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1、培养前准备培养前准备培养基培养基培养设备培养设备细胞培养基础知识细胞培养基础知识一、一、细胞培养物的生长细胞培养物的生长生物学生物学 按生长方式按生长方式粘附型细胞上皮细胞型上皮细胞型成纤维细胞型成纤维细胞型游走细胞型 多型细胞型各种实体瘤细胞悬浮型细胞造血系统肿瘤细胞体外细胞培养物的生长类型体外细胞培养物的生长类型 成纤维细胞：梭形、三角形、成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起个突起上皮细胞：扁平、多角形、圆核上皮细胞：扁平、多角形、圆核可连成单层可连成单层(1)(1)上皮型细胞上皮型细胞(2)(2)成纤维型细胞成纤维型细胞(3)3)游走型细胞游走型细胞(4)(4)多形型细胞多形型细胞12
2、34（一）贴附（一）贴附(粘附粘附)型细胞型细胞 粘附粘附:是大多数有机体是大多数有机体细胞细胞在体内在体内生存生存和和生长发育生长发育的的基本存基本存在方式在方式含义：含义：细胞与细胞间接触，细胞与细胞外基质结合。细胞与细胞间接触，细胞与细胞外基质结合。结果结果：细胞与细胞之间相互结合形成组织，使细胞与其周围：细胞与细胞之间相互结合形成组织，使细胞与其周围环境间始终保持联系，使有机体内几乎不存在环境间始终保持联系，使有机体内几乎不存在“自由自由”的的细胞。细胞。培养时培养时：这些细胞被放到体外环境中以后：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因
3、而某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞属于粘附型细胞。细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物，乳腺外胚层 消化道，呼吸道上皮内胚层 内皮 中胚层 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，但不完全相同上皮细胞型上皮细胞型 易相连易相连成片成片相靠相靠紧密相连紧密相连成薄层成薄层铺石状铺石状生长生长时呈时呈膜状膜状移动移动很少很少脱离细胞群而脱离细胞群而单个活动单个活动
4、上皮细胞型上皮细胞型生长特点生长特点成纤维细胞型成纤维细胞型 名称：名称：名称：名称：凡在凡在培养中形态与成纤维细胞类似培养中形态与成纤维细胞类似的的来源：来源：来源：来源：由由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织的组织 如：真正的成纤维细胞如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形形形形态态态态：似似体体内内成成纤纤维维细细胞胞的的形形态态，梭梭形形或或不不规规则则三三角角形形，胞质向外伸出胞质向外伸出2323个个长短不等的突起，长短不等的突起，中有卵圆形核。中有卵圆形核。排列成排列成放射状，漩涡状放射状，漩涡状 不紧靠连成片，细胞与细
5、胞接触易断开而不紧靠连成片，细胞与细胞接触易断开而单独行动单独行动 游离的游离的单独的单独的成纤维样细胞，成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起常有几个伸长的细胞突起成纤维细胞型成纤维细胞型生长特点生长特点体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞l具有类似巨噬细胞样的特征。具有类似巨噬细胞样的特征。经常处于较活跃的变形及经常处于较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且不断变化。当细胞密度增游走状态，因此外形不规则且不断变化。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。或成纤维细胞型的细胞。l
6、表现这种形态的细胞主要是表现这种形态的细胞主要是具有吞噬作用的单核巨噬细具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞巨噬细胞、肝枯否细胞(KupfferKupffer cell)cell)以及某些肿瘤细以及某些肿瘤细胞等。胞等。游走型细胞游走型细胞 l多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，细胞一般多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，细胞一般分胞体和胞突两部分分胞体和胞突两部分：其胞突为细长形，似丝状伪其胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样足。胞体虽略呈多角形，但没有成
