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1、关于分子荧光光度法关于分子荧光光度法第一页，本课件共有20页 第一节第一节 概概 述述一、光致发光一、光致发光一、光致发光一、光致发光 物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至激发态。物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至激发态。物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至激发态。物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至激发态。处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通过辐射（发光）或处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通过辐射（发光）或处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通过辐射（发光）或处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通过辐射（发光）或非辐射的形式放出多余的能量，由激发态重新回到基态
2、。非辐射的形式放出多余的能量，由激发态重新回到基态。非辐射的形式放出多余的能量，由激发态重新回到基态。非辐射的形式放出多余的能量，由激发态重新回到基态。物物物物质分子吸收外来光被激发后所产生的发光现象，叫光质分子吸收外来光被激发后所产生的发光现象，叫光质分子吸收外来光被激发后所产生的发光现象，叫光质分子吸收外来光被激发后所产生的发光现象，叫光致发光。致发光。致发光。致发光。荧光荧光荧光荧光 1010-9-91010-6-6s s 实用实用实用实用 磷光磷光磷光磷光 1010-3-310s 10s 不实用不实用不实用不实用二、荧光光度法二、荧光光度法 利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含量
3、利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含量利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含量利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含量的分析方法，称为的分析方法，称为的分析方法，称为的分析方法，称为荧光光度法荧光光度法荧光光度法荧光光度法，即荧光法。，即荧光法。，即荧光法。，即荧光法。第二页，本课件共有20页 优点：灵敏度高，优点：灵敏度高，优点：灵敏度高，优点：灵敏度高，1010-7-71010-9-9g/mlg/ml，比紫外分光光度法灵敏，比紫外分光光度法灵敏，比紫外分光光度法灵敏，比紫外分光光度法灵敏度高度高度高度高101000101000倍。倍。倍。倍。第二节第二节 基本原理基本原理一、
4、荧光的产生一、荧光的产生 基态基态基态基态 激发光激发光激发光激发光 激发态激发态激发态激发态 去激发去激发去激发去激发 基态基态基态基态（一）（一）（一）（一）激发激发激发激发 处于基态的物质分子吸收光能时，其电子对中处于基态的物质分子吸收光能时，其电子对中处于基态的物质分子吸收光能时，其电子对中处于基态的物质分子吸收光能时，其电子对中的一个电子被激发到某一较高能级。的一个电子被激发到某一较高能级。的一个电子被激发到某一较高能级。的一个电子被激发到某一较高能级。基态单重态基态单重态基态单重态基态单重态 所有电子都自旋配对的分子电子态。所有电子都自旋配对的分子电子态。所有电子都自旋配对的分子电
5、子态。所有电子都自旋配对的分子电子态。激发态激发态激发态激发态 激发单重态激发单重态激发单重态激发单重态 S S1 1 S S2 2 激发三重态激发三重态激发三重态激发三重态 T T1 1 T T2 2 (二二二二)去激发去激发去激发去激发 指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐射指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐射指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐射指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐射方式回到基态的过程。方式回到基态的过程。方式回到基态的过程。方式回到基态的过程。第三页，本课件共有20页 辐射跃迁辐射跃迁辐射跃迁辐射跃迁 荧光荧光荧光荧光去激发去激发去激发去激发 磷光磷光磷光磷光 振动驰
6、豫振动驰豫振动驰豫振动驰豫 无辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁 内转移内转移内转移内转移 （热的形式）（热的形式）（热的形式）（热的形式）体系间跨越体系间跨越体系间跨越体系间跨越 外转移外转移外转移外转移 1 1、振动驰豫振动驰豫振动驰豫振动驰豫 同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动能级，并同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动能级，并同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动能级，并同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动能级，并将能量以热的形式传递给溶剂分子，这一过程称振动驰豫。将能量以热的形式传递给溶剂分子，这一过程称振动驰豫。将能量以热的形式传递给溶剂分子，这
