分子生物学精选课件.ppt

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1、关于分子生物学第一页，本课件共有114页载体的概念载体的概念：1.要要把把一一个个有有用用的的基基因因（目目的的基基因因研研究究或或应应用用基基因因）通通过过基基因因工工程程手手段段送送到到生生物物细细胞胞（受受体体细细胞胞），需需要要运运载载工工具具（交交通通工工具具）携携带带外外源源基基因因进进入入受受体体细细胞胞，这种运载工具就叫做这种运载工具就叫做载体载体（vector）。）。2.将将外外源源DNA或或基基因因携携带带入入宿宿主主细细胞胞（hostcell）的的工具称为工具称为vector。3.基基因因工工程程所所用用的的vector实实际际上上是是DNA分分子子，常用的克隆载体：质粒

2、、噬菌体和病毒。常用的克隆载体：质粒、噬菌体和病毒。第二页，本课件共有114页载体具备的特点载体具备的特点1、至少有一个复制起点，因而至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复至少可在一种生物体中自主复制。制。2、具备合适的酶切位点，以供具备合适的酶切位点，以供外源外源DNA插入。插入。3、至少应有一个遗传标记基因，至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组以指示载体或重组DNA分子是分子是否进入宿主细胞。否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高、具有较小的分子量和较高的拷贝数。的拷贝数。注：前三个特点必不可少注：前三个特点必不可少。第三页，本课件共有114页载体的分类载体的分类分类

3、依据分类依据类类别别克隆扩增或表达克隆扩增或表达举举例例1.按功能分成按功能分成（1）克隆载体）克隆载体（2）表达载体）表达载体PBR322PCDN32.按进入受体细胞类型按进入受体细胞类型分分（1）原核载体）原核载体（2）真核载体）真核载体（3）穿梭载体）穿梭载体PUC8PBUDCE41YE3.按载体来源分按载体来源分病毒载体病毒载体4.按克隆片段得大小按克隆片段得大小（克隆能力）分（克隆能力）分(1)1kb(2)10kb(3)22kb(4)激激 活活 P（启启动动子子）促促 进进转录转录阻阻遏遏物物R调节基因调节基因R编编码码产产物物产产生生阻阻遏遏蛋蛋白白结结合合在在O上上（操操纵纵基基

4、因因）阻止转录阻止转录存在乳糖时存在乳糖时乳糖乳糖结合阻遏蛋白结合阻遏蛋白解除对转录阻遏解除对转录阻遏开始转录开始转录2 Lacuv5是是一一个个突突变变乳乳糖糖操操纵子纵子IPIG是是半半乳乳糖糖苷苷酶酶底底物物类类似似物物它它 能能 与与阻阻遏遏蛋蛋白白结结 合合 使使 O成成 游游离状态离状态对分解代谢对分解代谢抑制不敏感抑制不敏感即使没即使没有有CAPcAMP转录照常进转录照常进行行据报首据报首Lac组建载体组建载体在原核细胞表达时在原核细胞表达时IPTG可提高真核基可提高真核基因表达水平因表达水平50倍。倍。第三十八页，本课件共有114页名称名称来源来源组成组成正调控正调控负调控负调

5、控备注备注3Trp从从 E.coli色色氨氨酸酸操操纵纵子子分离分离（1）Pg（启启动动基基因因）；（2）R（制制动动基基因因）；（3）O（操操纵纵基基因因）；（4）SE（色色氨氨酸酸Trp部分结构基因）。部分结构基因）。吲吲哚哚丙丙烯烯酸酸是是Trp的的竞竞争争性性抑抑制制剂剂它它能能与与阻阻遏遏蛋蛋白白结结合合 阻阻 止止 了了 Trp与与之之结结合合而而活活化化使转录进行使转录进行调节基因产生阻调节基因产生阻遏蛋白，结合遏蛋白，结合Trp有活性有活性再结合再结合在在O上阻止转录上阻止转录缺乏缺乏Trp阻遏阻遏蛋白不能活化蛋白不能活化去阻遏去阻遏据报道据报道吲哚吲哚丙烯酸在转录水丙烯酸在转

6、录水平至少可以增强平至少可以增强50倍倍，另外制，另外制动基因缺乏可提动基因缺乏可提高转录水平高转录水平810倍倍4Tac（TrpLac）人人工工构构建建的的TrpLac杂合启动子杂合启动子（1）tac=Trp-35+Lacuv5-20；（2）tacTrp-35一一个个合合成成的的46bp片片段段；包包 括括 pribrow合合 和和LacO（3）tac12Trp35Lac10区区，操操纵纵基基因因O部部分分，SD顺顺序融合而成。序融合而成。IPIG诱导诱导受受Lac阻阻遏遏物物的的调调控控（1）比比Lacuv5强强7倍倍；（2）受受体体菌菌有有RB791，XLblue，SB221，JM109

