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1、第八章第八章 植物磷素营养代谢分子生理植物磷素营养代谢分子生理意义：磷是植物生长发育不可缺少的大量营养元素之一，是植物的重要组成部分，同时又以多种方式参与植物体内各种生理生化过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢起重要作用。1、我国农田中有2/3严重缺磷。原因：被酸性土壤中的铁铝氧化物及石灰性土壤中的碳酸钙化合物固定，成为难被利用的固态磷。如石灰性土壤中磷肥当季利用率一般只有10左右。-土壤磷的有效性缺乏。实际上，酸性红黄壤与石灰性土壤中总磷一般比有效磷高几百倍。2、土壤中的总磷很低土壤学缺磷（本质缺磷）。Symptoms of Phosphorus Deficiency and over-us
2、eSymptoms of Phosphorus Deficiency The plant will be short when phosphorus deficiency,and stem is thin.the development of root is not better.And leaves appear dark green or gray,lackluster.And purple appears.The symptom extends from old leaves to tenders.The fruit and seed of plant Phosphorus defici
3、ency are small and less,which decrease productivity and quality.NPKCitrus QualityLow P mis-shapen fruit coarse rind open centres low juice(acid)Low N thin skin(desirable)low yieldHigh N thick skin less juice(acid)自左至右，依次为油菜幼叶至老叶，缺磷油菜叶片从暗紫发展至紫红色。tender oldPhosphorus DeficiencyLeaves of rape appear am
4、aranth because of accumulating carbohydrate in plant.Leaves of soybean appear amaranth because of accumulating carbohydrate in plant.P normal DeficiencyRicePurple leaves of phosphorus deficient maizePurple leaves,Low fruit,thin stem and drawf plant11植物的磷素营养植物的磷素营养一、植物体内磷的含量分布和形态一、植物体内磷的含量分布和形态1、存在的形
5、态有机磷：85左右，如核酸、磷脂和植素等无机磷：15左右，如以钙、镁和钾等的磷酸盐形态存在。2、分布植物的全磷含量一般为其干物质重的0.05-0.5，多分布在生长旺盛的器官和部位。如芽、根的生长点，随生长中心的转移而转移。有明显顶端优势，在生殖生长阶段，多向种子和果实运输。如：三叶草50%磷在细胞质中，21%在细胞核，19%在质体中，线粒体中占10%左右。3、磷的吸收形态（1）正磷酸：H2PO4-，HPO42-，和PO43-（以H2PO4-O4为主（2）偏磷酸：PO3-（3）焦磷酸：P2O74-，焦磷酸盐水解后被吸收。（4）有机磷化合物：已糖磷酸酯、甘油磷酸酯、蔗糖磷酸酯、核酸、卵磷脂，且吸收
6、速度超过无机磷酸盐。4、磷吸收的部位根毛和表皮细胞吸收的磷，经皮层进入体内代谢。最先合成的有机磷是ATP，此外还合成6磷酸果糖（F6P），1,6二磷酸果糖（FDP）和磷酸甘油酸(pGA)等。糖酵解中的含磷化合物。（内皮层）。合成的有机磷迅速向中柱转移。皮层中柱，主要含磷化合物是6磷酸葡萄糖，无机磷占总磷量的60%以上。中柱导管，有机磷通过脱磷酸化过程而形成无机磷，然后输送到地上部。磷从皮层经中柱进导管运输到地上部，请问顶端生长点细胞分裂所需的P是如何得到的？是以什么形态的P运输的？二、植物磷素营养的生理功能植物磷素营养的生理功能1、P是植物体内一系列重要物质的组成成分核酸、磷脂、植素、ATP含
