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1、细胞培养基础知识肿 瘤 个 人 精 准 医 疗一、细胞培养简介以及相关概念一、细胞培养简介以及相关概念二、细胞培养所需的环境二、细胞培养所需的环境三、细胞培养所需的设备三、细胞培养所需的设备四、细胞培养涉及的相关技术四、细胞培养涉及的相关技术肿 瘤 个 人 精 准 医 疗一、细胞培养简介以及相关概念一、细胞培养简介以及相关概念细胞培养胞培养：指从动物或植物中取出细胞，然后使其在合适的人工环境中生长。这些细胞可于培养 前直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离，或者也可来自已经建立的细胞 系或细胞株。原代培养：原代培养：指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增殖直到占据所有可用基质的培养阶
2、 段，确切定义为首次成功地传代培养之前的培养为原代培养。细胞系：细胞系：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。细胞株：细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或标志，并能稳定保 持这些特性的培养物为细胞株。传代：传代：将细胞从一个培养器皿中转移或移植到另一个培养器皿中即称为传代或传代培养也称再培 养。1、概念、概念肿 瘤 个 人 精 准 医 疗一、细胞培养简介以及相关概念一、细胞培养简介以及相关概念2、分型、分型 根据离体细胞在瓶皿中生长时是否贴附的性质，将其分为贴附型和悬浮型两类根据离体细胞在瓶皿中生长时是否贴附的性质，将其分为贴附型和悬浮型两类 1、贴附型细胞贴附
3、型细胞 培养细胞需贴附在支持物上地长，大多数细胞属此型。培养细胞需贴附在支持物上地长，大多数细胞属此型。（1）上皮细胞型：）上皮细胞型：细胞呈多角形，尺寸更为规则，贴附在基质上呈散在 斑片状生长。肿 瘤 个 人 精 准 医 疗一、细胞培养简介以及相关概念一、细胞培养简介以及相关概念2、分型、分型（2）成）成纤维细胞型：胞型：细胞呈梭形或不规则三角形，中间有卵圆形胞核，胞质向 外伸出长短不一的突起，细胞呈放射状、火焰状或旋涡 状排列走行。肿 瘤 个 人 精 准 医 疗（3）游走型）游走型细胞：胞：此型细胞的细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走与变形运动，只附于支持物上散在生长，一般不连续成片。但
4、此型细胞形态很不 稳定有时与其他型细脑难以区别。见外，有些组织和细胞如神经 细胞有时呈多角形，井伸出较长的神经纤维，难以确定其规律和稳 定的形态，届多形细胞型，也可并入此细胞型。一、细胞培养简介以及相关概念一、细胞培养简介以及相关概念2、分型、分型肿 瘤 个 人 精 准 医 疗一、细胞培养简介以及相关概念一、细胞培养简介以及相关概念2、分型、分型悬浮型浮型细胞：胞：某些细胞在瓶皿中生长时不贴壁，呈悬浮状态，称无贴壁依赖性淋巴母细胞群淋巴母细胞群肿 瘤 个 人 精 准 医 疗二、细胞培养所需的环境二、细胞培养所需的环境1、概述、概述细胞培养所需的环境可以分为：供细胞繁殖生长所处的内部环境和操作细
5、胞所细胞培养所需的环境可以分为：供细胞繁殖生长所处的内部环境和操作细胞所 处的外部环境两个部分。处的外部环境两个部分。内部环境：基本营养物质、促细胞生长因子等内部环境：基本营养物质、促细胞生长因子等外部环境：温度、外部环境：温度、PH值、渗透压、实验室洁净度等值、渗透压、实验室洁净度等肿 瘤 个 人 精 准 医 疗二、细胞培养所需的环境二、细胞培养所需的环境1、内部环境、内部环境基本营养物质基本营养物质:包括氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子。包括氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子。1、氨基酸是组成蛋白质的基本单位，培养细胞时有、氨基酸是组成蛋白质的基本单位，培养细胞时有12种氨基
6、酸是必种氨基酸是必 需的，另外尚需谷氨酞胺。需的，另外尚需谷氨酞胺。2、维生素是维持细胞生长的生物活性物质。、维生素是维持细胞生长的生物活性物质。3、碳水化合物提供细胞的能源，其中主要的是葡萄糖。、碳水化合物提供细胞的能源，其中主要的是葡萄糖。4、培养细胞的生长尚需要钠、钾、镁、钙、磷等基本的天机离子些、培养细胞的生长尚需要钠、钾、镁、钙、磷等基本的天机离子些 都是细胞组成所必需并参与细胞的代谢。都是细胞组成所必需并参与细胞的代谢。促细胞生长因子：体外培养细胞既需要上述基本营养物质还需要促细胞生长因子等促细胞生长因子：体外培养细胞既需要上述基本营养物质还需要促细胞生长因子等 物质才能正常生长、
