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1、关于病毒感染的分子诊断2022/12/8第一页，本课件共有52页病毒感染的分子诊断利用分子生物学方法对病毒进行检测分子生物学方法包括核酸扩增、核酸杂交、等温反应、质谱、普通测序、二代测序等检测对象主要是病毒核酸第二页，本课件共有52页病毒感染的核酸检测普通PCR、real-timePCR、巢式PCR、多重PCRFISH一代测序高通量测序第三页，本课件共有52页PCRKary B.MullisUSA 美国教授KaryB.Mullis于1983年发明了PCR技术，他因此获得了1993年诺贝尔奖 第四页，本课件共有52页PCR第五页，本课件共有52页PCR优缺点及应用优点灵敏度高，特异性强操作简单设
2、备要求低缺点PCR产物分析较繁琐，容易出现人为判读错误只能进行定性检测，无法实现定量分析应用病毒鉴定联合测序用于病毒分型和病毒耐药突变位点分析第六页，本课件共有52页Real-timePCR第七页，本课件共有52页2022/12/8Real-timePCR第八页，本课件共有52页Real-timePCR的优缺点及应用优点灵敏度极高，特异性极强机器分析判读结果，减少人工判读失误可实现高通量检测缺点易出现污染，对人员操作要求高要求房间分区，对场地硬件条件要求较高不同种属病毒之间没有相似核酸序列，多种病毒同时检测较难实现应用几乎应用于所有病毒感染的检测，且在不同国家地区应用最为广泛第九页，本课件共有
3、52页诺如病毒荧光探针法检测试剂盒全国首家获批诺如病毒核酸检测试剂盒第十页，本课件共有52页诺如病毒核酸检测试剂盒（国械注准 20153400293）（核酸类国内空白）人鼻病毒核酸检测试剂盒（国械注准20153400295）（国内空白）人博卡病毒核酸检测试剂盒（国械注准20153400294）（国际空白）第十一页，本课件共有52页眼部病毒感染多重real-timePCR检测试剂盒一个反应管中可同时检测肠道病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒探针分别用FAM,HEX，CY3和CY5四种荧光标记的探针有内参，构建好了标准品，可进行绝对定量加入了UNG酶，可有效控制污染检出限可达1-10copiesml成本仅
4、为市售试剂盒的1/10效益成本比：TAKARARocheBio-RadThermo第十二页，本课件共有52页FluorescenceIn SituHybridization(FISH)Carlo Foresta et al.,PLOS ONE,2011Clare Connor,Nature,2008HPV感染第十三页，本课件共有52页FISH的优缺点及应用优点直接检测病变组织细胞标本，对疾病的诊断意义更大可检测病毒是否整合到人基因组缺点操作繁琐，对人员素质要求高需要单独的细胞培养间应用HPV,EBV,登革热病毒，HIV第十四页，本课件共有52页基于转录的扩增种酶：逆转录酶、酶和聚合酶条特别设计
5、的寡核苷酸引物恒温反应，不需要PCR仪能将病原体RNA扩增109倍，比常规PCR高个数量级第十五页，本课件共有52页基于转录的扩增的优缺点及应用优点扩增时间短，恒温反应条件，不需要PCR仪在等温条件下，快速降解的RNA可极大减少扩增过程中污染的可能性缺点缺点是不能用于DNA病毒的检测以及多种酶混合体系的不稳定性应用在临床上应用于HCV、HIV、肠道病毒和呼吸道RNA病毒的检测第十六页，本课件共有52页loop-mediatedisothermalamplification（LAMP）第十七页，本课件共有52页LAMP的优缺点及应用优点等温扩增，不需PCR仪，可实现床旁或野外环境灵敏度和特异性均
6、较高缺点引物设计极为复杂，研发门槛高，获批检测试剂盒少应用目前仅结核分枝杆菌获得CFDA认证，病毒检测尚处于研发阶段第十八页，本课件共有52页数字PCR第十九页，本课件共有52页数字PCR的优缺点及应用优点无需标准品，可直接进行绝对定量对标本中的抑制剂有较高耐受性为跨实验室比较提供绝对参照标准缺点样品分散技术的稳定性有待提高，且成本较高通量较低，目前通常能检测的信号为FAM和VIC应用目前仅用于科研，但在临床病毒检测和定量方面极具应用前景第二十页，本课件共有52页Sanger测序第二十一页，本课件共有52页Sanger测序的优缺点及应用优点能对病毒进行分型、突变分析为病毒的传播路径等流行病学提
7、供信息缺点通量低，一个反应体系只能分析一种病毒应用HBV、HCV、HIV、HSV、CMV、VZV、EBV、流感病毒等的抗病毒药物适用性分析第二十二页，本课件共有52页深度测序第二十三页，本课件共有52页深度测序的优缺点及应用优点不需要对标本中的病毒有预期判断，可以发现新发病毒感染通量高，可检测到标本中含量少的病毒对于无菌体液中发现的病毒诊断价值高缺点海量数据，分析有难度部分标本中发现的病毒不一定与疾病相关应用重症感染及新发突发传染病疫情，比如埃博拉病毒，寨卡病毒，H7N9均是通过深度测序被诊断发现第二十四页，本课件共有52页法国梅里埃公司FilmArray病原体全自动多重real-timePC