7、P的酶和蛋白质。2、磷参与光合作用各碳水化合物的合成与运转光合作用：固定CO2植物合成的碳水化合物种类及运输形式蔗糖、木苏糖、部分棉子糖，以蔗糖为主要运输糖而又以蔗糖磷酸酯的形态进行运输。3磷促进植物的氮代谢和脂肪代谢A、参与呼吸作用的酶类组成中都含有磷；B、促进植物的呼吸作用，增加有机酸和ATP，从而接纳更多NH4+的形成氨基酸；C、磷是磷酸吡哆醛的组成成分，磷酸吡哆醛是氨基转移酶的活性基团；D、磷是硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的重要组成部分，参与NO3的还原和同化；E、磷可促进核酸和蛋白质的合成；F、促进生物固氮作用；G、磷参与糖转化为甘油，再由甘油和脂肪酸合成脂肪；4、磷促进植物代谢过程协调
8、发展，使植株生长健壮，抗逆性增强，促进植物的生长发育，提早开花结实，缩短生育期。三、植物磷效率的概念植物磷效率的概念1、植物养分效率：指生长介质中单位养分产出的生物量或经济产量。2、单位养分产量（1）生长介质中养分供应充足时，养分效率主要决定于植物的生物量或产量潜力；吸收能力（uptake ability）,以总吸收量表示。（2）在生长介质中养分不足时，养分效率决定于植物从介质中吸取养分的能力，即：在体内相对低的养分浓度下，保持正常代谢能力，生理利用率（physiological use efficiency）,以植物体内单位养分量生产的生物量或经济产量表示。3、养分高效基因型指该基因型在这种
9、养分低于正常供应的生长介质中能生产出高于标准基因型的生物量或经济产量。植物活化及吸收土壤磷的能力显然是磷高效基因型的最重要特征。4、磷吸收量植物从土壤中吸收磷的能力。它受到如下因素的影响：（1）根表面积和根的形态学特征；（2）VA菌根及土壤微生物；（3）根际PH值；（4）根分泌物；（有机酸，酸性磷酸酶）（5）磷酸盐的吸收动力学性质，即磷的形态，植物同化能力与吸收能力等。四、植物耐低磷胁迫性状的遗传特征1、研究历史Nielsen和Barber（1978）比较了玉米近交种及其杂交种在田间对磷的吸收利用，发现玉米品种间磷积累的差异至少受两个基因控制。Andonova等（1983）发现玉米杂交种间吸收
10、积累氮、磷、钾能力与其吸收利用的遗传力有关。玉米叶片和籽粒中的磷浓度受加性基因作用。Reiter等（1991）以耐低磷胁迫能力分离的一个玉米F2群体（由两个自交系NY821与H99）杂交产生）为材料，鉴定了77个RFLP(Restriction fragment length polymorphism)下获得耐低磷的表型分离数据。通过这些表型分离数据与这77个RFLP标记的基因型数据相关分析，鉴定出与低磷条件下总干物质重分离显著相关的5个RFLP位点，其中4个标记位点与来自耐低磷的亲本（NY821）的等位基因连锁，一个位点与来自对低磷敏感的亲本（H99）的等位基因连锁。这5个位点分别位于4条染
11、色体上。遗传特性（1）蚕豆品系在缺磷条件下，磷高效品种与磷中效品种杂交所得到的F1代具有超亲现象，其广义遗传力为70%。（2）番茄品种耐低磷能力的差异主要表现为其地上部干物重差异。耐低磷能力强和能力弱的品种杂交F1代干物重超过亲本的89%，且分离后代中一些品系的磷吸收能力特别强。（3）水稻的分蘖能力受磷的影响很大。在缺磷胁迫条件下，水稻的相对分蘖力(relative tillering ability,RTA)是比较稳定的，可作为筛选水稻耐磷的一个参数，但品种间存在差异。耐低磷亲本富含隐性基因，敏感与中等敏感亲本具更多的显性基因。第二节 原核（E.Coli）磷吸收转运一、运输途径一、运输途径1
12、 运输途径 通过荚膜（Capsule）然后进入细胞外膜与细胞之间的周质空间(periplasmic space,PPS)。2 吸收运输系统 有两个吸收运输系统：低亲和与高亲和系统。当磷素供应充足时，磷分子通过细胞外膜孔蛋白(Outer membrane pore protein)ompC和ompF扩散到细胞周质空间，然后被细胞膜上的无机磷酸盐载体识别运送到细胞内。细胞可以多磷酸盐颗粒的形式贮存吸收磷。这一吸收转运系统属磷低亲和吸收转运系统。当磷供应不足时，即磷饥饿条件下，大肠杆菌和其他微生物能诱导产生一系列酶蛋白，提高细胞对磷的吸收转运与代谢能力。由受磷饥饿诱导表达的基因(phosphorus