7、纤维细胞型那样不规则。不规则。l体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞元和神经胶质细胞 。多形型细胞 l细胞形态并非固定不变细胞形态并非固定不变，可随培养条件、生长时期、细，可随培养条件、生长时期、细胞数量等而变化胞数量等而变化 l细胞形态只是对培养物判断或识别的参考指标细胞形态只是对培养物判断或识别的参考指标l若要确定某一培养物的确切细胞类型，必须借助更为特若要确定某一培养物的确切细胞类型，必须借助更为特异的鉴定方法异的鉴定方法，如进行组织化学或免疫细胞化学染色鉴，如进行组织化学或免疫细胞化学染色鉴定。定。注意：注意：培养细胞
8、形态不稳定培养细胞形态不稳定血清血清Hela高血清高血清低血清低血清成纤维细胞样 上皮样细胞pHHela太酸或太碱太酸或太碱 标准标准pH成纤维细胞样上皮样细胞细胞密度细胞密度 3T3低密度低密度高密度高密度成纤维细胞样上皮样细胞生长状态改变生长状态改变悬浮悬浮贴附贴附圆形成纤维或上皮样转化与否转化与否未转化未转化转化转化成纤维样上皮样（二）悬浮生长型（二）悬浮生长型概念概念 培培养养时时不不贴贴附附于于基基质质而而呈呈悬悬浮浮状状态态生生长长，或或以以机机械方法使保持悬浮状态下生长械方法使保持悬浮状态下生长来源来源 自自血血，脾脾或或骨骨髓髓，尤尤其其血血中中白白细细胞胞，癌癌肿肿细细胞胞也
9、也可可能能特点特点 在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团优点优点优点优点 生存空间大，生存空间大，生存空间大，生存空间大，提供数量多提供数量多提供数量多提供数量多 传代方便传代方便传代方便传代方便 (不需消化不需消化不需消化不需消化)易于收获易于收获易于收获易于收获 可获得稳定状态可获得稳定状态可获得稳定状态可获得稳定状态缺点缺点缺点缺点 观察不方便观察不方便观察不方便观察不方便 很多细胞不能很多细胞不能很多细胞不能很多细胞不能悬浮生长悬浮生长悬浮生长悬浮生长 (尤其正常细胞尤其正常细胞尤其正常细胞尤其正常细胞)二、培养细胞的生长和增殖过程二、培
10、养细胞的生长和增殖过程分裂增殖和生长发育是体外培养细胞的两大生命特征增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿（一）组织培养细胞生命期一）组织培养细胞生命期 (Life Span of Culture Cells)在培养中持续增殖和生长的时间。原代培养期、传代培养期、衰退期。1、原代培养期、原代培养期(Primary Culture stage)也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。特点特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。2、传代期、传代期(passage stage)特点特点：在全生命期中此期的持续时间
11、最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。传代传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。原代培养传代培养原代培养传代培养镜下观察镜下观察选取生长良好的细胞选取生长良好的细胞加入胰蛋白酶消化液加入胰蛋白酶消化液倒去酶液，加入培养液倒去酶液，加入培养液反复吹打制成细胞悬液反复吹打制成细胞悬液按比例分装后培养按比例分装后培养一一代贴附生长细胞的生长过程代贴附生长细胞的生长过程
12、游离期游离期贴壁期贴壁期潜伏期潜伏期对数生长期对数生长期停止期（平台期）停止期（平台期）体外培养细胞一代生存期体外培养细胞一代生存期潜伏期潜伏期指数增生期指数增生期停滞期停滞期所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。2.1 游离期：游离期：l细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。l 10min-4h2.2 贴壁期：贴壁期：l细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟-4小时贴壁。l底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等l血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮
