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1、关于菌种科学保藏常用方法第一页，本课件共有31页主要内容:v一、菌种保藏的目的v二、菌种保藏的原理（掌握）v三、菌种保藏的方法（重点）第二页，本课件共有31页什么是菌种衰退？生产菌株性状的劣化或遗传标记的丢失：v1、菌落形态的改变v2、生长速度缓慢v3、生产能力下降v4、抗不良环境能力减弱（抗噬菌体、低温等）第三页，本课件共有31页菌种退化原因v1、基因突变v2、连续传代v3、不良培养条件及不良保藏条件第四页，本课件共有31页菌种退化的防止v1、减少传代次数v2、用单核细胞和单菌落移种传代v3、菌种纯化v4、采用良好培养基和培养条件v5、科学的保藏第五页，本课件共有31页一、菌种保藏的目的v菌
2、种保藏的目的是：使菌种长期保藏之后，菌种保藏的目的是：使菌种长期保藏之后，仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征，以及不污染杂菌和不发生虫害。形态特征，以及不污染杂菌和不发生虫害。第六页，本课件共有31页二、菌种保藏的原理v菌种保藏的原理是通过菌种保藏的原理是通过低温、干燥、隔绝空低温、干燥、隔绝空气（真空）和断绝营养、加保护剂气（真空）和断绝营养、加保护剂等手段，等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制微生物的生长与繁殖。制微生物的生长与繁殖。v由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休由于菌种的代谢相对
3、静止，生命活动将处休眠状态，所以能够保藏较长时间。眠状态，所以能够保藏较长时间。第七页，本课件共有31页三、菌种保藏的方法1、斜面低温保藏斜面低温保藏（定期移植法）（定期移植法）2、液体石蜡保藏、液体石蜡保藏3、砂土管贮藏、砂土管贮藏4、麸皮保藏法麸皮保藏法5、悬液保藏、悬液保藏：1）生理盐水保藏法；）生理盐水保藏法；2）蒸馏水保藏法：）蒸馏水保藏法：6、冷冻真空干燥保藏法、冷冻真空干燥保藏法7、液氮超低温保藏法、液氮超低温保藏法8、甘油保藏法、甘油保藏法第八页，本课件共有31页国内、国际常用的菌种保藏法v我国常采用的菌种保藏法：斜面低温保藏斜面低温保藏、液体石蜡保藏、液体石蜡保藏、冷冻干燥法
4、、液氮超、冷冻干燥法、液氮超低温法。低温法。v国际（ATCC）常采用的方法：冷冻干燥法（冷冻干燥法（5-15年）、液氮超低温法（年）、液氮超低温法（20年）。年）。第九页，本课件共有31页斜面低温保藏(定期移植法)这是一种常用这是一种常用最简便最简便的保藏方法。的保藏方法。为了减少培养基水分散发，延长保藏时间，在配制时琼脂用为了减少培养基水分散发，延长保藏时间，在配制时琼脂用量加到量加到2.5，再加入，再加入0.2磷酸氢二钾、磷酸二氢钾及磷酸氢二钾、磷酸二氢钾及碳酸钙等缓冲剂，以中和保藏过程中产生的有机酸。可以碳酸钙等缓冲剂，以中和保藏过程中产生的有机酸。可以用无菌胶塞代替棉塞，既能防止污染，
5、又可隔绝氧气，避用无菌胶塞代替棉塞，既能防止污染，又可隔绝氧气，避免斜面干燥免斜面干燥细菌：细菌：1个月，酵母菌个月，酵母菌3个月，放线菌、霉菌半个月，放线菌、霉菌半年年。第十页，本课件共有31页第十一页，本课件共有31页二）、液体石蜡法操作简便，只要在菌苔上灌注一层无菌的操作简便，只要在菌苔上灌注一层无菌的液体石蜡，即可使菌种与外界空气隔绝，达液体石蜡，即可使菌种与外界空气隔绝，达到防止培养基水分散失，抑制菌丝新陈代谢，到防止培养基水分散失，抑制菌丝新陈代谢，推迟菌种老化，延长菌种生命和保存时间的推迟菌种老化，延长菌种生命和保存时间的目的。目的。此种方法也称为隔绝空气保藏法。此种方法也称为隔
