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1、关于分解纤维素的微生物分离第一页，本课件共有34页纤维素与纤维素酶纤维素与纤维素酶1.1.纤维素纤维素纤维素是一种由纤维素是一种由葡萄糖葡萄糖首尾相连而成的首尾相连而成的高分高分子子化合物，是含量最丰富的化合物，是含量最丰富的多糖多糖类物质。类物质。一、基础知识一、基础知识 植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物天然产物。第二页，本课件共有34页土壤中某些微生物能够产生纤维素酶土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。维素分解为葡萄糖，后再利用。
2、第三页，本课件共有34页 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过植物每年产生的纤维素超过7070亿吨，其中亿吨，其中40%-40%-60%60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。不会大量积累。在草食性动物等的消化道内，也在草食性动物等的消化道内，也共生有分共生有分解纤维素的微生物解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等人类可应用分解纤维
3、素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。等。第四页，本课件共有34页2.2.纤维素酶纤维素酶 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般认为它，一般认为它至少包括至少包括三种组分三种组分，即，即C C1 1酶酶(外切酶外切酶)、C CX X酶酶(内切酶内切酶)和葡萄糖和葡萄糖苷酶苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素第五页，本课件共有34页取
4、二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验实验：纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的醋的醋酸醋酸钠缓冲液酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什：乙试管的滤纸条为什么会
5、消失？甲试管的作用是什么？么？第六页，本课件共有34页提示：提示：本实验的本实验的自变量是纤维素酶的有无自变量是纤维素酶的有无，自变，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的蒸馏水，否则会影响溶液的pHpH。实验分析：实验分析：P P2727的小实验是如何构成对照的小实验是如何构成对照的？的？第七页，本课件共有34页刚果红染色法刚果红染色法刚果红能与纤维素形成红色复合物刚
6、果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物红色复合物。当。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌以纤维素分解菌为中心的透明圈为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生，这样我们就可以通过是否产生透
7、明圈来筛选纤维素分解菌。透明圈来筛选纤维素分解菌。第八页，本课件共有34页第九页，本课件共有34页二、实二、实 验验 设设 计计 请你根据实验流程图和提供的三个资料以及请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提操作提示示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。方案。土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释 将样品涂布在鉴别纤将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上维素分解菌的培养基上 筛选产生透筛选产生透 明圈的菌落明圈的菌落第十页，本课件共有34页分布环境分布环境1 1、土壤取样：、土壤取样：富含纤维素的环境中富含纤维素
8、的环境中操作步骤操作步骤生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。中获得目的微生物的几率要高于普通环境。原因原因第十一页，本课件共有34页实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。累的枯枝败叶等。讨论讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋
9、在土壤中多深？纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm10cm左右的左右的土壤中。土壤中。第十二页，本课件共有34页2 2、选择培养、选择培养 增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。中分离所需要的微生物。目的：目的：制备选择培养基：制备选择培养基：操作：操作：将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶选择培养基的锥形瓶中
10、，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。选择培养。第十三页，本课件共有34页培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质纤维素粉纤维素粉5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO31g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl0.5gNa2HPO47H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO47H2O0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏0.5g生长因子、碳源、氮源生长因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至
11、溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水第十四页，本课件共有34页提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄或者将纤维素改为葡萄糖。糖。A A A A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B B B B、这个培
12、养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？进行选择的？进行选择的？进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。解纤维素的微生物可以大量繁殖。C C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用第十五页，本课件共有34页 说明：说明：分析分析“纤维素分解菌的选择培养基纤维素分解菌的选
13、择培养基配方配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。第十六页，本课件共有34页在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够适应适应这这种营养条件的微生物得到种营养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那些，而那些不适不适应应这种营养条件的微生物的繁殖被这种营养条件的微生物的繁殖被抑制抑制，因