13、细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。l进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）2.3 潜伏期：潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624 h。2.4 2.4 对数生长期：对数生长期：对数生长期：对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。最适合进行实验研究。2.5 2.5 停止期（平台期）：停止期（平台期）：停止期（平台期）：停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性机制：接触抑制、密度依赖性a.贴附b.接触抑制c.密度抑制培养
14、细胞的生长特点培养细胞的生长特点3、衰退期、衰退期特点特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。细胞周期M期（期（有丝分裂期）间期间期G1期（DNA合成前期）S期（DNA合成期）G2期（DNA合成后期）（二）单个细胞的生长过程（二）单个细胞的生长过程三、培养细胞的生存条件三、培养细胞的生存条件培养皿培养皿或培养瓶或培养瓶 温度、湿温度、湿度和气体度和气体由CO2恒温孵育箱提供 生长生长培养液培养液1020的血清 维持维持培养液培养液25的血清 营养物质营养物质糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等 （一）细胞的营养需要 -培养基培养基的基本要求培养基的基本要求基本基本营营养物
15、养物质质：氨基酸、氨基酸、维维生素、碳水化合物及一些无生素、碳水化合物及一些无机离子机离子促生促生长长因子、激素、血清等物因子、激素、血清等物质质渗透渗透压压：因因细细胞的胞的类类型及种族而异。人血型及种族而异。人血浆浆渗透渗透压约为压约为290 mmol/L，可，可视为视为体外培养人体外培养人类细类细胞的理想渗透胞的理想渗透压压。鼠。鼠细细胞渗透胞渗透压压在在320 mM左右。左右。对对于大多数哺乳于大多数哺乳动动物物细细胞，渗胞，渗透透压压在在260-320 mM。pH：大多数大多数细细胞的适宜胞的适宜pH为为7.2-7.4.无毒、无无毒、无污污染染培养基的种类培养基的种类天然培养基天然培
16、养基：血清血清合成培养基合成培养基：主要是牛血清主要是牛血清 胎牛血清：胎牛血清：取自破腹产的胎牛新生牛血清：新生牛血清：取自出生24h的新生牛小牛血清：小牛血清：取自出生10-30d的小牛主要成分主要成分血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等血清：血清：主要作用主要作用1）提供基本营养物质2）提供贴壁和扩展因子3）提供激素及各种生长因子4）提供结合蛋白5）对培养中的细胞提供某些保护作用血清：血清：主要缺点主要缺点1）改变某种细胞在体内的正常状态2）血清中含有的某些物质对细胞有毒害作用3）每个批次血清的成分不能保持一致4）取材过程中可能污染支原体、病毒等，对培养细胞产生潜在
17、影响血清：血清：使用前处理使用前处理56oC灭活30min。储存条件储存条件一般储存于-20 oC，避免反复冻融，购买大包装后，先灭活，然后分装冻存，使用前4 oC融化。使用浓度使用浓度一般为5-20%，最常用为10%。血清：血清：低限量Eagle培养基，仅含有12种2必需氨基酸、谷氨酰胺，8种维生素及必要的无机盐。成分简单，易于添加某种特殊成分适应某些特殊细胞的培养。MEM(minimum essential medium)：由Dulbecco等人研制，在MEM基础上增加了各成分的用量，分为高糖型（葡萄糖4500g/L）和低糖型(葡萄糖1000g/L)，高糖型有利于细胞停泊在一个位置生长，适
18、合于生长较快。附着较困难的肿瘤细胞。DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)：由Iscove等人在DMEM基础上增加了许多非必需氨基酸及一些维生素，增加了HEPES，葡萄糖含量为高糖型。适合于细胞密度较低，细胞生长较困难的情况，如杂交瘤细胞的筛选培养，DNA转化后细胞的培养。IMDM(Iscoves modified Dulbeccos medium)：由Moor等人为培养小鼠的白血病细胞而设计，特别适合悬浮细胞，尤其是淋巴细胞的培养，组分较简单，目前配方适合多种细胞的生长。RPMI1640：由Morgan等人为培养鸡胚组织而设计，几乎含有所有氨基酸、维生素、