7、一过程称振动驰豫。将能量以热的形式传递给溶剂分子，这一过程称振动驰豫。2 2、内转移内转移内转移内转移 两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级重叠时，两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级重叠时，两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级重叠时，两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级重叠时，电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时将能量以热的形式电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时将能量以热的形式电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时将能量以热的形式电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时将能量以热的形式传递给溶剂分子。传递给溶剂分子。传递给溶剂分子。传递给溶剂分子。第四页，本课件共有20页 意义：
8、意义：意义：意义：无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单重态无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单重态无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单重态无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单重态（如（如（如（如S S1 1、S S2 2、S S3 3)，它都能通过内转移和振动驰豫到达，它都能通过内转移和振动驰豫到达，它都能通过内转移和振动驰豫到达，它都能通过内转移和振动驰豫到达S S1 1的最低振动能级上。的最低振动能级上。的最低振动能级上。的最低振动能级上。一般情况下，一般情况下，一般情况下，一般情况下，S S1 1与与与与S S0 0之间很难发生内转移；之间很难发生内转移；之间很难发生内转移；之间
9、很难发生内转移；T T1 1与与与与S S0 0之间发生之间发生之间发生之间发生内转移的几率要大些。内转移的几率要大些。内转移的几率要大些。内转移的几率要大些。3 3、体系间跨越体系间跨越体系间跨越体系间跨越 电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为体系间跨电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为体系间跨电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为体系间跨电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为体系间跨越。常见于含重原子越。常见于含重原子越。常见于含重原子越。常见于含重原子(I(I、Br)Br)的有机分子中。的有机分子中。的有机分子中。的有机分子中。4 4、外转移外转移外转移外转移
10、 激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热的形式激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热的形式激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热的形式激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热的形式失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的外转移。外失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的外转移。外失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的外转移。外失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的外转移。外转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失，称转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失，称转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失，称转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失，称“猝灭猝灭猝灭猝灭”或或或或“熄灭熄灭熄灭熄灭
11、”。磷光寿命长，发生外转移机率大，所以室温下很。磷光寿命长，发生外转移机率大，所以室温下很。磷光寿命长，发生外转移机率大，所以室温下很。磷光寿命长，发生外转移机率大，所以室温下很难见到磷光。难见到磷光。难见到磷光。难见到磷光。第五页，本课件共有20页 5 5、荧光发射荧光发射荧光发射荧光发射 电子由第一激发单重态电子由第一激发单重态电子由第一激发单重态电子由第一激发单重态S S1 1（最低振动能级）跃迁至基态（最低振动能级）跃迁至基态（最低振动能级）跃迁至基态（最低振动能级）跃迁至基态S S0 0而而而而发射的光叫荧光。发射的光叫荧光。发射的光叫荧光。发射的光叫荧光。6 6、磷光发射磷光发射磷
12、光发射磷光发射 电子由第一激发三重态电子由第一激发三重态电子由第一激发三重态电子由第一激发三重态T T1 1跃迁至基态跃迁至基态跃迁至基态跃迁至基态S S0 0而发射的光叫磷光。而发射的光叫磷光。而发射的光叫磷光。而发射的光叫磷光。跃迁方式跃迁方式跃迁方式跃迁方式 时间时间时间时间 振动驰豫振动驰豫振动驰豫振动驰豫 1010-12 -12 10 10-14-14 S S 内转移内转移内转移内转移 1010-11 -11 10 10-13-13 S S 荧光荧光荧光荧光 1010-6-6 10 10-9-9 S S 磷光磷光磷光磷光 1010-4 -4 10 S 10 S 第六页，本课件共有20
13、页二、影响荧光的因素二、影响荧光的因素 荧光效率荧光效率荧光效率荧光效率：f=发射荧光的分子数发射荧光的分子数发射荧光的分子数发射荧光的分子数 被激发的分子总数被激发的分子总数被激发的分子总数被激发的分子总数 荧光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。荧光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。荧光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。荧光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。1 1、分子结构、分子结构、分子结构、分子结构 (1)*(1)*跃迁能产生较强荧光。跃迁能产生较强荧光。跃迁能产生较强荧光。跃迁能产生较强荧光。产生荧光的主要跃迁产生荧光的主要跃迁产生荧光的主要跃迁产生荧光的主要跃迁类型类