13、 starvation inducible gene,PSI gene)组成的磷调节系统，称为磷调节子(Pho regulon).二、大肠杆菌磷饥饿诱导基因大肠杆菌磷饥饿诱导基因1 诱导作用 在大肠杆菌代谢酶活性与营养因子胁迫关系的研究中，在酸性条件下（pH4.5），且当磷饥饿时，大肠杆菌有酸性磷酸酶的合成。酸性磷酸酶水解磷酸对硝基苯为对硝基苯酚，使溶液变黄色。当加入KOH使培养基pH达9以上时，酸性磷酸酶水解反应停止，但仍然观察到黄色的对硝基苯酚浓度继续增加。为明确在高pH时反应继续进行是由残余酸性磷酸酶水解作用造成，还是另一种酶在起作用，将这种缺磷的高pH生长介质于90C水煮10min，彻
14、底消除酸性磷酸酶的活性，然后再培养大肠杆菌，结果仍发现溶液黄色继续增加，证明是另一种受磷饥饿诱导的水解酶在起作用。碱性磷酸酶 由两个相同亚基通过非共价键(noncovalent bonds)连接组成的二聚体，亚基内有二硫键。当在低pH或二硫键被还原时，酶以单体存在，没有活性，具有温度不稳定性。在Zn2+或Mg2+存在的条件下，单体再形成二聚体恢复酶的活性。在磷饥饿时，碱性磷酸酶一般位于细胞的表面或细胞周质空间。3 两个磷酸盐吸收转运系统（1）无机磷酸盐转运系统(phosphate inorganic transport,Pit)；（2）特异磷酸盐转运系统(phosphate specific
15、transport,PST)。其中一个pst基因产物是磷酸盐结合蛋白，命名为PHOS。PHOS像碱性磷酸酶一样，位于细胞周质空间，受磷饥饿诱导。在大肠杆菌中至少已发现了25个磷饥饿诱导(phosphate starvation inducible，psi)基因。除phoA、phoS外，重要的psi基因包括外膜孔蛋白E的基因phoE、3-磷酸甘油吸收和结合蛋白基因ugpA与ugpB、磷调节子表达调节基因phoR 与phoB等。4 磷饥饿诱导大肠杆菌增强磷吸收机制 磷饥饿诱导产生高效的细胞外膜孔蛋白，水解酶结合蛋白 磷饥饿诱导的带负电荷的PHOE蛋白（外膜孔蛋白基因phoE编码的蛋白）识别无机磷，
16、并将其运送到 细胞周质空间，其运送效率比带正电荷的细胞外膜孔蛋白OMPC和OMPF高6-8倍。细胞周质空间的磷被细胞膜上的磷结合蛋白结合，通过磷转运系统（PST）穿过细胞质膜进入细胞内。5 磷结合蛋白的特异性 对不同形态的磷有不同的细胞膜磷结合蛋白。结合态磷，如3-磷酸甘油，在细胞周质空间与细胞膜3-磷酸甘油结合蛋白（UGP）结合，通过高亲和吸收转运系统(high-affinity uptake system)运至细胞内；多聚磷酸盐颗粒、有机磷及部分3-磷酸甘油，在周质空间被酸性磷酸酶转变成无机磷，与磷结合蛋白结合，通过PST系统进入细胞内；3-AMP与5-AMP进入细胞周质空间后，分别通过2
17、,3-环状磷酸二酯酶及5-核酸酶降解转变为无机磷，通过PST系统进入细胞内。三、磷调节子的调节模式三、磷调节子的调节模式1 磷调节子基因是受磷饥饿诱导的。其中一些基因的转录也受其他环境胁迫的诱导，如氮或碳的饥饿或紫外线辐射。2 磷调节子是通过多个调节基因起作用的，这些基因组成一个级联调节系统(cascade regulatory network)（Shinagawa,1987）。3 调节模式1 磷饥饿时，该系统中PHOB蛋白呈激活态PHOB(A)，诱导其他pho表达，其表达产物增强磷的吸收运转。当磷供应过量时，磷通过磷酸盐转运系统进入细胞，提供信号激活phoU基因，该基因编码的蛋白PHOU使p
18、hoR基因编码的蛋白PhoR从激活态PHOR(A)转变成抑制态PHOR(I),HPOR(I)将激活态 PHOB(A)转变成抑制态PHOB(I)，从而抑制pho基因的表达。调节系统中的信号传递可能是通过合成效应物分子，或者是由于蛋白质的共价修饰。当phoR基因缺失时，phoM可以代替其功能。如下图。缺磷phoB(I)phoR(A)phoB(A)phoR(I)phoU未知信号或分子PiPST phoAPst-phoU operon phoB-phoRphoEugpAB operon Other operon phoR(I)增强磷的吸收增强磷的吸收调节模式2 Rao等（1986）提出与上述调节模式相
19、似的磷调节子的调节模式。当P供应受到限制时，pho调节子基因激活phoR编码的蛋白与核酸辅助因子X结合成为激活态蛋白，进一步激活phoB基因的表达,该基因的产物激活其他磷调节基因phoA,phoS,pst,phoE等，这些基因的表达促进Pi的转化及利用。当phoR缺失时，phoM可代替phoR激活phoB。phoR,phoB,phoM的基因产物为phoA的正调节因子。当P供应过多时，PHOR蛋白与核酸辅助因子Y结合，P使phoB处于抑制状态。phoS与pst基因负责磷的运输，phoU基因负责X与Y间的转换，因此PHOR，PHOS，PST 和PHOU起负调节phoA的作用。以上两种模型的级联调节
