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1、关于植物总的提取与电泳第1页，此课件共24页哦1.实验目的和要求实验目的和要求掌握掌握RNA制备以及常用鉴定方法的原理制备以及常用鉴定方法的原理、操作步骤、注意事项和技术关键。、操作步骤、注意事项和技术关键。第2页，此课件共24页哦2.相关基础知识相关基础知识由于由于RNARNA是基因表达过程中非常重要的生物是基因表达过程中非常重要的生物分子，如分子，如mRNA,mRNA,它携带了它携带了DNADNA的全部编码信息的全部编码信息。RNARNA的分离是研究基因功能的重要基础之的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。提一，在分子生物学中占有重要的地位。提取的取的mRNAm
2、RNA可用于可用于Northern blotNorthern blot、RT-PCRRT-PCR、构建构建 cDNAcDNA文库、文库、Gene ChipsGene Chips以及体外翻译等以及体外翻译等实验。实验。第3页，此课件共24页哦由于由于RNaseRNase极稳定，所以，在操作极稳定，所以，在操作RNARNA时，要格时，要格外仔细，以防外仔细，以防RNARNA被降解。在提取被降解。在提取RNARNA之前，必之前，必须对所用器皿进行须对所用器皿进行RNaseRNase灭活处理。如用灭活处理。如用180180o oC C干烤干烤8 8小时以上处理玻璃器皿，或用小时以上处理玻璃器皿，或用0
3、.10.1的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯(DEPC)(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要和其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要用用0.10.1 DEPCDEPC水处理，但水处理，但Tris-ClTris-Cl缓冲液等不缓冲液等不可以用可以用DEPCDEPC处理。处理。注意：注意：DEPCDEPC有致癌之嫌有致癌之嫌 ，必须小心操作，必须小心操作，防止接触与吸入防止接触与吸入 ！第4页，此课件共24页哦植物细胞内的植物细胞内的RNA主要是主要是 rRNA（占（占8085）、）、tRNA及小分子及小分子RNA（占（占1015）和）和 mRNA
4、（占（占15）。）。rRNA含量最丰富，由含量最丰富，由25S、18S和和5S几类几类组成。组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数基不等，但绝大多数mRNA在在3端都有一个端都有一个polyA尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)层析柱从总层析柱从总RNA中将中将 mRNA分离出来。分离出来。一般情况下，提取的总一般情况下，提取的总RNA也可用于也可用于Northern blot试验。试验。第5页，此课件共24页哦第6页，此课件共24页哦提取植物提取植物RNA时，要注意的问题：时，要注
5、意的问题：1）一般用机械研磨的方法破碎植物）一般用机械研磨的方法破碎植物 组织细胞；组织细胞；2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白 与与RNA分离并释放出分离并释放出RNA；3）抑制内源和外源）抑制内源和外源RNase活性；活性；4）将）将RNA与与DNA、蛋白质及其它细、蛋白质及其它细 胞成分分开。胞成分分开。第7页，此课件共24页哦苯酚法：用苯酚法：用SDSSDS变性蛋白并抑制变性蛋白并抑制RNaseRNase活性，经多活性，经多次酚次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaACNaAC和乙醇沉淀和乙醇沉淀RNARNA；胍盐
6、法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙醇变性巯基乙醇变性蛋白，并抑制蛋白，并抑制RNaseRNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀；氯化锂沉淀法：因为锂在在一定氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pHpH下能使下能使RNARNA相对相对特异地沉淀，但容易使小分子特异地沉淀，但容易使小分子RNARNA损失，而且残留损失，而且残留的锂离子对的锂离子对mRNAmRNA有抑制作用。有抑制作用。已有多种较为成熟的分离总已有多种较为成熟的分离总RNARNA的方法，常用的方法，常用的有的有3 3种种:第8页，此课件共24页哦本实验采用本实验采用QIAGEN试剂盒，