14、型类型类型 (2)(2)含含含含-共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大，荧共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大，荧共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大，荧共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大，荧光效率越大。光效率越大。光效率越大。光效率越大。(3)(3)刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面性增加，刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面性增加，刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面性增加，刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面性增加，电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。(4)(4
15、)取代基效应：斥电子基取代基效应：斥电子基取代基效应：斥电子基取代基效应：斥电子基 f f 吸电子基吸电子基吸电子基吸电子基 f f 重原子重原子重原子重原子 f f 第七页，本课件共有20页2 2、环境因素、环境因素、环境因素、环境因素 (1)(1)温度温度温度温度 温度温度温度温度荧光效率荧光效率荧光效率荧光效率 (2)(2)溶剂溶剂溶剂溶剂 极性极性极性极性 荧光荧光荧光荧光 (3)(3)溶液溶液溶液溶液pHpH值值值值 影响荧光物质存在形式。因此要严格控制溶液影响荧光物质存在形式。因此要严格控制溶液影响荧光物质存在形式。因此要严格控制溶液影响荧光物质存在形式。因此要严格控制溶液pHpH
16、值。值。值。值。(4)(4)荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子等等）荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子等等）荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子等等）荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子等等）3 3、荧光物质浓度、荧光物质浓度、荧光物质浓度、荧光物质浓度 自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间碰撞增自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间碰撞增自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间碰撞增自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间碰撞增多，使荧光强度减弱的现象。多，使荧光强度减弱的现象。多，使荧光强度减弱的现象。多，使荧光强度减弱的现象。第八页，本课件共有20页原理图原理图原理图原理图 荧
17、光测量应在垂直激发光方向上进荧光测量应在垂直激发光方向上进荧光测量应在垂直激发光方向上进荧光测量应在垂直激发光方向上进行。行。行。行。一、光源一、光源一、光源一、光源 特点：光强度大，适用范围宽。特点：光强度大，适用范围宽。特点：光强度大，适用范围宽。特点：光强度大，适用范围宽。常用：高压汞灯，氙灯，溴钨灯，常用：高压汞灯，氙灯，溴钨灯，常用：高压汞灯，氙灯，溴钨灯，常用：高压汞灯，氙灯，溴钨灯，激光，脉冲激光激光，脉冲激光激光，脉冲激光激光，脉冲激光二、单色器二、单色器二、单色器二、单色器 干涉滤光片，光栅干涉滤光片，光栅干涉滤光片，光栅干涉滤光片，光栅三、样品池三、样品池三、样品池三、样品
18、池 石英杯石英杯石英杯石英杯四、检测器四、检测器四、检测器四、检测器 光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管第三节第三节 荧光光度计荧光光度计日立日立850型荧光分光光度计型荧光分光光度计第九页，本课件共有20页 第四节第四节 定量分析方法定量分析方法原理：原理：一定条件下，荧光强度（一定条件下，荧光强度（一定条件下，荧光强度（一定条件下，荧光强度（I If f)与浓度与浓度与浓度与浓度(c)(c)呈线性关系。呈线性关系。呈线性关系。呈线性关系。I If f=Kc=Kc 定量分析的依据定量分析的依据定量分析的依据定量分析的依据 方法：方法：方法：方法：标准曲线法和标准对比法标准曲线法和标准对
19、比法标准曲线法和标准对比法标准曲线法和标准对比法第十页，本课件共有20页第五节第五节 分析条件的选择分析条件的选择 线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除一、线性范围的选择一、线性范围的选择一、线性范围的选择一、线性范围的选择 荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性关系。荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性关系。荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性关系。荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性关系。二、选择激发波长和荧光波长二、选择
