射线、射线具有较大的电射线具有较大的电离密度，因而能更多地引起点突变和染色体畸变。离密度，因而能更多地引起点突变和染色体畸变。n剂量剂量：用快中子进行诱变育种时，用菌悬浮液或长在平皿上的菌落用快中子进行诱变育种时，用菌悬浮液或长在平皿上的菌落进行处理，所用剂量范围约为进行处理，所用剂量范围约为1001500戈。戈。第三十四页，本课件共有57页35C 氮芥氮芥 n氮芥是一种极易挥发的油状物，氮芥是一种极易挥发的油状物，一般使用它的盐酸盐一般使用它的盐酸盐。应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠起作用，释放出氮芥应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠起作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。子气，
27、再与细胞起作用而造成变异。ClCH2CH2ClCH2CH2NHHCll其盐酸盐结构式为：其盐酸盐结构式为：第三十五页，本课件共有57页36氮芥的诱变机制、解毒n诱诱变变机机制制：氮氮芥芥能能引引起起染染色色体体畸畸变变，是是被被利利用用得得最最早早的的一一种种诱诱变变剂剂。青青霉霉素素产产生生菌菌的的选选育育，获获得得了了良良好好的的效果。效果。n 解解毒毒：氮氮芥芥盐盐酸酸盐盐在在碳碳酸酸氢氢钠钠溶溶液液中中呈呈游游离离状状态态，甘甘氨氨酸酸能能与与氮氮芥芥(在在碳碳酸酸氢氢钠钠参参与与下下)结结合合，形形成成无无毒毒化化合物，因此它有解毒作用。其反应式为合物，因此它有解毒作用。其反应式为：
28、第三十六页，本课件共有57页37氮芥使用方法氮芥使用方法n配制活化剂和解毒剂配制活化剂和解毒剂n称取碳酸氢钠称取碳酸氢钠68mg加入蒸馏水加入蒸馏水10mL，即为即为活化剂活化剂；n称取碳酸氢钠称取碳酸氢钠136mg,甘氨酸甘氨酸120mg,溶解在溶解在200mL蒸馏蒸馏水中，即为水中，即为解毒剂解毒剂。n将这两种溶液高压灭菌备用。将这两种溶液高压灭菌备用。n将一只小瓶和橡皮塞灭菌、烘干、称取约将一只小瓶和橡皮塞灭菌、烘干、称取约10mg的氮芥盐酸的氮芥盐酸盐放入瓶中，再加入灭菌蒸馏水盐放入瓶中，再加入灭菌蒸馏水2mL，则成为每毫升含有则成为每毫升含有5mg的氮芥盐酸盐溶液。的氮芥盐酸盐溶液。
29、第三十七页，本课件共有57页38氮芥使用方法氮芥使用方法n吸吸取取1mL孢孢子子悬悬浮浮液液(浓浓度度为为200万万孢孢子子mL)于于另另一一灭灭过过菌菌的的小小瓶瓶中中，加加入入0.6mL缓缓冲冲液液，再再加加入入0.4 mL上上述述氮氮芥芥溶溶液液，将将橡橡皮皮塞塞盖盖紧紧，摇摇匀匀，此此时时瓶瓶中中的的氮氮芥芥作作用用浓度为每毫升浓度为每毫升1mg。n加加入入氮氮芥芥溶溶液液30秒秒钟钟后后开开始始计计算算时时间间，达达到到所所需需要要的的时时间间后后，用用1mL注注射射器器吸吸取取0.1mL处处理理液液加加到到9.9 mL的的解解毒剂中，使氮芥作用停止。毒剂中，使氮芥作用停止。第三十八