8、R检测系统第二十五页，本课件共有52页终点熔解曲线分析终点熔解曲线分析法国梅里埃公司FilmArray病原体全自动多重real-timePCR技术原理第二十六页，本课件共有52页FilmArray呼吸道病原体检测组套美国FDA认证一个反应板能能同时检测呼吸道相关的17种病毒和3种细菌仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作1小时出结果但费用高昂病毒：病毒：腺病毒冠状病毒229E冠状病毒HKU1冠状病毒OC43冠状病毒NL63人偏肺病毒人鼻病毒/肠道病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亚型甲型流感病毒H1-2009亚型甲型流感病毒H3亚型乙型流感病毒副流感病
9、毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒细菌：细菌：百日咳杆菌肺炎支原体肺炎衣原体第二十七页，本课件共有52页FilmArray腹泻病原体检测组套美国FDA认证一个反应板能能同时检测腹泻相关的5种病毒，6种细菌，6种致泻性大肠杆菌和4种寄生虫仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作1小时出结果但费用高昂细菌：细菌：弯曲杆菌艰难梭菌类志贺邻单胞菌沙门氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌弧菌病毒：病毒：腺病毒F40/F41亚型星状病毒诺如病毒GI/GII亚型轮状病毒札如病毒致泻性大肠杆菌：致泻性大肠杆菌：EAECEPECETECSTECO157E
10、IEC寄生虫：寄生虫：隐孢子虫环孢子虫溶组织内阿米巴兰氏贾第鞭毛虫第二十八页，本课件共有52页FilmArray脑炎脑膜炎病原体检测组套美国FDA认证一个反应板能能同时检测腹泻相关的7种病毒，6种细菌，1种真菌仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作1小时出结果但费用高昂真菌：真菌：隐球菌/新型隐球菌病毒：病毒：巨细胞病毒肠道病毒单纯疱疹病毒1型单纯疱疹病毒2型人疱疹病毒6型人细小病毒水痘带状疱疹病毒细菌：细菌：大肠杆菌K1流感嗜血杆菌产单核细胞李斯特菌脑膜炎奈瑟氏菌无乳链球菌肺炎链球菌第二十九页，本课件共有52页美国Luminex公司xTAG多重PC
11、R微球探针检测系统20 mins1 hr2.5 hrs45 mins第三十页，本课件共有52页美国Luminex公司xTAG多重PCR微球探针检测技术原理病毒核酸提取病毒核酸提取第三十一页，本课件共有52页美国Luminex公司xTAG多重PCR微球探针检测技术原理Multiplex RT-PCR using target-specific TAGged primers&biotinylated primersGGCTA CCGATTAG 135BBds biotinylated,TAGged TS-PCR productCCGATGGCTA3TAG 15GGCTATAG 1CCGAT3TAG
12、 25B5TARGET PRESENTTARGET ABSENT病毒核酸扩增病毒核酸扩增第三十二页，本课件共有52页TAGged products are capturedby their complementary Anti-TAG sequenceStreptavidin-phycoerythrin reporter(SA-PE)molecule used to detect biotinylated primerUniversal array made up of different bead populations with SA-PE reporter presentAnti-TAG
13、 2TAG 2Anti-TAG 1BPERegion 29SATAG 1Region 34美国Luminex公司xTAG多重PCR微球探针检测技术原理扩增的病毒核酸与固扩增的病毒核酸与固定有特异性探针的纳定有特异性探针的纳米微球杂交并检测米微球杂交并检测第三十三页，本课件共有52页美国Luminex公司xTAG多重PCR微球探针检测技术原理Luminex 100/200 xMAP Technology based on flow cytometryRed Laser&APDs:classify anti-TAG coupled beadsGreen Laser&PMT:quantifies r