20、激发波长和荧光波长二、选择激发波长和荧光波长二、选择激发波长和荧光波长1 1、激发波长的选择激发波长的选择激发波长的选择激发波长的选择激发光谱激发光谱激发光谱激发光谱：将光源发射的激发光用单色器单色后照射物质，将光源发射的激发光用单色器单色后照射物质，将光源发射的激发光用单色器单色后照射物质，将光源发射的激发光用单色器单色后照射物质，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定相应连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定相应连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定相应连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定相应的荧光强度，所得荧光强度的荧光强度，所得荧光强度的荧光强度，所得荧光强度的荧光强
21、度，所得荧光强度-激发波长图谱，称激发光激发波长图谱，称激发光激发波长图谱，称激发光激发波长图谱，称激发光谱。谱。谱。谱。一般选择最大激发波长作为激发光波长。一般选择最大激发波长作为激发光波长。一般选择最大激发波长作为激发光波长。一般选择最大激发波长作为激发光波长。第十一页，本课件共有20页2 2、荧光波长的选择荧光波长的选择荧光波长的选择荧光波长的选择 荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱：用最大激发波长的激发光照射荧光物质时，依次：用最大激发波长的激发光照射荧光物质时，依次：用最大激发波长的激发光照射荧光物质时，依次：用最大激发波长的激发光照射荧光物质时，依次测定所发射的各波长的荧光强度，所得
22、荧光强度测定所发射的各波长的荧光强度，所得荧光强度测定所发射的各波长的荧光强度，所得荧光强度测定所发射的各波长的荧光强度，所得荧光强度-荧光波长图荧光波长图荧光波长图荧光波长图谱，称为荧光光谱。谱，称为荧光光谱。谱，称为荧光光谱。谱，称为荧光光谱。一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。三、散射光干扰的排除三、散射光干扰的排除1 1、散射光、散射光、散射光、散射光 当用一束光照射溶液时，大部分光被吸收和透过，还有小当用一束光照射溶液时，大部分光被吸收和透过，还有小当用一束光照
23、射溶液时，大部分光被吸收和透过，还有小当用一束光照射溶液时，大部分光被吸收和透过，还有小部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种光称散射光。部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种光称散射光。部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种光称散射光。部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种光称散射光。瑞利散射光瑞利散射光瑞利散射光瑞利散射光 波长与激发光波长一样波长与激发光波长一样波长与激发光波长一样波长与激发光波长一样 拉曼散射光拉曼散射光拉曼散射光拉曼散射光 波长比激发光波长长波长比激发光波长长波长比激发光波长长波长比激发光波长长第十二页，本课件共有20页2 2、消除方法消除方法消除方法消除方法
24、（1 1）选择适宜的激发光波长）选择适宜的激发光波长）选择适宜的激发光波长）选择适宜的激发光波长 用不同波长的激发光照射某一荧光物质，所产生的用不同波长的激发光照射某一荧光物质，所产生的用不同波长的激发光照射某一荧光物质，所产生的用不同波长的激发光照射某一荧光物质，所产生的荧光峰位波长相同荧光峰位波长相同荧光峰位波长相同荧光峰位波长相同 ，但产生的拉曼散射光峰位各不相，但产生的拉曼散射光峰位各不相，但产生的拉曼散射光峰位各不相，但产生的拉曼散射光峰位各不相同。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生同。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生同。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生同
25、。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。（2 2）选择合适的溶剂）选择合适的溶剂）选择合适的溶剂）选择合适的溶剂 拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼散拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼散拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼散拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼散射光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光波长射光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光波长射光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光波长射
26、光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光波长远离荧光波长，而消除其干扰作用。远离荧光波长，而消除其干扰作用。远离荧光波长，而消除其干扰作用。远离荧光波长，而消除其干扰作用。第十三页，本课件共有20页 第六节第六节 应应 用用 因荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、取样量少因荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、取样量少因荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、取样量少因荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、取样量少等优点，而被广泛应用于医学检验、药物分析、环境监等优点，而被广泛应用于医学检验、药物分析、环境监等优点，而被广泛应用于医学检验、药物分析、环境监等优点，而被广泛应用于医学检验、药物分析、环境监测和卫生防疫等领域。测和卫生防疫等领域。测和卫生防疫等领域。测和卫生防疫等领域。第十四页，本课件共有20页第十五页，本课件共有20页4、5、6第十六页，本课件共有20页返回第十七页，本课件共有20页1、2第十八页，本课件共有20页返回第十九页，本课件共有20页感谢大家观看12/10/2022第二十页，本课件共有20页