30、页，本课件共有57页39D 亚硝酸亚硝酸n诱变机理：诱变机理：亚硝酸是一种常用的有效诱变剂，其诱变作亚硝酸是一种常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。用主要是脱去碱基中的氨基。n例如例如A、C、G分别被脱去氨基而成为次黄嘌呤分别被脱去氨基而成为次黄嘌呤(H)、尿嘧啶尿嘧啶(U)、黄黄嘌呤嘌呤(X)等。复制时，它们分别与等。复制时，它们分别与C、A、C配对。前两种情况可以引起配对。前两种情况可以引起碱基对的转换而造成突变。由碱基对的转换而造成突变。由A：T G：C，G：C A：T的转换已经的转换已经得到证实。由于得到证实。由于X(黄嘌呤黄嘌呤)的分子结构只能与的分子结构只能与C配对
31、，不能与配对，不能与T配对；配对；所以它不能引起所以它不能引起G：C A：T的转换因而不会造成突变。的转换因而不会造成突变。n亚硝酸还会引起亚硝酸还会引起DNA两条链之间的交联而造成两条链之间的交联而造成DNA结构上的缺失，机结构上的缺失，机制不清楚。制不清楚。第三十九页，本课件共有57页40A亚硝酸诱变机理亚硝酸诱变机理第四十页，本课件共有57页41亚硝酸诱变机理亚硝酸诱变机理第四十一页，本课件共有57页42n亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐(2HNO2 N2O3+H2O)：硝硝酸酸酐酐继继续续分分解解放放出出NO和和NO2(N2O3 NO+NO2)。
32、n可可在在临临用用前前将将亚亚硝硝酸酸钠钠放放在在pH4.5的的醋醋酸酸缓缓冲冲液液中中，生生成成亚亚硝酸硝酸(NaNO2+H+HNO2+Na+）亚硝酸使用方法亚硝酸使用方法第四十二页，本课件共有57页43E N甲基甲基-N硝基硝基N亚硝基胍亚硝基胍(NTG)n 亚硝基胍亚硝基胍是亚硝基烷基类化合物的一种，可诱发营养缺陷型突变，不是亚硝基烷基类化合物的一种，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到经淘汰便可直接得到12%-80%的营养缺陷型菌株，有超诱变剂之称。的营养缺陷型菌株，有超诱变剂之称。n应用原理：应用原理：n酸性条件：在酸性条件：在pH低于低于5-5.5的条件下，形成的条件下，形成
33、HNO2而引起菌种突变；而引起菌种突变；n碱性条件：以重氮甲烷的形式对碱性条件：以重氮甲烷的形式对DNA起烷化作用；起烷化作用；npH6时：两者均不产生，此时的诱变效应可能是由于时：两者均不产生，此时的诱变效应可能是由于NTG本身对核蛋本身对核蛋白体引起的变化所致。白体引起的变化所致。n处理条件：处理条件：NTG在甲酰胺中溶解度较大，用甲酰胺溶解在甲酰胺中溶解度较大，用甲酰胺溶解NTG可以提高可以提高处理浓度。通常在浓度为处理浓度。通常在浓度为300g/mL，温度为温度为28和时间和时间60分钟的条件下处分钟的条件下处理，容易获得高产菌株。理，容易获得高产菌株。第四十三页，本课件共有57页44
34、2.2.3 抗噬菌体菌株的选育第四十四页，本课件共有57页451 噬菌体的分布噬菌体的分布n噬菌体广泛分布在自然界，存在于土壤、肥料、粪便和污噬菌体广泛分布在自然界，存在于土壤、肥料、粪便和污水中。水中。n在工厂生产中，对排出的菌体如不及时处理，便有可能在在工厂生产中，对排出的菌体如不及时处理，便有可能在下水道的污水和四周土壤中滋生噬菌体，在情况严重时，下水道的污水和四周土壤中滋生噬菌体，在情况严重时，甚至从空气中亦能分离到噬菌体。甚至从空气中亦能分离到噬菌体。T4Bacteriophage(TEMx390,000)第四十五页，本课件共有57页46一种噬菌体感染大肠杆菌一种噬菌体感染大肠杆菌第