20、系统都表明，PHOB-PHOR在磷调节子的调节系统中起着重要作用。如下图。phoBphoMphoRphoUPiPST phoSphoAPst-phoU operon phoB-phoRphoEugpAB operon Other operon 增强磷的吸收增强磷的吸收PiY factor phoRYX factor phoRX(-)(+)(+)第三节第三节 真菌菌根高亲和磷酸盐的转运真菌菌根高亲和磷酸盐的转运1、菌根的性质 菌根是一种分布广泛的真菌与高等植物之间的联合共生体。通常，土壤中的大多数植物根系是有菌根的。例如，小麦、玉米、桑、茶、李、柑橘、山毛榉、松、兰花等都发现有菌根。2、菌根的类
21、别 菌根包括外生菌根和内生菌根两大类。（1）外生菌根：外生菌根是真菌菌丝穿入外皮层的细胞间隙，形成一个真菌菌丝网，并围绕着根相互编织覆盖起来，形成鞘状菌根。菌丝由鞘向外延伸并穿透周围土壤，受侵染的根系常常完全为菌丝所覆盖。（2）内生菌根：内生菌根的菌丝既生长在皮层细胞内，也可生长在细胞间隙中，真菌套延伸到土壤里。内生菌根中最常见的是一种孢囊丛枝状菌根(vesicular arbuscular mycorrhizal,VAM)。这种菌根生长在皮层中，并常常带有富含类脂的圆卵形球状体（囊泡），而且高度分枝，在寄主细胞内形成类吸喙结构（丛枝），用于养分转移。该类真菌属于内囊霉科(Endogonace
22、ae)，主要的属是属Glomus，是土囊真菌中最多的一类。3、菌根的作用 菌丝可代替根毛，增加根吸收水分和养分；菌丝呼吸释放大量的CO2，溶解后成为碳酸，促进土壤难溶物质溶解。此外，菌丝还能产生维生素B1（硫胺素）、B6（吡醇类），促进根系发育。另外，菌根也依赖寄主供应碳水化合物、氨基酸、维生素和其他有机物质。与根发生共生关系的真菌无严格的专一性。菌根促进磷的吸收和改善磷营养，是菌根植物生长与产量得以增加的主要原因。以单位根长计算，菌根比非菌根可以多吸收几倍的磷。因为菌丝的生长增加了吸收表面积，菌丝可达到距根表面数厘米的地方，使根的吸磷范围超过根际磷耗竭区。已经有报道表明，VA菌根的菌丝将磷从
23、土壤运输到寄主根细胞距离可长达8cm。菌根对磷营养的主要作用是加快对难溶磷的吸收速率。菌丝呼吸释放大量的CO2，溶解后成为碳酸，促进土壤难溶磷化合物（如磷酸钙）溶解。真菌膜转运系统对磷的亲和力比寄主根系的高，使真菌菌根有较高的磷吸收效率。由于菌丝以较高的速率吸收土壤中的磷，促进邻近的土壤和肥料中一些难溶性无机磷化合物的溶解作用，红辣椒地上部干重明显增加。而与红辣椒相反，向日葵利用难溶性磷的能力很强，因此尽管其菌根的发育较好，而且磷的吸收也显著增加，但是VA菌根的侵染并未明显表现出促进生长的效应。表明菌根依存性的基因型差异可归结于各种因素。4、菌根从土壤中吸收磷并转运到植物体的分子生物学 Har
24、rison 等1995年首次分离到了一种孢囊丛枝状真菌Glomus versiforme的细胞跨膜磷酸盐载体基因(gvpt)，并对其载体结构及吸收磷酸盐的分子机制进行了研究。其方法是：制备豆科植物苜蓿（Medicago truncatula）与真菌G.versiforme的共生菌根cDNA文库，以酵母(Saccharomyces cerevisidae)的pho84基因为探针，从该基因文库中分离到一个cDNA克隆(gvpt)，全长1932 bp，在阅读框(ORF)的5末端和3末端不转录序列分别为112bp和257bp长。编码蛋白521个氨基酸，是一个膜蛋白(integral membrane
25、protein)，包含有12个跨膜结构域(membrane spanning domain)，与所有真核生物（eukaryote）和原核(prokaryote)膜转运体有相似的二级结构(secondary structure)。GVPT的氨基酸序列与Pho84有47.9%的同源性，与Pho5有45%的同源性它们之间最保守的序列区包括有激酶C(kinase C)和酪蛋白激酶II(casein kinase II)的磷酸化位点(phosphorylation site)。gvpt 是从有两个基因组（植物和真菌）的cDNA文库中鉴定出来的，因此，可能来自于共生体的任何一个基因组。用M.truncat
