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1、关于植物总的提取与电泳第一页，本课件共有24页1.实验目的和要求实验目的和要求掌握掌握RNA制备以及常用鉴定方法的原理、制备以及常用鉴定方法的原理、操作步骤、注意事项和技术关键。操作步骤、注意事项和技术关键。第二页，本课件共有24页2.相关基础知识相关基础知识由于由于RNARNA是基因表达过程中非常重要的生物是基因表达过程中非常重要的生物分子，如分子，如mRNA,mRNA,它携带了它携带了DNADNA的全部编码信息。的全部编码信息。RNARNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。提取的在分子生物学中占有重要的地位。提取的mRNA
2、mRNA可用于可用于Northern blotNorthern blot、RT-PCRRT-PCR、构建、构建 cDNAcDNA文库、文库、Gene ChipsGene Chips以及体外翻译等实验。以及体外翻译等实验。第三页，本课件共有24页由于由于RNaseRNase极稳定，所以，在操作极稳定，所以，在操作RNARNA时，时，要格外仔细，以防要格外仔细，以防RNARNA被降解。在提取被降解。在提取RNARNA之之前，必须对所用器皿进行前，必须对所用器皿进行RNaseRNase灭活处理。灭活处理。如用如用180180o oC C干烤干烤8 8小时以上处理玻璃器皿，或小时以上处理玻璃器皿，或用
3、用0.10.1的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯(DEPC)(DEPC)的水溶液浸的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相关泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要用的缓冲液也需要用0.10.1 DEPCDEPC水处理，但水处理，但Tris-ClTris-Cl缓冲液等不可以用缓冲液等不可以用DEPCDEPC处理。处理。注意：注意：DEPCDEPC有致癌之嫌有致癌之嫌 ，必须小心操作，必须小心操作，防止接触与吸入防止接触与吸入 ！第四页，本课件共有24页植物细胞内的植物细胞内的RNA主要是主要是 rRNA（占（占8085）、）、tRNA及小分子及小分子RNA（占（占1015）和）和 mR
4、NA（占（占15）。）。rRNA含量最丰富，由含量最丰富，由25S、18S和和5S几类组成。几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在在3端都有端都有一个一个polyA尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷氧胸苷(OligodT)层析柱从总层析柱从总RNA中将中将 mRNA分分离出来。一般情况下，提取的总离出来。一般情况下，提取的总RNA也可用于也可用于Northern blot试验。试验。第五页，本课件共有24页第六页，本课件共有24页提取植物提取植物RNA时，要注意的问题：时，
5、要注意的问题：1）一般用机械研磨的方法破碎植物）一般用机械研磨的方法破碎植物 组织细胞；组织细胞；2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白 与与RNA分离并释放出分离并释放出RNA；3）抑制内源和外源）抑制内源和外源RNase活性；活性；4）将）将RNA与与DNA、蛋白质及其它细、蛋白质及其它细 胞成分分开。胞成分分开。第七页，本课件共有24页1.1.苯酚法：用苯酚法：用SDSSDS变性蛋白并抑制变性蛋白并抑制RNaseRNase活性，经活性，经多次酚多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用用NaACNaAC和乙醇沉淀和乙醇沉淀RNA
6、RNA；2.2.胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙巯基乙醇变性蛋白，并抑制醇变性蛋白，并抑制RNaseRNase的活性，经酚氯仿的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀；抽提后再沉淀；3.3.氯化锂沉淀法：因为锂在在一定氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pHpH下能使下能使RNARNA相对特异地沉淀，但容易使小分子相对特异地沉淀，但容易使小分子RNARNA损失，而损失，而且残留的锂离子对且残留的锂离子对mRNAmRNA有抑制作用。有抑制作用。已有多种较为成熟的分离总已有多种较为成熟的分离总RNARNA的方法，常用的方法，常用的有的有3 3种种:第八页，本课件共有24页本实验采用