14、eporter,representing specific hybridization eventsMAGPIXxMAP Technology using LEDs and CCDRed LED&CCD camera:classify anti-TAG coupled beadsGreen LED&CCD camera:quantifies reporter,representing specific hybridization eventsRead on Luminex 200 or MAGPIX 信号数据获取并信号数据获取并分析分析第三十四页，本课件共有52页美国FDA认证一个反应板能能同
15、时检测呼吸道相关的19种病毒，3种细菌需要进行病原体核酸提取、PCR、杂交和结果判断需要手工加样、扩增产物的人工转移5小时出结果费用相对Flimarray较为经济细菌：细菌：肺炎衣原体肺炎衣原体军团菌病毒：病毒：腺病毒冠状病毒229E冠状病毒HKU1冠状病毒OC43冠状病毒NL63人博卡病毒人偏肺病毒人鼻病毒/肠道病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亚型甲型流感病毒H1-2009亚型甲型流感病毒H3亚型乙型流感病毒副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒A型呼吸道合胞病毒B型xTAG呼吸道病原体检测组套第三十五页，本课件共有52页美国FDA认证一个反应板能能同时检测腹
16、泻相关的3种病毒，6种细菌，3种致泻性大肠杆菌和3种寄生虫需要进行病原体核酸提取、PCR、杂交和结果判断需要手工加样、扩增产物的人工转移5小时出结果费用相对Flimarray较为经济细菌：细菌：弯曲杆菌艰难梭菌志贺菌沙门氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌霍乱弧菌病毒：病毒：腺病毒F40/F41亚型诺如病毒GI/GII亚型轮状病毒A型致泻性大肠杆菌：致泻性大肠杆菌：ETECO157EIEC寄生虫：寄生虫：隐孢子虫溶组织内阿米巴兰氏贾第鞭毛虫xTAG腹泻病原体检测组套第三十六页，本课件共有52页美国赛沛公司的Xpert病原体全自动real-time检测系统1混合2加入3插入4检测第三十七页，本课件共有52页
17、美国赛沛公司的Xpert病原体全自动real-time检测技术原理高度集成化、自动高度集成化、自动化化在一个反应杯里实现在一个反应杯里实现了标本病原体核酸的了标本病原体核酸的提取、提取、PCR、检测、检测和数据分析和数据分析第三十八页，本课件共有52页Xpert病原体检测项目美国FDA认证一个反应管仅能检测1-2种病原体仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作1-2小时出结果可检测的病毒：可检测的病毒：甲型流感病毒乙型流感病毒呼吸道合胞病毒肠道病毒HIV-1病毒载量定量HCV病毒载量定量诺如病毒人乳头瘤病毒埃博拉病毒可检测的细菌：可检测的细菌：艰难梭菌
18、MRSACRE第三十九页，本课件共有52页美国GeneMark公司eSensor探针-传感器分子检测系统多重RT-PCR之后用探针杂交再用伏安法电子传感器检测探针并分析信号第四十页，本课件共有52页eSensor呼吸道病毒检测组套美国FDA认证能同时检测8种呼吸道病毒腺病毒：B,C和E组冠状病毒：229E,HKU1,OC43和NL63型甲型流感病毒：检测并分型乙型流感病毒人偏肺病毒副流感病毒：1,2,3和4型呼吸道合胞病毒：A和B组人鼻病毒需要进行病原体核酸提取、PCR、杂交和结果判断需要手工或机器提取核酸、扩增产物的人工转移4-5小时出结果第四十一页，本课件共有52页美国雅培公司Plex-i
19、dPCR-质谱串联分子检测系统多重RT-PCR利用电喷雾电离质谱分析产物第四十二页，本课件共有52页美国FDA认证同时检测influenzaA和Bvirus需要进行病原体核酸提取、多重PCR、质谱分析6-8小时出结果Plex-id流感病毒检测试剂盒第四十三页，本课件共有52页传染病长效防控能力的提升和网络实验室持续竞争力的增强十一五十二五十三五在“十一五”、“十二五”基础上，进一步完善监测技术体系，大幅推动监测技术普及下沉，全面提升病原发现鉴定能力和新发传染病的识别能力。最终提高对传染病暴发疫情监测预警的敏感度和有效应对国内外重大传染病疫情的处置能力。较为完善的监测技术体系和质控管理体系较为丰
20、富的重大疫情监测实战经验较为高效的检测技术平台运转和团队协作机制国家科技重大专项牵头建设单位第四十四页，本课件共有52页常规监测从30种扩大为98种全覆盖覆盖样本数15000份症候群症候群检测病原体检测病原体病毒病毒细菌细菌寄生虫寄生虫发热呼吸道发热呼吸道（2323种）种）11种种12种种流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒、鼻病毒、MERS、H7N9、H5N1金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、A组乙型链球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、军团菌、结核分枝杆菌、卡他莫拉汉菌、鲍曼不动杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体腹泻腹泻（2222种）种）5种种1