26、ula 基因组DNA进行Southern印迹分析发现，gvpt不是寄主植物的基因。由于G.versiforme是寄生的，纯真菌材料难以得到，因此用gvpt的特异序列设计引物，对G.versiforme的基因组DNA进行PCR扩增。扩增片断进行序列分析，发现与gvpt相同，同时PCR扩增共生菌根(M.truncatula,G.versiforme)DNA，得到同样的DNA片段，而从没有菌丝的M.truncatula 根系没有扩增到这样的片段。由此，证明gvpt是真菌上的基因。pho84缺失突变体缺乏高亲和磷酸盐转运体，不能在低浓度的磷条件下吸收磷酸盐甚至在高浓度磷酸盐时可产生抑制性酸性磷酸酶，而
27、且这种现象很容易检测到。因为pho84突变体NS219细胞容易染红，而野生型仍是白色，可在介质中生长。将gvpt cDNA连接到一个酵母表达载体pAAH5上转移到pho84突变的酵母NS219株系上，gvpt在NS219细胞中表达，使NS219显示出野生型的酸性磷酸酶活性，表现形式仍然是白色的，表明gvpt的表达互补了pho84缺失突变体的表现型，表达载体没有gvpt序列的NS219转化体，显示pho84缺失突变体的表现型，染色为暗红色。这一试验充分证明，gvpt是一个编码功能性磷酸盐载体的基因。孢囊丛枝状真菌G.margarita菌丝的磷酸盐吸收也有两个吸收系统：主动的高亲和力系统被动的低亲
28、和力系统原位杂交试验证明：gvpt不是在根内的真菌菌丝中表达，而是在分枝于根外部的菌丝中表达。收集菌根完整的外部菌丝，gvpt转录物进行反转录分析（reverse transcription,RT-PCR)，含有内部菌丝的根组织gvpt转录非常低，gvpt转录物主要存在于根的外部菌丝中，其中的gvpt转录物高出内部30倍。表明外部菌丝是基因表达的主要部位。高磷吸收和低磷吸收系统的区别高磷吸收低磷吸收条件外界低磷外界高磷能量需要能量不需要磷流动的方向逆向正向作用方式主动被动一、吸收磷的特点一、吸收磷的特点途径 生长介质中的磷通过根毛和表皮细胞进入皮层，再由内皮层通道细胞进入中柱，沿中柱木质部运送
29、至地上部，从而分配到地上部不同的器官。吸收运转的控制点 磷通过细胞质膜进入根表皮及皮层细胞共质体；载入根系中柱的木质部。随生长环境中磷浓度的降低，根系及细胞对磷的吸收能力增强-表明植物对低磷胁迫具有适应机制。第四节 高等植物磷吸收转运系统二、拟南芥高亲和磷酸盐吸收转运体基因及二、拟南芥高亲和磷酸盐吸收转运体基因及表达表达分离到的基因 AtPT1、AtPT2、PHT1、PHT2、PHT3。其中前两者是最早分离到的高亲和磷酸盐吸收转运体基因。AtPT1、AtPT2分离方法 原理是利用相似功能基因具同源性，即可以用功能相似的基因作为探针进行文库筛选，获得阳性克隆，测序新的克隆，然后将其序列与原探针克
30、隆进行比较，分析阅读框，看是否新克隆到的序列具有完整的基因结构，如有的话，即达到了新的基因克隆的目的。Bun Ya等1991年利用酵母的pho84基因筛选拟南芥根系磷胁迫诱导cDNA文库。AtPT1为1754bp长的核苷酸序列，其阅读框编码524个氨基酸的多肽，分子质量57.6kDa。AtPT2是1897bp长的核苷酸序列，其阅读框架编码534个氨基酸的多肽，分子质量58.6kDa。两者在编码区的核苷酸序列同源性达70%，编码的氨基酸有78%的同源性。三、低磷胁迫诱导核糖核酸酶基因三、低磷胁迫诱导核糖核酸酶基因1、核糖核酸酶（RNase）它是一种RNA水解酶，活性最适pH为5.5，蛋白质等电点
31、3.9，对EDTA(2.5mM)不敏感，分子质量为22kDa。实际上，它是一种磷酸基团转移酶(phosphotransferase)，对单磷酸二核糖核苷具有水解作用。如对鸟嘌呤尿嘧啶二核苷GpU的酶解作用，最初中间产物是2,3-cGMP和尿嘧啶(5min)，延长反应时间，30min后23-cGMP降解为3-GMP。通过酶对16种单磷酸二核糖核苷的水解作用发现，RNase对5是嘌呤(purine)碱基的水解率比5是嘧啶(pyrimidine)的水解率高，但3端的碱基对酶解也有影响，底物的结构影响这种酶的活性。2 核糖核酸酶的诱导 番茄的悬浮细胞培养时，细胞从对数生长到稳定生长期间（4-6天），细
32、胞内及介质间核糖核酸酶的活性提高10倍。这有两种可能：（1）磷素营养减少而导致营养饥饿抑制了细胞生长，RNase降解RNA；（2）低磷胁迫诱导作用 实际上是细胞从对数生长到稳定生长期间需磷量显著增加，细胞外Pi的含量显著降低，为了适应这种需磷量的增加，胞外RNase活性增加，降解胞外RNA，释放Pi来满足细胞生长的需要。并且发现有缺磷时，有新的蛋白质合成-包括核糖核酸酶I。3 低磷胁迫胞内RNA酶活性提高 如RNaseLV-1,RNaseLV-2,RNaseLV-3,RNaseLX(RNaseLV指番茄液泡RNA酶；RNaseLXR指不知道的胞内RNA酶)。前三种酶位于细胞液泡内，后一种位于其