6、绝空气保藏法。v第十二页，本课件共有31页v具体方法：1、石蜡的准备：选用化学纯液体石蜡100毫升，装入250毫升锥形瓶内，置于0.11兆帕灭菌3060分钟；然后置于160烘箱中处理12小时；或置40温箱内3天左右，见瓶内液体石蜡呈澄清透明，液层中无白色雾状物时即可。其目的是使灭菌时进入瓶内的水分得到蒸发。2、接种与保存：在无菌条件下，将液体石蜡用无菌吸管移入生长健壮、丰满的斜面菌种上，使液体石蜡高出斜面顶端1厘米左右；最后直立放置在洁净的室温下贮藏。转管时直接用刀切取1小块菌种，移接到新的斜面培养基中央，适温培养，余下的菌种仍在原液体石蜡中贮藏。第十三页，本课件共有31页三）、砂土管贮藏：此
7、法应用广泛，适于贮藏孢子和酵母状分生孢子，而对菌丝体不适用。此法保藏孢子，寿命可达此法保藏孢子，寿命可达210年，使用时在无年，使用时在无菌条件下，挑取少许砂土孢子，抖撒在菌条件下，挑取少许砂土孢子，抖撒在PDA斜面上，斜面上，适温培养，菌丝生长后，再转管培养适温培养，菌丝生长后，再转管培养1次。次。第十四页，本课件共有31页1.准备砂土:细河砂，用内径0.2500.177毫米筛孔过筛,除去粗粒和砂未；红黄壤土，内径0.149毫米过筛，用磁铁衬纸吸除砂土中铁屑，用0.050.1N盐酸浸泡半天，除去有机质。然后用清水反复冲洗至酸碱度近中性后，置于6080烘箱中烘干。砂土比例2:1或4:1混合，分
8、装入10毫米100毫米试管或安瓿瓶内，每管装量0.5克，经0.11兆帕121高压灭菌30分钟，每天1次，共3次，或160干热灭菌1次，保持23小时。灭菌后挑取少许砂土移至PDA斜面上培养，证实无杂菌即可。第十五页，本课件共有31页2、接种、接种:干接：用接种环直接挑取孢子干接：用接种环直接挑取孢子23环，拌入砂土管中环，拌入砂土管中湿接：将孢子刮入湿接：将孢子刮入5毫升无菌水的试管内，充分摇匀，制在孢子悬毫升无菌水的试管内，充分摇匀，制在孢子悬液，然后用液，然后用1毫升吸管吸取悬液，每管中加入毫升吸管吸取悬液，每管中加入0.2毫升。毫升。3、贮藏：、贮藏：干接法制成的砂土管，直接放在盛有无水氯
9、化钙、变色硅胶或干接法制成的砂土管，直接放在盛有无水氯化钙、变色硅胶或生石灰的广口瓶内保存：生石灰的广口瓶内保存：湿接法制成的砂土管，用真空泵抽气湿接法制成的砂土管，用真空泵抽气810小时，使之干燥。小时，使之干燥。放在盛有无水氯化钙或变色硅胶的大试管内，加橡皮塞，放置放在盛有无水氯化钙或变色硅胶的大试管内，加橡皮塞，放置46冰箱中贮藏。冰箱中贮藏。第十六页，本课件共有31页四）麸皮保藏法v亦称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入孢子，然后在低温干燥条件下保存。v其制作方法将麸皮与水以一定的比例1：(0.81.5)拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长
10、成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。v此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单，经济实惠，工厂较多采用。中国科学院微生物研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可达数年至数十年。第十七页，本课件共有31页五）、蒸馏水保藏法：这是保存斜面菌种和孢子最简单的方法，有效期可达这是保存斜面菌种和孢子最简单的方法，有效期可达1年年以上。以上。1、斜面蒸馏水贮藏：、斜面蒸馏水贮藏：在无菌条件下，将无菌蒸馏水倾注入需保藏的斜面菌种内。加在无菌条件下，将无菌蒸馏水倾注入
11、需保藏的斜面菌种内。加水量需高出斜面顶端水量需高出斜面顶端12厘米，更换无菌橡皮塞，直立置于厘米，更换无菌橡皮塞，直立置于46冰箱内贮藏。冰箱内贮藏。2、孢子蒸馏水贮藏：、孢子蒸馏水贮藏：无菌条件下提取少许孢子，移入试管无菌蒸馏水内，换上橡无菌条件下提取少许孢子，移入试管无菌蒸馏水内，换上橡皮塞，直立置于皮塞，直立置于46冰箱内贮藏。冰箱内贮藏。若保存时间较长，中途需补充无菌蒸馏水。使用时从管内挑若保存时间较长，中途需补充无菌蒸馏水。使用时从管内挑取菌种块或蘸取孢子悬液，移接至新的斜面培养基上活化培养。取菌种块或蘸取孢子悬液，移接至新的斜面培养基上活化培养。原试管加塞后仍可继续贮藏。原试管加塞