14、此可，因此可以起到以起到“浓缩浓缩”的作用。的作用。为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？第十七页，本课件共有34页比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养第十八页，本课件共有34页思考：本实验
15、的流程与课题思考：本实验的流程与课题2 2中的实验流程有哪些中的实验流程有哪些异同？异同？本实验流程与课题本实验流程与课题2 2的流程的区别如下。课题的流程的区别如下。课题2 2是将土样制成的菌悬液直接涂布在是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课得到菌落。本课题通过题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。一致。第十九页，本课件共有34页按照课题按照课题1 1的稀释操作方法，将选择培养
16、后的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释10101 110107 7倍。倍。3.3.梯度稀释梯度稀释101102103104105106第二十页，本课件共有34页4.4.将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养的培养基上基上（1 1）制备鉴别培养基）制备鉴别培养基:（2 2）涂布平板：）涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml0.1ml涂涂布到平板培养基上，布到平板培养基上，3030倒置培养。倒置培养。第二十一页，本课件共有34页培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC
17、-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)第二十二页，本课件共有34页方法一：先方法一：先 ，再加入刚果红进，再加入刚果红进行颜色反应。行颜色反应。方法二：在方法二：在 时就加入刚果红。时就加入刚果红。培养微生物培养微生物倒平板倒平板5.刚果红染色法刚
18、果红染色法挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。纤维素的菌落。第二十三页，本课件共有34页这两种方法各有哪些优点与不足？这两种方法各有哪些优点与不足？染色法染色法优优点点缺点缺点方法一方法一方法二方法二颜色反应基本颜色反应基本上是纤维素分上是纤维素分解菌的作用解菌的作用操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混刚果红会使菌落之间发生混杂杂操作简便不存操作简便不存在菌落混杂问在菌落混杂问题题1.1.产生淀粉酶的微生物也产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈产生模糊透明圈2.2.有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。形成明显的透明圈。第
19、二十四页，本课件共有34页比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化
20、分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法第二十五页，本课件共有34页方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考：漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，出现的透明圈不
21、够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！透明圈当然分解纤维素的能就强！第二十六页，本课件共有34页 在在产生明显的透明圈产生明显的透明圈的菌落，挑取并的菌落，挑取并接种
22、到纤维素分解菌的选择培养基上，接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在在30300 0C C 37 370 0C C培养，可获得培养，可获得纯化培养纯化培养。6 6、纯化培养、纯化培养第二十七页，本课件共有34页四、结果分析与评价四、结果分析与评价1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落菌落对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。2.2.
23、分离的结果是否一致分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。的分离结果。第二十八页，本课件共有34页 为了确定分离得到的是纤维素分解菌，为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行还需要进行_实验，纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。纤发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素酶
24、测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 葡萄糖葡萄糖 五、课题延伸五、课题延伸第二十九页，本课件共有34页分解分解纤纤维素的维素的微生物微生物的分离的分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结第三十页，本
25、课件共有34页 采用新鲜牛肉经剔除脂肪、消化、过滤、浓采用新鲜牛肉经剔除脂肪、消化、过滤、浓缩得到的一种棕黄色至棕褐色膏状物。有牛肉自缩得到的一种棕黄色至棕褐色膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。广泛应用于生物制药发酵及素类的水溶性物质。广泛应用于生物制药发酵及各种培养基的制备。各种培养基的制备。在当中它起的主要作用是补充蛋白胨以及其在当中它起的主要作用是补充蛋白胨以及其
26、它氮源的营养不足。一般的用量为它氮源的营养不足。一般的用量为0.3%0.3%0.5%0.5%。1 1、牛肉膏、牛肉膏第三十一页，本课件共有34页 是微生物培养基的主要基础成分，蛋白是微生物培养基的主要基础成分，蛋白胨是由蛋白质经酶、酸、碱水解而获得的一胨是由蛋白质经酶、酸、碱水解而获得的一种胨、肽、氨基酸组成的水溶性混合物。主种胨、肽、氨基酸组成的水溶性混合物。主要作用提供氮源要作用提供氮源,除此处，还可以提供除此处，还可以提供C C源和源和生长因子。其来源由：动物组织蛋白、植物生长因子。其来源由：动物组织蛋白、植物组织蛋白、微生物蛋白质。组织蛋白、微生物蛋白质。2 2、蛋白胨、蛋白胨第三十二
27、页，本课件共有34页 酵母膏实际上是膏状的酵母抽提物，酵母抽酵母膏实际上是膏状的酵母抽提物，酵母抽提物是国家行业标准的规定名称。提物是国家行业标准的规定名称。酵母抽提物以酵母为原料，采用自溶法或加酵母抽提物以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色（或精制浓缩、喷酶水解法工艺，经分离、脱色（或精制浓缩、喷雾干燥）而成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细雾干燥）而成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的产品。包含粉状、与膏状的产品。胞水溶性成分的产品。包含粉状、与膏状的产品。酵母膏可以有食品调味与生物发酵培养基两酵母膏可以有食品调味与生物发酵培养基两大类用途。在生物发酵行业应用还有一种习惯叫大类用途。在生物发酵行业应用还有一种习惯叫法是酵母浸膏。法是酵母浸膏。3 3、酵母膏、酵母膏第三十三页，本课件共有34页感谢大家观看10.12.2022第三十四页，本课件共有34页