33、他细胞器中。但它们的作用方式相同。1APase在植物组织中的分布 位于易与外界环境接触的部位（？）。如洋葱根尖的APase主要分布于表皮与皮层空间，这可能是由于皮下孔利于酸性磷酸酶分泌到根外。浮萍根的表皮及叶的上表皮有很高的浓度及活性。（这些与细菌APase相似，都是在外层空间）四、低磷胁迫诱导的酸性磷酸酶（四、低磷胁迫诱导的酸性磷酸酶（APaseAPase）2APase的作用 分解有机磷，使磷成为一种易于吸收的状态。如研究在磷充足（10mg/L）和磷胁迫条件下(0.5mg/L)，水稻的根、茎的磷含量、磷的利用率、酸性磷酸酶活性、分泌性酸性磷酸酶活性进行分析，发现抗性品种随着磷浓度的降低根茎磷
34、的含量降低较小，磷的利用效率大大提高，而磷敏感的品种正好相反。低磷胁迫诱导APase、分泌性APase活性增加，耐低磷胁迫品种分泌性APase活性显著高于敏感品种。羽扇豆在正常Pi提供的条件下生长15天后，根系中主侧根含磷量显著增加；在缺磷处理下，主侧根磷水平两天内即快速下降。主根APase活性水平在缺磷和正常条件下保持稳定，而侧根APase活性水平在缺磷条件下培养15天后活性增加了两倍，表明在缺磷条件下，APase在侧根合成，而不是在主根合成。纯化根系分泌性APase，将酶液（1ml,大约1mg），注射到兔子体内，收集血清，用纯化得到的抗体注射到缺磷处理20天的羽扇豆中，通过荧光显微技术(f
35、luorescence microscopy)分析，发现分泌性APase位于主根的内皮层(endodermal)和表皮细胞。在侧根中大部分是位于细胞壁及细胞之间，这结果表明在侧根的所有组织都有分泌性APase合成，但侧根的位置不像主根那样明显，这个结果表明，侧根中一旦有分泌性APase合成，就会主动分泌出来。3低磷胁迫诱导的酸性磷酸酶是一种复杂的化合物。它具有几种同工酶，常形成聚合体发挥作用。Goldstein(1988)将培养3天的番茄悬浮培养细胞放入缺磷的培养基中，在处理与对照的细胞生长无差异时，细胞分泌APase 增加2.7倍，将这些从培养介质分离的APase通过Sephadex-G-1
36、50层析柱分离，发现APase有二种同工酶，低分子量酶（M II）和高分子量酶(M I)。以上研究结果证明在高等植物中存在着与大肠杆菌及酵母一样的多基因磷酸盐饥饿应急系统。高等植物Pho调节子由于涉及到细胞组织和植株的综合反应，磷调节子PHO regulon只是从低磷胁迫产生生理和生化的影响方面进行推测，包括特异组织质外体APase合成，诱导根的生长，以及增加磷吸收率及双向运输率。五、低磷胁迫诱导的细胞分泌性蛋白质五、低磷胁迫诱导的细胞分泌性蛋白质高等植物磷胁迫诱导分泌性酸性磷酸酶、核糖核酸酶及胞内核酸酶活性增强过程中，蛋白质的合成及分泌到胞外起着非常重要的作用。研究表明，磷营养的缺乏诱导细胞
37、分泌出一些新的蛋白，同时也会抑制某些蛋白的表达。用35S蛋氨酸同位素标记+Pi及-Pi条件下培养的番茄细胞分泌蛋白进行SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶）放射自显影发现，-Pi诱导一些蛋白带增强，如在6070kDa范围内有两个蛋白带表达增强2倍，这个分子质量范围内的蛋白表达增强带正好与前面所提到的-Pi诱导3天番茄悬浮增大细胞APase活性增强2.7倍的结果一致。另外在45kDa及20kDa左右诱导出两条新的蛋白带。不同的缺磷胁迫时期，诱导细胞分泌性蛋白数量及蛋白种类可不同。Goldstein等（1989）测定+Pi及-Pi悬浮培养2，4，6，8天的番茄细胞的分泌性蛋白，发现在最
38、初4天，+Pi及-Pi两个处理介质中总蛋白有较小的变化，但生物量相同；第6天时，-Pi的细胞生物量不再增加，细胞不再生长，但分泌到介质中的蛋白量是+Pi的1.5倍，第8天时，-Pi细胞的分泌蛋白是+Pi的4.4倍。即随-Pi时间延长，分泌性总蛋白数量增多。-Pi及+Pi不同培养时间的番茄细胞总分泌性蛋白进行SDS-PAGE分析，共显示3747条带，其中16条是清晰可辨的，9条带与-Pi有关。这9条带分为三个类型。一类是在短期内-Pi，细胞生长未受到影响之前产生的。在-Pi的1天时，细胞+Pi条件下相同，但已有53.6kDa和42.9kDa及59.kDa的蛋白量的增加。在不同的-Pi培养时期，2