19、生长激素、核酸衍生物等。109比199效果更好。199、109 medium：由Ham针对小鼠二倍体细胞克隆化培养而设计，并逐步改良后也适合人二倍体细胞的培养，F12在F10配方基础上增加了一些微量元素和无机离子，特别适合进行单细胞分离培养。HamF10、HamF12 medium：由MeCoy 等人专为肉瘤细胞研制的培养液，后发现特别适合原代细胞培养，尤其是较难培养的细胞生长。MeCoys 5A medium：一般以HamF12和DMEM按1:1混合作为基础培养液；在基础培养液中添加促贴壁物质、促生长因子及激素、酶抑制剂、结合蛋白和转运蛋白、微量元素等。无血清培养基：无血清培养基：均不含有动
20、物蛋白；CDM培养基中添加了一些已知结构和功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。无蛋白培养基无蛋白培养基(protein free medium,PFM)限定化学成分培养基限定化学成分培养基(chemical defined medium,CDM)：培养基的选择培养基的选择1 1）建立某种细胞株所用的培养基应是首选，可查阅文）建立某种细胞株所用的培养基应是首选，可查阅文献或向卖家咨询；献或向卖家咨询；2 2）本实验室惯用的培养基，许多培养基可适合于多种）本实验室惯用的培养基，许多培养基可适合于多种细胞；细胞；3 3）根据细胞株的特点、实验的需要选择培养基；）根据细胞株的特点、实验的需要选择培
21、养基；如小鼠细胞株多选如小鼠细胞株多选RPMI1640RPMI1640，进行细胞杂交、转染可选，进行细胞杂交、转染可选IMDMIMDM4 4）用多种培养基分别培养目的细胞，根据其生长状态）用多种培养基分别培养目的细胞，根据其生长状态选择培养基。选择培养基。培养基的配制培养基的配制1 1）认真阅读说明书；说明书中注明干粉中不包含的成分，）认真阅读说明书；说明书中注明干粉中不包含的成分，如如NaHCONaHCO3 3，谷氨酰胺、丙酮酸钠、，谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPESHEPES等等2 2）配制时要保证充分溶解。）配制时要保证充分溶解。NaHCONaHCO3 3、谷氨酰胺等物质要在、谷氨酰胺等物质
22、要在培养基完全溶解后才能添加；培养基完全溶解后才能添加；3 3）配制所用的水为双蒸水或三蒸水，离子浓度很低；）配制所用的水为双蒸水或三蒸水，离子浓度很低；4 4）所用器皿应洁净无菌；）所用器皿应洁净无菌；5 5）配制好的培养基应马上过滤除菌，存于）配制好的培养基应马上过滤除菌，存于-20-20 o oC C或或4 4 o oC C。制备制备1000 ml RPMI-1640培养基培养基 RPMI1640RPMI1640干粉培养基干粉培养基10.4g10.4g（1 1包）包）+蒸馏水蒸馏水 400ml400ml 磁力搅拌至完全溶解磁力搅拌至完全溶解 加三蒸馏水定容至加三蒸馏水定容至1000ml1
23、000ml 滤过除菌，并分装成滤过除菌，并分装成200ml/200ml/瓶，瓶，-20-20冻存冻存酚酚 红红l l大多数培养液中使用酚红作为大多数培养液中使用酚红作为pHpH指示指示(黄黄-红红-紫紫)l l0.40.4酚红溶液酚红溶液：称取称取0.4g0.4g酚红，置玻璃研钵中细研，逐滴加酚红，置玻璃研钵中细研，逐滴加入入0.1mol/L0.1mol/LNaOHNaOH边滴边研至酚红完全溶解，记好边滴边研至酚红完全溶解，记好加加 NaOHNaOH的量，的量，共加共加11.28ml11.28ml，将研好的酚红液用吸管移入烧瓶中加三蒸水，将研好的酚红液用吸管移入烧瓶中加三蒸水88.7288.7
24、2mlml，高压灭菌高压灭菌。l l在一些特殊培养液中不含酚红在一些特殊培养液中不含酚红 哺乳细胞培养液：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）哺乳细胞培养液：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用样作用 流式检测细胞培养液：酚红干扰检测流式检测细胞培养液：酚红干扰检测维持液与生长液维持液与生长液l维持液：合成培养基中不加血清或加低浓度（如维持液：合成培养基中不加血清或加低浓度（如 2 2）血清，仅能维持细胞生存，细胞不能很好）血清，仅能维持细胞生存，细胞不能很好生长。生长。l生长液：合成培养基中加入生长液：合成培养基中加入10-2010-20血清，有利血清，有利于细胞生长。于细胞生长。附附
25、 RPMI-1640生长液和维持液配法生长液和维持液配法 维持液：维持液：RPMI-1640 95 小牛血清 2 谷氨酸胺（100）1 双抗（100）1 用NaHCO3调pH至7.0-7.2。生长液：生长液：RPMI-1640 88 小牛血清 10 谷氨酸胺（100）1 双抗（100）1 用NaHCO3调pH至7.0-7.2。其它培养用液其它培养用液平衡盐溶液平衡盐溶液消化液消化液pHpH调整液调整液抗生素液抗生素液谷氨酰胺补充液谷氨酰胺补充液几种常用的平衡盐溶液的配方几种常用的平衡盐溶液的配方(g/L)BingerPBSTyrodeEarleHanksD-HanksDulbeccoNaCl9