21、3种种3种种轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒致泻性大肠埃希菌（内含5个种）、非伤寒沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、嗜水气邻单胞菌、类志贺邻单胞菌、拟态弧菌、河弧菌阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫病发热伴出疹发热伴出疹（1515种）种）9种种6种种肠道病毒（EV71，CA16，CA10，CA6）、麻疹病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、人类小DNA病毒B19、EB病毒、人类疱疹病毒6型、埃博拉病毒伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、A组链球菌、炭疽、伯氏疏螺旋体、立克次体（内含多个种）发热伴出血发热伴出血（111
22、1种）种）5种种6种种汉坦病毒、登革病毒、新疆出血热病毒、新布尼亚病毒、埃博拉病毒鼠疫耶尔森菌、猪链球菌、钩端螺旋体、立克次体（内含多个种）、无形体（内含多个种）、埃立克体（内含多个种）脑炎脑膜炎脑炎脑膜炎（2727种）种）10种种8种种9种种寨卡、乙脑、腮腺炎、肠道病毒、单纯疱疹、脊髓灰质炎、麻疹、呼吸道合胞病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒脑膜炎奈瑟菌、b型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、B族链球菌、单增李斯特菌恶性疟原虫、弓形虫、带绦虫、新型隐球菌、肺吸虫、并殖吸虫、旋毛虫、广州管圆线虫、裂头蚴第四十五页，本课件共有52页扩大病原体监测范围五大症候群扩大监测范围
23、病原体病原体名称病原体名称导致疾病导致疾病EVD68发热呼吸系统疾病双埃可病毒发热呼吸系统疾病、腹泻、脑炎脑膜炎淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒病脑炎脑膜炎H10N8发热呼吸系统疾病基孔肯亚病毒发热伴出疹疾病尼帕病毒发热呼吸系统疾病、脑炎脑膜炎墨累谷脑炎病毒脑炎脑膜炎第四十六页，本课件共有52页病原体变异变迁研究综合利用三个五年计划的数据，深度解析中部地区重要病原进化变异与疫情暴发和临床重症发病之间的关系生物信息学分析方法体内体外评估技术环境因子分析对30种以上五大症候群传染病重要病原的变异变迁特征进行深入研究分子时钟进化基因重组重配核苷酸变异速率阴阳性选择突变多肽极性分析蛋白结构模拟毒力抗原性组织
24、细胞嗜性耐药性地域传播路径宿主传播链易感人群第四十七页，本课件共有52页病原体变异变迁研究对重要病原的重组株和变异株的流行特征、抗原性、复制力和环境抵抗力等特性进行密切跟踪，及时预警散发尤其是暴发疫情全基因水平扫描重要病原基因重组片断和重组断裂点重组变异的病毒蛋白预测分析优化重要病原的常见型别与未知型别的分步筛查流程MEGASimplotGARDProtScalPredict ProteinSwiss-Mode Workspace第四十八页，本课件共有52页筛查未知病原体聚焦可疑的病原体后再通过核酸检测、血清学检测和基因序列分析等方式进一步确认优势技术策略方案最终目标对常规筛查为“阴性”的新发
25、传染病标本中的所有微生物核酸进行深度测序MLST 技术PFGE 技术质谱技术二、三、四代测序技术“渐进互证式”测序策略确认真正的致病原 尝试分离这类病原第四十九页，本课件共有52页武汉国家生物安全实验室第五十页，本课件共有52页口岸-P4实验室-烈性传染病病原监测病原体名称病原体名称导致疾病导致疾病东方马脑炎病毒脑炎脑膜炎裂谷热病毒出血热、脑炎脑膜炎黄热病毒出血热、病毒学症、脑炎脑膜炎西尼罗病毒发热、脑炎脑膜炎克里米亚-刚果出血热病毒出血热、脑炎脑膜炎拉萨热病毒发热呼吸系统疾病、出血热、脑炎埃博拉病毒埃博拉出血热马尔堡病毒马尔堡出血热猿疱疹病毒发热出疹、脑炎脑膜炎马球波病毒出血热猴痘病毒发热伴出疹第五十一页，本课件共有52页现有研究工作基础及条件国家重点实验室1 病毒学国家重点实验室2 医学遗传学国家重点实验室生物安全3级实验室1 中国科学院武汉病毒所BSL-3实验室2 湖北省疾病预防控制中心BSL-3实验室3 武汉大学ABSL-3实验室生物安全4级实验室武汉国家生物安全实验室（配套有BSL-3等团簇平台）国家地方联合工程研究中心病毒病防治药物技术国家地方联合工程研究中心中国典型培养物保藏中心世界知识产权组织认定的国际保藏机构之一第五十二页，本课件共有52页