7、其原理是依据胍盐法。试剂盒，其原理是依据胍盐法。即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取液中裂解植物组即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取液中裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中含有织粉末，在提取缓冲液中含有RNase抑制剂，抑制抑制剂，抑制RNase活性，保证活性，保证RNA的完整性。通过第一次离心的完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留在柱子上，溶液均质化，包括柱时细胞碎片被阻留在柱子上，溶液均质化，包括RNA在内的分子物质通过离心柱。加入乙醇后，再过第在内的分子物质通过离心柱。加入乙醇后，再过第二个离心柱，二个离心柱，RN A就结合在柱子底部有硅胶的膜上，就结合在柱子底部有硅胶的膜上，洗去其它杂质
8、，最后用无洗去其它杂质，最后用无RNase的水溶出的水溶出RNA。该柱。该柱子可结合子可结合100 g大于大于200bp的的RNA，所以应控制起始材，所以应控制起始材料的用量。料的用量。第9页，此课件共24页哦RNARNA的检测：的检测：RNARNA的检测主要用琼脂糖凝胶电泳，分为非变性的检测主要用琼脂糖凝胶电泳，分为非变性电泳和变性电泳。一般变性电泳用的最多是甲醛电泳和变性电泳。一般变性电泳用的最多是甲醛变性电泳（如变性电泳（如Northern blot Northern blot 实验过程中）。实验过程中）。第10页，此课件共24页哦由于由于RNARNA分子是单链核酸分子，它不同于分子是单
9、链核酸分子，它不同于DNADNA的双的双链分子结构，其自身可以回折形成发卡式二级链分子结构，其自身可以回折形成发卡式二级结构及更复杂的分子状态，以至通过一般传统结构及更复杂的分子状态，以至通过一般传统的琼脂塘凝胶电泳难以得到依赖于分子量的电的琼脂塘凝胶电泳难以得到依赖于分子量的电泳分离条带，为此电泳上样前将样品于泳分离条带，为此电泳上样前将样品于6565摄氏度摄氏度加热变性加热变性5 5分钟，使分钟，使RNARNA分子的二级结构充分打开分子的二级结构充分打开，并且在琼脂糖凝胶中加入适量的甲醛，可保，并且在琼脂糖凝胶中加入适量的甲醛，可保证证RNARNA分子在电泳过程中持续保持单链状态，因此，分
10、子在电泳过程中持续保持单链状态，因此，总总RANRAN样品便在统一构像下得到了琼脂糖凝胶上的样品便在统一构像下得到了琼脂糖凝胶上的依赖于分子量的逐级分离条带。依赖于分子量的逐级分离条带。第11页，此课件共24页哦而且而且RNARNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜的结合。素膜的结合。RNARNA通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，可以直观快捷的分析，可以直观快捷的分析RNARNA质量之优劣，当有标质量之优劣，当有标准的准的“分子标尺分子标尺”（markermarker）存在时，还可）存在时，还可相对客观的对总相对客观的对总RNARNA样
11、品进行定性和定量。样品进行定性和定量。为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。第12页，此课件共24页哦3.实验材料与试剂实验材料与试剂材料：材料：新鲜植物组织新鲜植物组织（水稻）（水稻）试剂：试剂：Qiagen RNeasy植物试剂盒，甲醛植物试剂盒，甲醛，琼脂糖电泳系统，琼脂糖电泳系统，凝胶成象系统等。，凝胶成象系统等。第13页，此课件共24页哦4.实验方法和步骤实验方法和步骤第14页，此课件共24页哦第15页，此课件共24页哦实验步骤实验步骤 （每一步均要求无（每一步均
12、要求无RNaseRNase污染）污染）称取新鲜材料称取新鲜材料100 mg100 mg，液氮速冻；，液氮速冻；在预冷的研钵中并在液氮中将材料在预冷的研钵中并在液氮中将材料 研磨成细粉末，转移到研磨成细粉末，转移到2ml2ml或或1.5ml1.5ml 离心管中；离心管中；待液氮挥发（但不能解冻）后，加入待液氮挥发（但不能解冻）后，加入 450 l450 l提取缓冲液提取缓冲液RLTRLT，混匀后在，混匀后在 5656下温育下温育1 13min3min；第16页，此课件共24页哦 将裂解液加到离心柱（淡紫色）上将裂解液加到离心柱（淡紫色）上 下接一个下接一个2ml收集管，最大转速离心收集管，最大转
13、速离心 2min。裂解液通过柱子时被均质化。裂解液通过柱子时被均质化 小心吸取上清液，转移到另一新离小心吸取上清液，转移到另一新离 心管；心管；加入加入0.5倍体积（倍体积（225 l）96100%乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能 会出现沉淀，无影响；会出现沉淀，无影响；第17页，此课件共24页哦将混合液全部（包括沉淀将混合液全部（包括沉淀675 l675 l）转移到吸附离心柱（粉红色）内，转移到吸附离心柱（粉红色）内，下接下接2 ml2 ml的收集管，的收集管，10000 rpm10000 rpm离心离心 1515秒。弃去管内液体；秒。弃去管内液体；加入加入7