39、、4、6、8天，-Pi/+Pi的53.6kDa 分泌性蛋白比率为1.4、1.9、2.4和7.1，因此，推测这部分增加的分泌性蛋白是分泌性酸性磷酸酶。结论：第一类蛋白是细胞磷饥饿诱导所特有的。第二类蛋白是当-Pi胁迫时间延长时，细胞生长停止后，增加的分泌性蛋白中的67.2kDa,48.2kDa和45.3kDa呼吸速率增加1倍，分泌性蛋白增加4.4倍。第三类蛋白是受-Pi营养的抑制或受磷素营养的限制，如57.7kDa,60.2kDa,54.5kDa。六、低磷胁迫诱导的呼吸代谢途径六、低磷胁迫诱导的呼吸代谢途径的调节的调节 磷不仅是植物的主要组成成分，也是参与能量转换及代谢调节的主要元素，因此磷亏缺
40、影响到植物呼吸代谢的进行。植物体内糖及淀粉的降解首先要经过糖酵解过程，转变为丙酮酸，然后进入三羧酸循环。这个过程需要许多酶，而大多数酶需要磷的参与，糖酵解的主要过程见下图：悬浮细胞有磷饥饿和磷充足的条件下细胞内ATP和ADP浓度及丙酮酸激酶的变化发现，磷饥饿细胞丙酮酸激酶活性降低，ATP浓度提高16倍，ADP降低8倍，细胞内产生磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）磷酸酶。延长磷的饥饿时间，丙酮酸激酶的活性将因底物ADP含量而受到抑制，此时磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶将代替丙酮酸激酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸转变成为丙酮酸的反应。这样尽管能量浪费，但没有削弱PEP转变为丙酮酸的能力，说明植物本身具有生化调节功能，能
41、在磷饥饿时降解ADP和ATP，产生无机磷，满足植物对磷的吸收的同时，完成植物的许多代谢功能。Stephen等（1989）将磷供应充足的黑芥（Brassicarapa nigra）悬浮细胞转到缺磷的培养基上培养7天，发现可溶性蛋白浓度降低2倍，而总PEP磷酸酶活性增加10倍，表明低磷磷PEP磷酸酶产生。将B.nigra的叶柄悬浮细胞磷饥饿诱导7天后发现：1.磷酸果糖转移酶(fructose 6-phosphate phosphatransferase)，2.非磷酸化的NADP-3-磷酸甘油醛脱氢酶(nonphosphorylation NADP-glyceraldehyde 3-phosphat
42、e dehydrogenase)，3.磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶(phosphoenolpyruvate phosphatase)4.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性5.增加约5倍。磷酸化NAD-3-磷酸甘油醛脱氢酶降低约6倍。6-磷酸果糖激酶，3-磷酸甘油激酶(3-phosphoglycerate kinase),丙酮酸激酶(pyrurate kinase),NAD苹果酸酶（NAD malic enzyme）没有变化。此外，磷的亏缺造成体内磷、ATP、ADP、2，6-二磷酸果糖和可溶性蛋白质含量降低，而游离氨基酸含量提高6倍。磷酸盐浓度没有变化。Kinome激酶组学 基于以上的变化，Stephen等（
43、1989）提出低磷胁迫抑制体内的糖酵解过程，诱导产生糖酵解支路，即以6-磷酸果糖转移酶，非磷酸化的NADP-3-磷酸甘油醛脱氢酶及磷酸烯醇或丙酮酸磷酸酶为主的代谢支路。糖酵解途径需ATP和ADP（见上图）。介质中磷的亏缺将会使植物体内腺苷酸和磷的含量下降，而磷和腺苷酸在磷酸果糖激酶（PFK），磷酸化NAD-3-磷酸甘油醛脱氢酶（NAD-G-3-PDH），3-磷酸苷油酸激酶（3-PGA）和丙酮酸激酶（PK）参与的你谢反应中必需的，介质中磷亏缺将严重限制糖酵解途径的进行。但磷胁迫条件下细胞诱导产生6-磷酸果糖转移酶，非磷酸化的NAD-3-磷酸甘油醛脱氢酶及磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶，这些酶可以进行与P
44、FK，磷酸化DNA-G-3-PDH，3-PGA激酶和PK的平行反应，不需要磷和核苷酸的参与，从而保证了植物呼吸代谢的正常进行。七、低磷胁迫诱导的吸收磷体内转运七、低磷胁迫诱导的吸收磷体内转运低磷胁迫诱导细胞膜磷酸盐转运体数量增多及其对磷酸盐的亲和力提高，同时吸收Pi转移到茎中的量也增加。通过对拟南芥突变体的研究，Poirier等1991年报道，磷酸盐释放到木质部受5号染色体上的Pho1基因控制。从EMS(ethyl methanesulfonate，乙基甲基磺酸)诱变突变体的M2群体中随机选择2200株，测定叶片中总磷含量，发现一个突变体的叶片总磷量显著低于野生型，突变体命名为PL9。将PL9