26、.008.008.006.808.008.008.00KCl0.420.200.200.400.400.400.20CaCl20.25-0.200.200.14-0.10MgCl26H2O-0.10-0.10MgSO47H2O-0.200.20-Na2HPO4H2O-1.56-0.060.06-NaH2PO42H2O-0.050.14-1.42KH2PO4-0.20-0.060.060.20NaHCO3-1.002.200.350.35-葡萄糖-1.001.001.00-酚红-0.020.020.020.02胰胰酶酶(trypsin)溶液溶液一般浓度为0.1-0.5%，配制时用平衡盐溶液，溶解
27、的最佳pH是8-9，充分溶解后过滤除菌，可再调整pH至7.5或不调。EDTA溶液溶液一般浓度为0.02%，配制时加碱助溶，可过滤除菌，也可高压灭菌。胶原胶原酶酶溶液溶液一般为0.1-0.3mg/L或20万U/L，最佳pH为6.5，胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS。消化液l常用浓度为常用浓度为0.25%0.25%（0.1%-0.5%0.1%-0.5%）l称取所需胰蛋白酶，用少许称取所需胰蛋白酶，用少许D-HanksD-Hanks液调成糊状液调成糊状l再补足再补足D-HanksD-Hanks液，搅拌混匀，置室温液，搅拌混匀，置室温4h4h或冰或冰箱过夜，不断搅拌振荡箱过夜
28、，不断搅拌振荡l次日，滤过除菌，分装，次日，滤过除菌，分装，-20-20冻存冻存胰蛋白酶液配制胰蛋白酶液配制消化液消化液-EDTA2Na 溶液溶液l一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便而且毒性小，价格低廉，使用方便l常用工作液浓度常用工作液浓度为为0.02%0.02%。注意：使用注意：使用EDTAEDTA处理细胞后，要用平衡盐液处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的冲洗干净，因残留的EDTAEDTA会影响细胞生长会影响细胞生长lEDTAEDTA溶液配制：用溶液配制：用D-HanksD-Hanks液溶解后，高压蒸液溶解
29、后，高压蒸汽灭菌，小瓶分装，汽灭菌，小瓶分装，4 4保存保存pH调整液调整液l l为了营养成分稳定和延长贮存时间，在配制营养液时一般为了营养成分稳定和延长贮存时间，在配制营养液时一般不预先加入不预先加入NaHCONaHCO3 3，而在使用前再加入。故而在使用前再加入。故NaHCONaHCO3 3都是都是单独配制，高压灭菌。单独配制，高压灭菌。l l此外，为了维持培养液恒定的此外，为了维持培养液恒定的pHpH，以利于细胞的生长和增以利于细胞的生长和增殖，还可利用殖，还可利用HepesHepes强缓冲液。强缓冲液。pH调整液调整液-NaHCO3 溶液溶液l l常用浓度为常用浓度为7.5%7.5%。
30、配制时用三蒸水溶解后，滤过除菌或。配制时用三蒸水溶解后，滤过除菌或高压灭菌，分装，高压灭菌，分装，4 4保存保存l l调节调节pHpH时，时，NaHCONaHCO3 3要逐滴加入，并不时摇动培养液，要逐滴加入，并不时摇动培养液，以防止加入过量。当以防止加入过量。当pHpH值过高后，可用灭菌的值过高后，可用灭菌的1010醋酸醋酸溶液或通入溶液或通入COCO2 2气体调节。气体调节。pH调整液调整液-Hepes液液l l一种弱酸，中文名为一种弱酸，中文名为4-4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式为：羟乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式为：C C8 8H H1818O O4 4N N2 2S S，分子量为分子量为2
31、38.31238.31。l l主要作用主要作用:防止培养基防止培养基pHpH迅速变动。迅速变动。l l使用终浓度一般为使用终浓度一般为10-5010-50mmolmmol/L/Ll l常配成常配成1M1M储存液：用储存液：用100ml100ml双蒸水溶解双蒸水溶解23.8g23.8gHepesHepes，滤滤过除菌或高压灭菌，分装小瓶，过除菌或高压灭菌，分装小瓶，4 4保存。使用时可向保存。使用时可向100100mlml培养液中加入培养液中加入1ml1mlHepesHepes储存液，终浓度为储存液，终浓度为1010mmolmmol/L/L青青链链霉素溶液霉素溶液俗称双抗溶液，青霉素对G+菌有效