12、后仍可继续贮藏。第十八页，本课件共有31页六）、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法v采用低温、干燥和真空办法，使菌种的新陈代谢活动处于高度静止状态，也就是在极低温度下（-70左右）快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥，使菌体细胞结构成分保持原来状态。因此，菌种保藏1020年，仍不降低其原有性能。冷冻干燥是目前应用最广泛、效果较好的一种菌种保藏方法。第十九页，本课件共有31页六）、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法v1、安瓿瓶的准备：v2、保护剂的选择：v3、冷冻干燥装置：v4、制备孢子液v5、预冻孢子液：v6、减压干燥v7、真空熔封：v第二十页，本课件共有31页六）、冷冻真空干燥保藏法冷冻真
13、空干燥保藏法v1、安瓿瓶的准备：、安瓿瓶的准备：安瓿瓶的玻璃应能经受温度的突变而不破裂，先用安瓿瓶的玻璃应能经受温度的突变而不破裂，先用2盐酸浸泡盐酸浸泡12小时，再用清水洗涤小时，再用清水洗涤3次，然后用蒸馏水洗净、次，然后用蒸馏水洗净、烤干；瓶口加棉塞，灭菌后备用。烤干；瓶口加棉塞，灭菌后备用。2、保护剂的选择：、保护剂的选择：保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免受损伤及减少在保藏保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免受损伤及减少在保藏过程中的死亡。保护剂种类很多，如牛马血清、无菌牛奶等，过程中的死亡。保护剂种类很多，如牛马血清、无菌牛奶等，多数菌种保藏是脱脂牛奶。多数菌种保藏是脱脂牛奶。v3、
14、冷冻干燥装置：、冷冻干燥装置：这个装置包括这个装置包括1台真空泵、台真空泵、1付麦氏真空计、付麦氏真空计、1个缓冲瓶、个缓冲瓶、1个真空干燥器（内装五氧化二磷或无水氯化钙等干燥剂）和个真空干燥器（内装五氧化二磷或无水氯化钙等干燥剂）和1个冷冻槽（内盛有个冷冻槽（内盛有1:3的食盐和碎冰块）。的食盐和碎冰块）。第二十一页，本课件共有31页六）、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法4、制备孢子液：用接种针挑取孢子接入盛有、制备孢子液：用接种针挑取孢子接入盛有23毫升无菌脱脂毫升无菌脱脂牛奶的试管中，稍加搅动即制成悬浮液。用吸管吸取悬浮液注入安牛奶的试管中，稍加搅动即制成悬浮液。用吸管吸取悬浮液注入
15、安瓿瓶。每管分装约瓿瓶。每管分装约0.2毫升，注意不要溅污上部管壁，防止杂菌毫升，注意不要溅污上部管壁，防止杂菌污染和熔封时引起碳化。分装应在污染和熔封时引起碳化。分装应在1小时内完成，装后棉花塞好小时内完成，装后棉花塞好管口。管口。5、预冻孢子液：在冷冻干燥之前，先将孢子液的安瓿瓶，置、预冻孢子液：在冷冻干燥之前，先将孢子液的安瓿瓶，置于低温冰箱中预冻于低温冰箱中预冻1小时，安瓿瓶放在上述冻结剂中，只需小时，安瓿瓶放在上述冻结剂中，只需45分钟，温度便可达分钟，温度便可达-70。6、减压干燥：将预冻时附在这瓿瓶管上的冰水揩干，立、减压干燥：将预冻时附在这瓿瓶管上的冰水揩干，立即放入干燥器中抽