14、00l RW1700l RW1缓冲液，缓冲液，10000rpm10000rpm转速转速下离心下离心2525秒，弃去收集管；秒，弃去收集管；将离心柱转移到一个新的将离心柱转移到一个新的2ml2ml收集收集 管管上，加入上，加入500l RPE500l RPE缓冲液，缓冲液，10000 10000 rpmrpm离心离心1515秒，弃去管内液体秒，弃去管内液体 重复使用重复使用收集管；收集管；第18页，此课件共24页哦加入加入500l RPE到离心柱内，最大转速离心到离心柱内，最大转速离心2min，干燥离心柱，弃去收集管；，干燥离心柱，弃去收集管；把离心柱接在一个新的把离心柱接在一个新的1.5 ml
15、 Eppen管上管上，加入，加入3050l 无无RNase水（水（0.1%DEPC处理），处理），10000 rpm离心离心 1min，洗出，洗出RNA。若。若RNA产量在产量在20g以上，用以上，用3050 l无无RNase水再洗脱水再洗脱1次。次。RNA样品保存于样品保存于-20备用。备用。第19页，此课件共24页哦琼脂糖凝胶非变性电泳琼脂糖凝胶非变性电泳 所需试剂：所需试剂：1010凝胶缓冲液凝胶缓冲液 吗啉代丙磺酸（吗啉代丙磺酸（MOPSMOPS）（）（pH 7.0pH 7.0）200mmol/L200mmol/L NaAC 50mmol/L NaAC 50mmol/L EDTA ED
16、TA（pH 8.0pH 8.0）10mmol/L10mmol/L 用用DEPCDEPC水配制，用水配制，用NaOHNaOH调节调节pHpH7.07.0。过滤除菌。过滤除菌 后避光保存。后避光保存。1010电泳上样缓冲液电泳上样缓冲液 5050（V/VV/V）甘油（用）甘油（用DEPCDEPC处理的水稀释）处理的水稀释）10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA（pH8.0pH8.0）0.250.25（m/Vm/V）溴酚蓝）溴酚蓝 0.250.25（m/Vm/V）二甲苯青）二甲苯青FFFF第20页，此课件共24页哦凝胶制备（凝胶制备（1.21.2）：用）：用11凝胶缓冲液配制凝胶缓冲液
17、配制1.21.2的的凝胶，至少使其凝固凝胶，至少使其凝固3030分钟后进行上样；分钟后进行上样；样品制备：在离心管中，将样品制备：在离心管中，将RNARNA样品与样品与1010上样缓冲上样缓冲液以液以9:19:1比例混匀，迅速在冰上冷浴比例混匀，迅速在冰上冷浴5 5分钟，瞬时离心分钟，瞬时离心数秒。数秒。RNARNA上样量为上样量为2-302-30 g g，本次实验为，本次实验为1010 g g；上样前凝胶须预电泳上样前凝胶须预电泳5min5min，随后将样品加入加样孔，随后将样品加入加样孔，以以5V/cm5V/cm的电压电泳的电压电泳1h1h1.5h1.5h；待溴酚蓝迁移至凝胶长度的待溴酚蓝
18、迁移至凝胶长度的4/54/5处结束电泳。将凝胶置处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液中染色约于溴化乙锭溶液中染色约30min30min；在紫外灯下观察结果在紫外灯下观察结果(如果用于如果用于Northern blot,Northern blot,在凝在凝胶转膜前应做好移动距离的标记胶转膜前应做好移动距离的标记)。步骤：步骤：第21页，此课件共24页哦琼脂糖凝胶甲醛变性电泳步骤：琼脂糖凝胶甲醛变性电泳步骤：制备凝胶制备凝胶(1.2(1.2)：称：称1.21.2克琼脂糖，加克琼脂糖，加72ml 72ml DEPCDEPC处理的水，加热溶化。冷却至处理的水，加热溶化。冷却至6060o oC C，在通风
19、，在通风厨内加入厨内加入1010凝胶缓冲液凝胶缓冲液10ml10ml，甲醛（甲醛（3737）18ml18ml，混均后到入凝胶模具中。混均后到入凝胶模具中。1.1.样品制备：在离心管里，将样品制备：在离心管里，将RNARNA样品与样品与1010样样品缓冲液以品缓冲液以9 9：1 1比例混合。比例混合。6565o oC C温浴温浴5 51010分分钟，钟，迅速在冰上冷浴迅速在冰上冷浴5 5分钟，分钟，瞬时离心数瞬时离心数秒。对于秒。对于NorthernNorthern杂交实验，总杂交实验，总RNARNA上样量上样量可达到可达到10-3010-30 g g。第22页，此课件共24页哦上样前凝胶须预电泳上样前凝胶须预电泳5min5min，随后将样品加入，随后将样品加入上样孔。以上样孔。以5V/cm5V/cm的电压电泳的电压电泳1.5h-2.0h1.5h-2.0h。待溴酚蓝迁移至凝胶长度待溴酚蓝迁移至凝胶长度2/3-4/52/3-4/5处结束电泳处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液。将凝胶置于溴化乙锭溶液(0.5(0.5 g/mLg/mL，用，用0.1mol/mL0.1mol/mL乙酸胺配制乙酸胺配制)中染色中染色30min30min。在紫外灯下观察结果。在紫外灯下观察结果。第23页，此课件共24页哦感谢大家观看感谢大家观看第24页，此课件共24页哦