32、，使用终浓度为10万U/L，链霉素对G-菌有效，使用终浓度为0.1g/L。一般配成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。抗生素液各种抗生素使用情况各种抗生素使用情况抗生素抗生素抗生素抗生素作用对象作用对象作用对象作用对象参考浓度参考浓度参考浓度参考浓度(ug/ml)(ug/ml)稳定性稳定性稳定性稳定性(d)(d)两性霉素B真菌13氨苄青霉素G+，G-1003氯霉素G-55红霉素G+，支原体1003庆大霉素G+，G-，支原体505卡那霉素G+，G-1005制霉菌素真菌503青霉素GG+100IU/ml3链霉素G-1003福利平G-503四环素G+，G-，支原体104使用终浓度为2mM。一般配
33、成100倍浓缩液，配制时加温至30oC，充分溶解后过滤除菌，分装后-20oC储存。谷氨酰胺补充液（二）细胞培养的设备条件l一定的密闭性一定的密闭性l通风透气良好，但不会因此造成室内污染通风透气良好，但不会因此造成室内污染l适合于消毒适合于消毒l方方便便进进出出但但不不会会因因此此而而影影响响无无菌菌室室的的“无无菌菌性性”，保证工作空间的，保证工作空间的“绝对绝对”无菌无菌l一般包括：准备室、培养室和缓冲室一般包括：准备室、培养室和缓冲室无菌室的条件无菌室的条件l准备室：准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培养用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。物质的准备
34、和消毒以及供应物品的保藏等。l培养室：培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的实用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。通风，并具有适宜的光线。l缓冲室：（更衣室）缓冲室：（更衣室）缓冲室缓冲室单间培养实验室布局示意图单间培养实验室布局示意图专用培养实验室布局示意图专用培养实验室布局示意图普通细胞培养室内走廊普通细胞培养室内走廊宽敞的细胞培养区宽敞的细胞培养区l l超净工作台，超净工作台，COCO2 2培养箱，倒置显微镜培养箱，倒置显微镜l l干干燥燥箱箱，滤滤器器，自自动动双双重重纯纯水水蒸蒸馏
35、馏器器，纯纯水水仪仪，压压力力蒸汽消毒器蒸汽消毒器l l离心机及天平离心机及天平l l冰箱，细胞冷冻存储器冰箱，细胞冷冻存储器 (液氮容器或低温冰箱液氮容器或低温冰箱)l l常常用用培培养养器器皿皿：培培养养瓶瓶，培培养养皿皿，多多孔孔培培养养板板，吸吸管管，加样器加样器l l其其它它用用品品：离离心心管管，冻冻存存管管，酸酸缸缸，细细胞胞计计数数板板/仪仪，烧杯，注射器，量筒等烧杯，注射器，量筒等无菌室内的设备无菌室内的设备培养设备 常用培养器皿常用培养器皿玻璃培养器皿为主，一次性培养器皿为辅。玻璃器皿玻璃器皿玻璃瓶、培养瓶、培养皿、移液管和吸管、离心管、其它塑料器皿塑料器皿培养瓶、培养皿、
36、多孔培养板、移液管、离心管、注射器、其它超净工作台超净工作台(clean bench)利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气以微流方式徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。注意检查是否堵塞！（看酒精灯）外流式（基本不用）侧流式 直流式 超净工作台结构和模式图超净工作台结构和模式图 生物安全柜生物安全柜CO2培养箱培养箱nCO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37，5CO2，85%湿度。湿度。n使用使用CO2培养箱培养细胞时应注培养箱培养细胞时应注意的问题：意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净，定期消毒（紫外
37、线、酒精）。箱内水槽中加灭菌蒸馏水3 L以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。学生正在进行细胞观察学生正在进行细胞观察倒置显微镜倒置显微镜 倒置显微镜倒置显微镜 用于烘干和干热消毒玻璃器皿（用于烘干和干热消毒玻璃器皿（160 ，2 h）。）。电热干燥箱电热干燥箱滤滤 器器Zeiss滤器：过滤除菌，大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌自动双重纯水蒸馏器自动双重纯水蒸馏器 纯水仪纯水仪紫外灯紫外灯 紫外线消毒。紫外线消毒。主要用于培养室空主要用于培养室空气、操作台、塑料气、操作台、塑料培养皿和培养板等培养皿和培养板等表面消毒表面消毒大容量高压蒸汽灭菌器大容量高压蒸汽灭菌器 全自