16、真空。即放入干燥器中抽真空。第二十二页，本课件共有31页六）、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法7、真空熔封：菌种安瓿瓶经减压干燥后，应立即取出安装在封口用、真空熔封：菌种安瓿瓶经减压干燥后，应立即取出安装在封口用的玻璃抽气管上，进行抽气熔封管口。边抽气，边用煤气或酒精的玻璃抽气管上，进行抽气熔封管口。边抽气，边用煤气或酒精灯的细火焰，对准安瓿瓶中央，即可熔断封口。熔封时应注意火灯的细火焰，对准安瓿瓶中央，即可熔断封口。熔封时应注意火焰，不宜过大。焰，不宜过大。安瓿瓶菌种启用时，在无菌操作下打开这瓿瓶，加入安瓿瓶菌种启用时，在无菌操作下打开这瓿瓶，加入0.30.5毫升的毫升的无菌生理盐水或无
17、菌生理盐水或1麦芽汁即可使用。麦芽汁即可使用。由于真空干燥保藏的菌种是密封在安瓿瓶里的，因此不仅邮由于真空干燥保藏的菌种是密封在安瓿瓶里的，因此不仅邮寄运输方便，并且不会污染杂菌。此法适于能形成孢子的菇类长寄运输方便，并且不会污染杂菌。此法适于能形成孢子的菇类长期保藏，其设备和操作均较复杂。期保藏，其设备和操作均较复杂。第二十三页，本课件共有31页七）、液态氮超低温保藏七）、液态氮超低温保藏v将要保藏菌种的悬浮液或菌块，密封于盛有保护剂的安瓿瓶里，先在控制的条件下致冷，使之缓速预冻，再置于-150至-196液态氮超低温冰箱中保藏。v优点：保存时间可长达数年至数十年；适用范围广，对一些即使不耐低
18、温菌种，如草菇等，也可在保护剂的保护下进行超低温保存；此外，经保藏的菌种基本上不发生变异。第二十四页，本课件共有31页国内、国际常用的菌种保藏法v我国常采用的菌种保藏法：斜面低温保藏、液体石蜡保藏、冷冻干燥法、液氮超低温法。v国际（ATCC）常采用的方法：冷冻干燥法（5-15年）、液氮超低温法（20年）。第二十五页，本课件共有31页国内主要的菌种保藏机构1、CCTCC中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC):CCTCC保藏的微生物包括细菌、放线菌、酵母菌、真菌、单细胞藻类、人和动物细胞系、转基因细胞、杂交瘤、原生动物，地衣
19、，植物组织培养、植物种子、动植物病毒、噬菌体、质粒和基因文库等各类微生物（生物材料/菌种）。http:/www.cctcc.org/第二十六页，本课件共有31页国内主要的菌种保藏机构2、CGMCC普通微生物菌种保藏管理中心:CGMCC的宗旨是广泛收集国内外的微生物资源，妥善保存，以公开的保藏机构的名义为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供标准化的实验材料,在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为第三者能够自由地利用各种微生物材料提供服务，最大限度的实现微生物资源的保护、共享和持续利用。http:/第二十七页，本课件共有31页国内主要的菌种保藏机构3、CICC中国工业微生物菌种保藏管理中
20、心:我国唯一的国家级工业微生物菌种资源保藏管理中心，保藏各种工业微生物菌种资源包括：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌和大型真菌，共67个属251种，近3000株，库藏备份80000余支。http:/www.china-cicc.org/第二十八页，本课件共有31页国内主要的菌种保藏机构4、GIMCC广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心:成立于1987年，隶属于广东省微生物研究所，主要从事微生物菌种资源分离、收集、保藏和应用研究。中心设有普通微生物菌种库和专业微生物菌种库，保藏有可用于科研、教学、生产的菌种约2500株，基本覆盖了环境、工业、农业、分析、食、药用真菌行业各类生产和科研用微生物，保藏的菌种具有热带亚热带特色，其中许多优良菌株的生产性能具有较高水平。广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心是华南地区最大、最专业的菌种保藏中心。http:/