7、增殖。物质才能正常生长、增殖。1、血清、血清 2、根据培养细胞用于的目的不同加入不同的细胞因子进行刺激如：、根据培养细胞用于的目的不同加入不同的细胞因子进行刺激如：IL-3:促进粒细胞、巨噬细胞其他类型细胞生长促进粒细胞、巨噬细胞其他类型细胞生长 GM-CSF:刺激于细胞分裂及分化为粒细胞及巨噬细胞刺激于细胞分裂及分化为粒细胞及巨噬细胞肿 瘤 个 人 精 准 医 疗二、细胞培养所需的环境二、细胞培养所需的环境1、外部环境、外部环境满足营养的需要以外，培养环境还必须具备细胞生存并繁殖的生理学能接受限满足营养的需要以外，培养环境还必须具备细胞生存并繁殖的生理学能接受限度内的物理化学特性，包括温度、
8、气相及度内的物理化学特性，包括温度、气相及PH等。等。1、温度：体外培养的细胞需在保持一定恒温的环境中才能生长，其适宜的、温度：体外培养的细胞需在保持一定恒温的环境中才能生长，其适宜的 温度与取材的动物种类有关。温度与取材的动物种类有关。哺乳动物包括人类体外培养细胞的理想温度：哺乳动物包括人类体外培养细胞的理想温度：3537 鸟类：鸟类：36.5-38.5 2、气相及、气相及PH：体外培养细胞需要理想的气体环境。包括：体外培养细胞需要理想的气体环境。包括O2及及CO2，但其量须，但其量须 恰当，其气体环境一般应为恰当，其气体环境一般应为5 CO2+95空气的混合气体。空气的混合气体。多数细胞适
9、于在多数细胞适于在pH 7.27.4条件下生长，低于条件下生长，低于PH 6.8或高于或高于 PH 7.6可能对细胞有害，甚至退变或死亡。可能对细胞有害，甚至退变或死亡。3、渗透压：多数培养细胞对渗透压有一定范围的耐受能力，理想的渗透压、渗透压：多数培养细胞对渗透压有一定范围的耐受能力，理想的渗透压 因细胞的类型及种族而异。因细胞的类型及种族而异。肿 瘤 个 人 精 准 医 疗三、细胞培养所需的设备三、细胞培养所需的设备1、基本设备、基本设备 超净工作台超净工作台CO2培养箱培养箱肿 瘤 个 人 精 准 医 疗三、细胞培养所需的设备三、细胞培养所需的设备1、基本设备、基本设备 离心机离心机 恒
10、温水浴锅恒温水浴锅 立式压力灭菌锅立式压力灭菌锅锅锅肿 瘤 个 人 精 准 医 疗三、细胞培养所需的设备三、细胞培养所需的设备1、基本设备、基本设备 冰箱冰箱 倒置显微镜倒置显微镜肿 瘤 个 人 精 准 医 疗三、细胞培养所需的设备三、细胞培养所需的设备2、其他用品、其他用品 培养瓶培养瓶 培养皿培养皿 多孔板多孔板肿 瘤 个 人 精 准 医 疗三、细胞培养所需的设备三、细胞培养所需的设备2、其他用品、其他用品 手手动移液移液枪 电动移液枪电动移液枪肿 瘤 个 人 精 准 医 疗三、细胞培养所需的设备三、细胞培养所需的设备3、试剂、试剂 RPMI1640 GTT551 DPBS缓冲液缓冲液肿
11、瘤 个 人 精 准 医 疗四、细胞培养涉及的相关技术四、细胞培养涉及的相关技术1、无菌操作、无菌操作无菌操作技术分为三个部分：工作环境以及表面的处理，细胞培养所用玻璃及塑无菌操作技术分为三个部分：工作环境以及表面的处理，细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理以及培养液与培养细胞的处理。料制品的处理以及培养液与培养细胞的处理。1、工作工作环境以及表面的境以及表面的处理：使用理：使用层流超流超净工作台，工作台，实验前无菌室以及无菌前无菌室以及无菌 操作台用紫外灯照射不少于操作台用紫外灯照射不少于30min,用用75%酒精擦拭无菌台面，开启无菌操作酒精擦拭无菌台面，开启无菌操作 台台风机机10min开始操
12、作。开始操作。2、细胞培养所用玻璃及塑料制品的胞培养所用玻璃及塑料制品的处理：一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷理：一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷 洗、浸酸、冲洗四个步洗、浸酸、冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿不。清洗后的玻璃器皿不仅要求干要求干净透透彻无油迹，无油迹，而且不能有任何残留物而且不能有任何残留物质。3、培养液与培养培养液与培养细胞的胞的处理：理：选用用质量可靠品牌的培养基。量可靠品牌的培养基。肿 瘤 个 人 精 准 医 疗四、细胞培养涉及的相关技术四、细胞培养涉及的相关技术2、细胞存储、细胞存储冷冻保存：在低于冷冻保存：在低于-70的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其的超低温条