38、动手提式灭菌器全自动手提式灭菌器 移液器移液器含有两个室，每个室被划分为含有两个室，每个室被划分为9 9个方阵，其中个方阵，其中4 4个方阵有个方阵有1616个小个小方格，为方格，为0.1 mm0.1 mm3 3 或或 1 1 1010-4-4 mlml，细胞浓度取决于已知体积中，细胞浓度取决于已知体积中的细胞数。的细胞数。细胞计数板细胞计数板精密精密pHpH计计 微孔板震荡器微孔板震荡器磁力搅拌器磁力搅拌器高速离心机高速离心机 超速离心机超速离心机 液氮罐液氮罐四四、细胞培养物的污染及防止、细胞培养物的污染及防止凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都应视为污染。污染对细
39、胞的影响污染对细胞的影响 l根据污染物和污染程度的不同，对细胞的影响不同l在细胞受有害物污染时间短、污染程度轻、并能及时排除污染物的情况下，细胞有可能恢复。l当污染物持续存在于培养环境中时，轻者细胞增殖生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强，重者细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。无无 毒毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。无污染无污染不同细胞类型的交叉污染微生物的污染细菌霉菌支原体等空气/器材/操作/血清/组织样本污染途径污染途径污染来源污染来源l不洁的动物组织标本不洁的动物组织标本不洁的动物组织标本不洁
40、的动物组织标本n n很很多多动动物物组组织织本本该该是是无无菌菌的的，但但取取材材时时不不小小心心也也会会有有污污染染的的机机会会。组组织织本本身身含含有有细细菌菌，如如取取材材时时不不用用浓浓的的抗生素洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。抗生素洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。l空气空气空气空气n n如如果果操操作作室室与与外外界界隔隔离离不不严严或或消消毒毒不不充充分分，很很容容易易造造成成污污染染。另另外外，净净化化工工作作台台使使用用过过久久，滤滤板板未未定定期期更更换换或或长长久久不不更更换换，滤滤网网受受尘尘埃埃堵堵塞塞，工工作作时时不不带带口口罩罩或或外外界界气气流流过过强
41、强，污污染染空空气气进进入入操操作作区区，也也会会导导致致污污染染。春春夏夏季季南南方方地地区区多多雨雨，空空气气湿湿度度大大，含含菌菌量量多多，工作不注意也易污染。工作不注意也易污染。污染来源污染来源l清洗消毒清洗消毒清洗消毒清洗消毒n n培培养养用用物物品品、材材料料洗洗刷刷不不净净，灭灭菌菌不不彻彻底底也也会会引引入入微微生物和有毒物质。生物和有毒物质。l操作操作操作操作 -来自操作者的污染主要有以下几方面：来自操作者的污染主要有以下几方面：来自操作者的污染主要有以下几方面：来自操作者的污染主要有以下几方面：n n器器材材和和溶溶液液使使用用前前未未仔仔细细检检查查是是否否污污染染过过，
42、或或者者是是否否已已经经消消毒毒灭灭菌菌处处理理过过，或或者者虽虽经经处处理理，时时隔隔已已久久又又末末重新处理重新处理n n操作者未戴口罩、帽子，呼气中排出细菌和支原体。操作者未戴口罩、帽子，呼气中排出细菌和支原体。n n培养瓶口未用培养瓶口未用75%75%酒精擦和烧灼酒精擦和烧灼n n操操作作者者不不当当心心，动动作作不不正正确确而而将将吸吸管管或或无无菌菌器器具具碰碰到到了污染的物品，如手上皮肤和瓶子外壁等了污染的物品，如手上皮肤和瓶子外壁等n n操作者操作时大声说话，来回走动扬起灰尘等操作者操作时大声说话，来回走动扬起灰尘等污染的类型污染的类型 -细菌污染细菌污染l细菌污染是实验室细胞
43、培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。l最常见的有G+菌，其中又以白色葡萄球菌较常见，其次枯草杆菌，大肠杆菌、假单胞菌等G-菌。l受细菌污染后，培养液会出现变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。污染的类型污染的类型 -真菌污染真菌污染l l真真菌菌污污染染是是细细胞胞培培养养过过程程中中最最常常见见的的一一种种，尤尤其其在在霉霉雨雨季季节节进进行行细细胞胞培培养养更更易易污污染染。