7、本实验采用QIAGEN试剂盒，其原理是依据胍盐试剂盒，其原理是依据胍盐法。即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取液中法。即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取液中裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中含有裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中含有RNase抑制剂，抑制抑制剂，抑制RNase活性，保证活性，保证RNA的完整性。的完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留在柱子上，通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留在柱子上，溶液均质化，包括溶液均质化，包括RNA在内的分子物质通过离在内的分子物质通过离心柱。加入乙醇后，再过第二个离心柱，心柱。加入乙醇后，再过第二个离心柱，RN A就就结合在柱子底部有硅胶的膜上，洗去其它杂
8、质，结合在柱子底部有硅胶的膜上，洗去其它杂质，最后用无最后用无RNase的水溶出的水溶出RNA。该柱子可结合。该柱子可结合100 g大于大于200bp的的RNA，所以应控制起始材料的，所以应控制起始材料的用量。用量。第九页，本课件共有24页RNARNA的检测：的检测：RNARNA的的检检测测主主要要用用琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳，分分为为非非变变性性电电泳泳和和变变性性电电泳泳。一一般般变变性性电电泳泳用用的的最最多多是是甲甲醛醛变变性性电电泳泳（如如Northern Northern blot blot 实实验验过过程中）。程中）。第十页，本课件共有24页由于由于RNARNA分子是单链核酸
9、分子，它不同于分子是单链核酸分子，它不同于DNADNA的的双链分子结构，其自身可以回折形成发卡式二级结双链分子结构，其自身可以回折形成发卡式二级结构及更复杂的分子状态，以至通过一般传统的琼脂构及更复杂的分子状态，以至通过一般传统的琼脂塘凝胶电泳难以得到依赖于分子量的电泳分离条带，塘凝胶电泳难以得到依赖于分子量的电泳分离条带，为此电泳上样前将样品于为此电泳上样前将样品于6565摄氏度加热变性摄氏度加热变性5 5分分钟，使钟，使RNARNA分子的二级结构充分打开，并且在琼脂分子的二级结构充分打开，并且在琼脂糖凝胶中加入适量的甲醛，可保证糖凝胶中加入适量的甲醛，可保证RNARNA分子在电泳分子在电泳
10、过程中持续保持单链状态，因此，总过程中持续保持单链状态，因此，总RANRAN样品样品便在统一构像下得到了琼脂糖凝胶上的依赖于便在统一构像下得到了琼脂糖凝胶上的依赖于分子量的逐级分离条带。分子量的逐级分离条带。第十一页，本课件共有24页而且而且RNARNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜的结合。维素膜的结合。RNARNA通过甲醛变性琼脂糖凝通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，可以直观快捷的分析胶电泳，可以直观快捷的分析RNARNA质量之优质量之优劣，当有标准的劣，当有标准的“分子标尺分子标尺”（markermarker）存）存在时，还可相对客观的对总在时，还可相对客
11、观的对总RNARNA样品进行定样品进行定性和定量。性和定量。为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。像。第十二页，本课件共有24页3.实验材料与试剂实验材料与试剂材料：材料：新鲜植物组织新鲜植物组织（水稻）（水稻）试剂：试剂：Qiagen RNeasy植物试剂盒，甲醛，植物试剂盒，甲醛，琼脂糖电泳系统琼脂糖电泳系统，凝胶成象系统等。，凝胶成象系统等。第十三页，本课件共有24页4.实验方法和步骤实验方法和步骤第十四页，本课件共有24页第十五页，本课件共有24页实验步骤实验步骤 （每
12、一步均要求无（每一步均要求无RNaseRNase污染）污染）称取新鲜材料称取新鲜材料100 mg100 mg，液氮速冻；，液氮速冻；在预冷的研钵中并在液氮中将材料在预冷的研钵中并在液氮中将材料 研磨成细粉末，转移到研磨成细粉末，转移到2ml2ml或或1.5ml1.5ml 离心管中；离心管中；待液氮挥发（但不能解冻）后，加入待液氮挥发（但不能解冻）后，加入 450 l450 l提取缓冲液提取缓冲液RLTRLT，混匀后在，混匀后在 5656下温育下温育1 13min3min；第十六页，本课件共有24页 将裂解液加到离心柱（淡紫色）上将裂解液加到离心柱（淡紫色）上 下接一个下接一个2ml收集管，最大
13、转速离心收集管，最大转速离心 2min。裂解液通过柱子时被均质化。裂解液通过柱子时被均质化 小心吸取上清液，转移到另一新离小心吸取上清液，转移到另一新离 心管；心管；加入加入0.5倍体积（倍体积（225 l）96100%乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能 会出现沉淀，无影响；会出现沉淀，无影响；第十七页，本课件共有24页将混合液全部（包括沉淀将混合液全部（包括沉淀675 l675 l）转转移移到到吸吸附附离离心心柱柱（粉粉红红色色）内内，下下接接2 2 mlml的的收收集集管管，10000 10000 rpmrpm离离心心 1515秒。弃去管内液体；秒。弃去管内液