13、件下，有机体细胞内部的生化反应极其 缓慢，甚至终止。因此采取适当的方法将生物材料将至超低温，缓慢，甚至终止。因此采取适当的方法将生物材料将至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不刷老死亡。当以适当方法将即可使生命活动固定在某一阶段而不刷老死亡。当以适当方法将 冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。向将要冻存的细脑中加入陈存液，内含向将要冻存的细脑中加入陈存液，内含10甘油或二甲亚砜可降甘油或二甲亚砜可降 低冰点，减少细胞内外冰晶的形成，从而降低了细胞在冻存过程低冰点，减少细胞内外冰晶的形成，从而降低了细胞在冻存过程 中
14、的损伤程度。细胞可在中的损伤程度。细胞可在-70冰箱或液氮罐中长期保存。冰箱或液氮罐中长期保存。肿 瘤 个 人 精 准 医 疗四、细胞培养涉及的相关技术四、细胞培养涉及的相关技术3、细胞计数、细胞计数 细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞数目，以调整植入的细胞浓细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞数目，以调整植入的细胞浓度和测定细胞的增殖速度。首先选取待测细胞悬液度和测定细胞的增殖速度。首先选取待测细胞悬液0.1ml，加缓冲液，加缓冲液0.9ml。混匀后滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法，于低倍镜下。混匀后滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法，于低倍镜下计数凹角的计数凹角的4个大方格内的细胞。计数过
15、程中，对大方格的边缘压线个大方格内的细胞。计数过程中，对大方格的边缘压线细胞按数上不数下、数左不数右的原则进行计数。计数时，两次重细胞按数上不数下、数左不数右的原则进行计数。计数时，两次重复计算误差不应超过复计算误差不应超过l0，细胞浓度按下列公式计算：，细胞浓度按下列公式计算：肿 瘤 个 人 精 准 医 疗四、细胞培养涉及的相关技术四、细胞培养涉及的相关技术4、污染、污染细胞培养物胞培养物污染往往是染往往是细胞培养胞培养实验室最常遇到的室最常遇到的问题，有，有时会会带来十分来十分严重的后果。重的后果。细胞培养胞培养污染物主要分染物主要分为两两类，一，一类是化学是化学污染物，例如：培养染物，例
16、如：培养基、血清和水中的基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑、内毒素、增塑剂和去和去污剂，另一，另一类是生物是生物污染物，染物，例如：例如：细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉胞系的交叉污染。尽管染。尽管无法无法彻底消除底消除污染，但是可以通染，但是可以通过充分了解充分了解污染源以及采用良好的无菌技染源以及采用良好的无菌技术，降低降低污染染发生的生的频率和率和严重程度。此部分将概括介重程度。此部分将概括介绍主要的几种生物主要的几种生物污染染。肿 瘤 个 人 精 准 医 疗四、细胞培养涉及的相关技术四、细胞培养涉及的相关技术4、污染、污染细菌污染：
17、细菌污染：培养培养细胞受胞受细菌菌污染后，会出染后，会出现培养液培养液变混混浊，pH改改变而呈而呈现黄黄 色，色，污染后染后细胞胞发生病理改生病理改变，胞内，胞内颗粒增多、增粗，最后粒增多、增粗，最后变圆脱脱 落死亡，造成落死亡，造成试验失。失。贴壁生长的 293 细胞被大肠杆菌污染 肿 瘤 个 人 精 准 医 疗四、细胞培养涉及的相关技术四、细胞培养涉及的相关技术4、污染、污染真菌真菌污染：培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生染：培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不，培养液一般不 发生混生混浊；倒置；倒置显微微镜下可下可见丝状、管状或状、管状或树枝状的菌枝状的菌丝纵横交横交错在在 细胞之胞之间或培养基中，有的呈或培养基中，有的呈链状排列，状排列，细胞生胞生长变慢，最后由于慢，最后由于营 养耗尽及毒性作用而使养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。胞脱落死亡。肿 瘤 个 人 精 准 医 疗四、细胞培养涉及的相关技术四、细胞培养涉及的相关技术4、污染、污染支原体支原体污染：培养染：培养细胞受支原体胞受支原体污染后，部分敏感染后，部分敏感细胞可胞可见细胞生胞生长增殖增殖变慢，慢，部分部分细胞胞变圆，从瓶壁脱落。但多数，从瓶壁脱落。但多数细胞胞污染后无明染后无明显变化，化，或或 略有略有变化，若不及化，若不及时处理，理，还会会产生交叉生交叉污染。染。谢谢