45、与野生型拟南芥进行4代回交后，测定突变型与野生型幼苗（生长10和18天）叶片磷酸盐含量。野生型（鲜重）分别为27.9 1.6 M/g(10天)及28.4 0.7M/g(18天)，而突变体随时间延长叶片（鲜重）含磷量显著降低，分别为野生型的44%（10天）和24%（18天）。突变体种子（干重）中磷含量（44 6 M/g）也低于野生型（218 20 M/g）。以上含磷量差异主要是无机磷差异（野生型比突变体高近21倍）。由于Pho1的突变，突变株地上部生长显著降低，同时显示出缺磷症状，如薄叶柄、小叶、分蘖少、开花推迟6天，叶及茎内花色素苷(anthocyanin)提高，种子数量仅有野生种的5%，种子
46、小，萌发率仅有55%。在任何外界磷浓度下，突变型和野生型根部吸收相同量的磷，转移到茎中的量却显著降低，证明pho1控制根系吸收的磷转运到木质部。pho1的缺失使根系吸收的磷不能运到叶片中。野生型与突变体地上和地下部其他元素含量，如Al,B Ca,Cu,Fe,Mg,Mn,Zn,N元素，无显著差异，而磷含量野生型比突变体高4倍，K+的差异也达显著水平。K+的减少可能是由于K+在保持植物细胞内阴阳离子平衡中起重要作用，磷的减少引起了K的减少。突变及野生型根系吸收等量的磷及硫，但野生型转运吸收磷的35%，突变体仅转运吸收磷的0.9%，相差近40倍；突变型运转硫与野生型比仅差1倍左右。这说明pho1突变
47、影响吸收磷向地上部的转移有一定的专一性。植物矿质营养的吸收率，受体内矿质营养浓度的反馈调节，即在营养充足的条件下，茎中的营养元素可通过韧皮部的营养循环途径返回到根部，抑制养分的吸收。这种假说已通过分离到一个拟南芥pho2 突变体得到证明。Summery Phosphate(Pi)，key substrates in energy metabolism，biosynthesis of nucleic acids and membranes.photosynthesis,respiration and regulation of a number of enzymes,most of the to
48、tal soil phosphorus(P)is not available for uptake due to its rapid immobilization by soil organic and inorganic ponents Phosphorus is limiting for crop yield on over 30%of the worlds arable land,and world resources of inexpensive rock phosphate may be depleted by 2050 lead potential future crisis in
49、 agricultureAbouit 30%to 80%of soil P occurs in organic form,which,after mineralization,can contribute considerably to the P nutrition of plants Many genes involved in phosphorus metabolism has been indentified and cloned from different organism Those research will benefit for plant breeder to produ
50、ce low phosphorus toleranct crops For example,under low-Pi conditions plant increased synthesis and secretion of APases which involved in many biological processes such as providing P during seed germination from stored phytate,internal remobilization of P,release of P from soil organic P-esters and