44、最最常常见见的的真真菌菌有有烟烟曲曲霉霉、黑黑曲曲菌菌、孔孔子子霉霉、毛毛霉霉菌菌、白色念珠菌和酵母菌。白色念珠菌和酵母菌。l l培培养养细细胞胞受受真真菌菌污污染染后后，可可见见培培养养液液中中漂漂浮浮着着白白色色或或浅浅黄黄色色的的小小点点，有有的的散散在在生生长长，培培养养液液一一般般不不发发生生混混浊浊；倒倒置置显显微微镜镜下下可可见见丝丝状状、管管状状或或树树枝枝状状的的菌菌丝丝纵纵横横交交错错在在细细胞胞之之间间或或培培养养基基中中，有有的的呈呈链链状状排排列列。念念珠珠菌菌和和酵酵母母菌菌呈呈卵卵圆圆形形散散在在细细胞胞周周边边和和细细胞胞之之间间。个个体体细细小小，有有增增多多
45、趋趋势势。镜镜下下看看时时，要要将将培培养养瓶瓶用用酒酒精精棉棉球球擦擦干干净净，以以防防止止与与瓶瓶外外尤尤其其瓶瓶底底外外面面生生长长的的菌菌丝丝相相混混淆淆。真真菌菌污污染染后后，细细胞胞生生长长变变慢慢，但但最最后后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。污染的类型污染的类型 -病毒污染病毒污染l l用组织细胞培养法生产疫苗，如没有除去潜在病毒的组用组织细胞培养法生产疫苗，如没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于培养中已发现不少于2020种血清性病毒。种
46、血清性病毒。尽管病毒污染的尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍。若二倍体细胞系有体细胞系有SV40SV40或多发瘤病毒，或多发瘤病毒，B B淋巴细胞含淋巴细胞含EBEB病毒，病毒，细胞会发生变异、转化，形成异倍体细胞系。细胞会发生变异、转化，形成异倍体细胞系。l l潜在病毒是细胞大量生产疫苗、干扰素等生物制品中的潜在病毒是细胞大量生产疫苗、干扰素等生物制品中的难题。难题。污染的类型污染的类型 -支原体污染支原体污染l l培培养养细细胞胞受受支支原原体体污污染染后后，部部分分敏敏感感细细胞胞可可见见细细胞胞生生长长增增殖殖变变慢慢
47、，部部分分细细胞胞变变圆圆，从从瓶瓶壁壁脱脱落落。但但多多数数细细胞胞污污染染后后无无明明显显变变化化，或或略略有有变变化化，若若不不及及时时处处理理，还还会会产产生交叉污染。生交叉污染。污染的类型污染的类型 -非同种细胞污染非同种细胞污染l l由由于于细细胞胞培培养养操操作作时时各各细细胞胞株株所所需需的的器器材材和和溶溶液液没没有有严严格格分分开开，操操作作不不当当，往往往往会会使使一一种种细细胞胞被被另另一一种种细细胞胞污污染。染。真菌真菌感染 支原体污染污染 电镜照片 细菌污染污染荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体扫描电镜
48、法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体污染的鉴别污染的鉴别-细菌、真菌污染的检测细菌、真菌污染的检测l l肉肉肉肉眼眼眼眼观观观观察察察察 细细菌菌、真真菌菌污污染染常常在在传传代代、换换液液、加加样样等等开开放放性性操操作作之之后后发发生生，而而且且增增生生迅迅速速，若若有有污污染染，在在4848小小时时内内可可明明显显观观察察到到。如如培培养养液液变变混混浊浊，或或略略加加振振荡有很多漂浮物漂起。荡有很多漂浮物漂起。l l镜镜镜镜下下下下观观观观察察察察 在在倒倒置置显显微微镜镜的的高高倍倍镜镜下下可可见见培培养养液液中中有有大大量量圆圆球球状状颗颗粒粒漂漂浮浮，即即为为细细菌菌
49、污污染染。若若细细胞胞之之间间有有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。l l接接接接种种种种观观观观察察察察 采采用用普普通通肉肉汤汤接接种种或或用用未未加加双双抗抗药药物物的的培培养液接种，也可发现是否有污染。养液接种，也可发现是否有污染。污染的鉴别污染的鉴别-支原体污染的检测支原体污染的检测l相相差差显显微微镜镜观观察察 将将细细胞胞接接种种于于事事先先放放置置于于培培养养瓶瓶内内的的支支持持物物(一一般般用用长长形形盖盖玻玻片片)，2424小小时时后后取取出出支支持持物物，用用相相差差油油镜镜观观察察；若若不不用用支支持持物物培培养养法
50、法，直直接接取取少少许许培培养养液液滴滴在在载载物物片片上上，再再盖盖上上盖盖片片观观察察亦亦可可。支支原原体体在在镜镜下下呈呈暗暗色色微微小小颗颗粒粒，多多位于细胞与细胞之间。位于细胞与细胞之间。污染的鉴别污染的鉴别-支原体污染的检测支原体污染的检测l l荧荧光光染染色色法法观观察察 荧荧光光染染料料Hoechst33258Hoechst33258能能与与DNADNA特特异异地地结结合合，可使支原体内的可使支原体内的DNADNA着色，荧光显微镜观察。着色，荧光显微镜观察。l l染染色色方方法法：将将细细胞胞接接种种在在盖盖片片上上，在在细细胞胞汇汇合合前前取取出出玻玻片片，用用不不含含酚酚红