35、四十六页，本课件共有57页47n噬菌体的意义噬菌体的意义n细菌基因转导细菌基因转导n医医药药用用途途（1）鉴鉴别别细细菌菌；（2）治治疗疗的的佐佐剂剂：如如痢痢疾疾的的预预防防与与治治疗，配合抗生素。疗，配合抗生素。n噬噬菌菌体体的的危危害害：微微生生物物发发酵酵工工业业深深受受噬噬菌菌体体危危害害。例例如如抗抗生生素素工工业业、微微生生物物农农药药和和有有机机溶溶剂剂发发酵酵等等工工业业中中，普普遍遍存存在在着着噬噬菌菌体体的的危危害害。当当发发酵酵过过程程污污染染了了噬噬菌菌体体后后，轻轻者者使使发发酵酵周周期期延延长长，发发酵酵单单位位(产产量量)降低，重则造成倒罐，酿成经济损失，已成为
36、发酵工业的大敌。降低，重则造成倒罐，酿成经济损失，已成为发酵工业的大敌。噬菌体的经济意义噬菌体的经济意义第四十七页，本课件共有57页482 抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育n 在工业微生物发酵过程中，有不少品种遭受噬菌体的在工业微生物发酵过程中，有不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。这种瓦解细胞的噬菌体称为感染，使生产不能进行。这种瓦解细胞的噬菌体称为烈性噬菌体烈性噬菌体。n在出现噬菌体以后必须选育抗噬菌体菌株和配合其他在出现噬菌体以后必须选育抗噬菌体菌株和配合其他措施使生产继续进行。措施使生产继续进行。n由于噬菌体很易发生变异，因此又会出现新的噬菌体，由于噬菌体很易发生变异，因此又
37、会出现新的噬菌体，对噬菌体原具有抗性的菌株又会出现不抗。所以既要对噬菌体原具有抗性的菌株又会出现不抗。所以既要不断收集噬菌体，又要不断选育新的抗性菌株，以确不断收集噬菌体，又要不断选育新的抗性菌株，以确保生产正常进行。保生产正常进行。第四十八页，本课件共有57页49A 抗噬菌体菌株选育的几种方法抗噬菌体菌株选育的几种方法n自自然然突突变变 以以噬噬菌菌体体为为筛筛子子，敏敏感感菌菌株株的的孢孢子子不不经经任任何何诱诱变由其自然突变为抗性菌株，变由其自然突变为抗性菌株，抗性突变频率很低抗性突变频率很低。n诱发突变诱发突变 n敏敏感感菌菌株株先先经经诱诱变变因因素素处处理理，然然后后将将处处理理过
38、过的的孢孢子子液液分分离离在在含含有有高高浓浓度度的的噬噬菌菌体体的的平平板板培培养养基基上上，经经诱诱变变后后的的存存活活孢孢子子中中，如如存存在在抗抗性性变变异异菌菌株株就就能能在在此此平平板板上生长。上生长。诱变可以提高抗性菌株的频率诱变可以提高抗性菌株的频率。n或或将将敏敏感感菌菌孢孢子子经经诱诱变变后后接接入入种种子子培培养养基基，待待菌菌丝丝长长浓浓后后加加入入高高浓浓度度的的噬噬菌菌体体再再继继续续培培养养几几天天，再再加加入入噬噬菌菌体体反反复复感感染染，使使敏敏感感菌菌被被噬噬菌菌体体所所裂裂解解，最最后后取取再再生菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株。生菌丝进行平板分离，从中
39、筛选抗性菌株。第四十九页，本课件共有57页50B 抗噬菌体菌株的特性试验抗噬菌体菌株的特性试验 无无论论从从自自然然突突变变或或诱诱发发突突变变所所得得到到的的抗抗噬噬菌菌体体菌菌株株，在在用用于于生产之前，均需经过反复验证，才能使用。生产之前，均需经过反复验证，才能使用。n抗噬菌体性状的稳定性试验抗噬菌体性状的稳定性试验n抗抗性性菌菌株株分分别别在在孢孢子子培培养养、种种子子培培养养和和发发酵酵培培养养过过程程中中用用点滴法点滴法或或双层琼脂法双层琼脂法测定噬菌斑。测定噬菌斑。n不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有抗性。不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有抗性。n观察抗性菌株多次传代后对