14、体；加加入入700l 700l RW1RW1缓缓冲冲液液，10000rpm10000rpm转转速下离心速下离心2525秒，弃去收集管；秒，弃去收集管；将将离离心心柱柱转转移移到到一一个个新新的的2ml2ml收收集集 管管上上，加加入入500l 500l RPERPE缓缓冲冲液液，10000 10000 rpmrpm离离心心1515秒秒，弃弃去去管管内内液液体体 重复使用收集管；重复使用收集管；第十八页，本课件共有24页加加入入500l RPE到到离离心心柱柱内内，最最大大转转速速离离心心2min，干燥离心柱，弃去收集管；，干燥离心柱，弃去收集管；把把离离心心柱柱接接在在一一个个新新的的1.5
15、ml Eppen管管上上，加加 入入3050l 无无RNase水水（0.1%DEPC处处理理），10000 rpm离离心心 1min，洗洗出出RNA。若若RNA产产量量在在20g以以上上，用用3050 l无无RNase水水再再洗洗脱脱1次次。RNA样品保存于样品保存于-20备用。备用。第十九页，本课件共有24页琼脂糖凝胶非变性电泳琼脂糖凝胶非变性电泳所需试剂：所需试剂：1010凝胶缓冲液凝胶缓冲液 吗啉代丙磺酸（吗啉代丙磺酸（MOPSMOPS）（）（pH 7.0pH 7.0）200mmol/L200mmol/L NaAC 50mmol/L NaAC 50mmol/L EDTA EDTA（pH
16、8.0pH 8.0）10mmol/L10mmol/L 用用DEPCDEPC水配制，用水配制，用NaOHNaOH调节调节pHpH7.07.0。过滤除菌。过滤除菌 后避光保存。后避光保存。1010电泳上样缓冲液电泳上样缓冲液 5050（V/VV/V）甘油（用）甘油（用DEPCDEPC处理的水稀释）处理的水稀释）10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA（pH8.0pH8.0）0.250.25（m/Vm/V）溴酚蓝）溴酚蓝 0.250.25（m/Vm/V）二甲苯青）二甲苯青FFFF第二十页，本课件共有24页1.1.凝胶制备（凝胶制备（1.21.2）：用）：用11凝胶缓冲液配制凝胶缓冲液配制
17、1.21.2的凝胶，至少使其凝固的凝胶，至少使其凝固3030分钟后进行上样；分钟后进行上样；2.2.样品制备：在离心管中，将样品制备：在离心管中，将RNARNA样品与样品与1010上样缓上样缓冲液以冲液以9:19:1比例混匀，迅速在冰上冷浴比例混匀，迅速在冰上冷浴5 5分钟，瞬分钟，瞬时离心数秒。时离心数秒。RNARNA上样量为上样量为2-302-30 g g，本次实验为，本次实验为1010 g g；3.3.上样前凝胶须预电泳上样前凝胶须预电泳5min5min，随后将样品加入加样孔，随后将样品加入加样孔，以以5V/cm5V/cm的电压电泳的电压电泳1h1h1.5h1.5h；4.4.待溴酚蓝迁移
18、至凝胶长度的待溴酚蓝迁移至凝胶长度的4/54/5处结束电泳。将凝胶处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液中染色约置于溴化乙锭溶液中染色约30min30min；5.5.在紫外灯下观察结果在紫外灯下观察结果(如果用于如果用于Northern blot,Northern blot,在在凝胶转膜前应做好移动距离的标记凝胶转膜前应做好移动距离的标记)。步骤：步骤：第二十一页，本课件共有24页琼脂糖凝胶甲醛变性电泳步骤：琼脂糖凝胶甲醛变性电泳步骤：1.1.制备凝胶制备凝胶(1.2(1.2)：称：称1.21.2克琼脂糖，加克琼脂糖，加72ml 72ml DEPCDEPC处理的水，加热溶化。冷却至处理的水，加热溶
19、化。冷却至6060o oC C，在，在通风厨内加入通风厨内加入1010凝胶缓冲液凝胶缓冲液10ml10ml，甲醛甲醛（3737）18ml18ml，混均后到入凝胶模具中。混均后到入凝胶模具中。2.2.样品制备：在离心管里，将样品制备：在离心管里，将RNARNA样品与样品与1010样品缓冲液以样品缓冲液以9 9：1 1比例混合。比例混合。6565o oC C温浴温浴5 51010分钟，分钟，迅速在冰上冷浴迅速在冰上冷浴5 5分钟，分钟，瞬时离心数秒。瞬时离心数秒。对于对于NorthernNorthern杂交实验，总杂交实验，总RNARNA上样量可达到上样量可达到10-3010-30 g g。第二十
20、二页，本课件共有24页3.3.上样前凝胶须预电泳上样前凝胶须预电泳5min5min，随后将样品加入，随后将样品加入上样孔。以上样孔。以5V/cm5V/cm的电压电泳的电压电泳1.5h-2.0h1.5h-2.0h。4.4.待溴酚蓝迁移至凝胶长度待溴酚蓝迁移至凝胶长度2/3-4/52/3-4/5处结束电处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液(0.5(0.5 g/mLg/mL，用用0.1mol/mL0.1mol/mL乙酸胺配制乙酸胺配制)中染色中染色30min30min。5.5.在紫外灯下观察结果。在紫外灯下观察结果。第二十三页，本课件共有24页感感谢谢大大家家观观看看第二十四页，本课件共有24页