40、噬菌体的抗性是否稳定。观察抗性菌株多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。第五十页，本课件共有57页51Phage Bacteria+PhageAssay for Lytic Phage第五十一页，本课件共有57页52噬菌斑第五十二页，本课件共有57页53抗性菌株的产量实验n在选育抗噬菌体菌株时，既要求具有抗性，同时亦要在选育抗噬菌体菌株时，既要求具有抗性，同时亦要求生产能力不低于原敏感菌株。求生产能力不低于原敏感菌株。n一般抗性菌株与原敏感菌株在某些发酵特性方面会有一般抗性菌株与原敏感菌株在某些发酵特性方面会有些改变。因此，要考察它对碳源、氮源、通气量、无些改变。因此，要考察它对碳源、氮源、通气量
41、、无机磷的添加量及其他培养条件的要求等。机磷的添加量及其他培养条件的要求等。第五十三页，本课件共有57页54n菌株的抗噬菌体菌株的抗噬菌体：具有遗传的相对稳定性，抗性表现为多种多样，可因细胞壁结构的改变而阻止噬菌体吸附侵入，也可因生理代谢的改变，使噬菌体不能侵染，即使侵染后也不能增殖释放。n溶原性菌株溶原性菌株：细胞中存在原噬菌体，对同一类型噬菌体具有免疫性。表面上看来，这种菌株具有抗性，但可采用物理、化学因素诱导(如UV照射。活化原噬菌体，使整合到细菌染色体上的噬菌体核酸活化，产生具有感染力的噬菌体粒子）不同的菌株看它是否会释放噬菌体。出现噬菌斑的菌株就是溶源菌，而不是真正抗性菌。真正抗性与
42、溶源性的区别试验真正抗性与溶源性的区别试验第五十四页，本课件共有57页553 噬菌体的防治噬菌体的防治n表表现现：都都会会出出现现畸畸形形菌菌丝丝，菌菌体体迅迅速速消消失失，pH上上升升，发发酵酵产产物停止积累，甚至下降等现象。物停止积累，甚至下降等现象。n受受侵侵染染的的发发酵酵过过程程：链链霉霉素素、红红霉霉素素、万万古古霉霉素素、金金霉霉素素、林林可可霉霉素素、谷谷氨氨酸酸、丙丙酮酮丁丁醇醇、山山梨梨糖糖、碱碱性性蛋蛋白白酶酶的的发发酵酵过程中都会遭到噬菌体的侵染，使生产遭到很大损失。过程中都会遭到噬菌体的侵染，使生产遭到很大损失。第五十五页，本课件共有57页56噬菌体的防治噬菌体的防治
43、n选育抗噬菌体菌株选育抗噬菌体菌株n消消灭灭噬噬菌菌体体 在在发发生生噬噬菌菌体体感感染染时时发发酵酵罐罐排排出出的的废废气气夹夹带带有有大大量量噬噬菌菌体体，造成严重污染和扩散。造成严重污染和扩散。n在排气口及下水道喷洒药剂，防止噬菌体扩散在排气口及下水道喷洒药剂，防止噬菌体扩散n在车间内外亦要定期喷洒药物在车间内外亦要定期喷洒药物n常用的药物有常用的药物有漂白粉、甲醛、石灰水等漂白粉、甲醛、石灰水等n收集和保存噬菌体收集和保存噬菌体n 在在生生产产上上出出现现噬噬菌菌体体后后要要收收集集并并保保藏藏起起来来，以以进进行行研研究究。为为选选育育抗抗性菌株及研究防治措施的提供材料。性菌株及研究防治措施的提供材料。第五十六页，本课件共有57页感感谢谢大大家家观观看看第五十七页，本课件共有57页