7、等。等。5。T7噬噬菌菌体体启动子启动子带带有有Lacuv5启启动动子子控控制制的的T7噬噬菌菌体体RNApol基因基因IPIG诱导诱导（1）比比Lacuv5强强7倍倍；（2）受受体体菌菌有有RB791，XLblue，SB221，JM109等。等。第三十九页，本课件共有114页6.核糖体结合位点核糖体结合位点/起始密码起始密码/SD序列（序列（Rbs/AGU/SDs）mRNA有有核核糖糖体体的的两两个个结结合合位位点点，对对于于原原核核而而言言是是AUG（起起始始密密码码）和和SD序序列列（位位于于AUG上上游游311bp处处由由39bp组组成成的的序序列列。这这段段序序列列富富含含嘌嘌呤呤核

8、核苷苷酸酸，刚刚好好与与16sRNA富富含含嘧嘧啶啶的的序序列列互互补补，是是RNA识识别别和和结结合合的位点。由于的位点。由于J.shineLDagarne（1974）首先发现，故名。）首先发现，故名。mRNA5-AGGAGGUUGACCUAUG-3-AUCCUCCUAG,-rRNA的的3末端末端（1）翻翻译译水水平平的的调调控控是是不不严严格格的的，只只有有mRNA/Rbs结结合合才才是是蛋蛋白白质质合合成成的的关关键。（键。（Rbs是是E.coli表达载体必不可少的元件）。表达载体必不可少的元件）。（2）不不同同的的启启动动子子表表达达一一种种pr.时时，SDAUG之之间间的的距距离离可

9、可能能是是不不一一样样的的，在试图提高表达效率，在试图提高表达效率，SDAUG之间的距离是重视的因素之一。之间的距离是重视的因素之一。第四十页，本课件共有114页7转转录录终终止止顺顺序序（终终止止子子）/翻翻译译终终止止密密码码子子（terminatorotranscrition，termterminatoroftranslation,terminatorcodon,stopcodon）：）：（1）转转录录终终止止子子/term指指一一个个基基因因编编码码区区downstream的的DNA顺顺序序，可可被被RNApol识识别别为为停停止止合合成成mRNA的的信信号号。原原核核生生物物中中，在

10、在转转录录部部分分末末端端term常常有有一一个个IR和紧接着的一小段，基因转录部分之外可能还有影响转录终止的顺序。值得注意的是：和紧接着的一小段，基因转录部分之外可能还有影响转录终止的顺序。值得注意的是：有有些些载载体体不不含含终终止止序序列列，表表达达外外源源蛋蛋白白质质时时也也可可获获得得较较满满意意的的结结果果（基基因因转转录录之外顺序可影响转录终止）；之外顺序可影响转录终止）；多数外源蛋白质表达载体带有合适的终止顺序；多数外源蛋白质表达载体带有合适的终止顺序；转录终止顺序有长有短，短的长约转录终止顺序有长有短，短的长约700800bp。（2）翻译终止密码子）翻译终止密码子/termi

11、natorcodonmRNA种种三三个个核核苷苷酸酸顺顺序序可可终终止止蛋蛋白白质质的的合合成成，有有3种种终终止止码码：UAA（赫赫石石型型）UAG（琥珀型）和（琥珀型）和UAG（空白型）（参（空白型）（参nonsensemutationsupperessor。）。）第四十一页，本课件共有114页三三种种表表达达型型载载体体结结构构图图第四十二页，本课件共有114页显然显然,不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之供。换言之,被表达的外源基因一旦确定被表达的外源基因一旦确定,表达载体的表达载体的类型也就确定了。类型也就确定了。4)用途用途

12、:a.表达外源基因以产生大量外源基因产物表达外源基因以产生大量外源基因产物b.用于构建用于构建cDNA文库文库第四十三页，本课件共有114页第四十四页，本课件共有114页第四十五页，本课件共有114页第四十六页，本课件共有114页分子克隆载体的选择分子克隆载体的选择选择克隆载体的几个重要参数选择克隆载体的几个重要参数（1 1）实验对象）实验对象 （2 2）实验性质）实验性质（3 3）载体容量）载体容量（4 4）合适克隆位点）合适克隆位点（5 5）载体的稳定性）载体的稳定性（6 6）载体）载体DNADNA制备的难易制备的难易（7 7）外源基因表达产物产量、产物特点等）外源基因表达产物产量、产物特

13、点等第四十七页，本课件共有114页3.2 3.2 噬菌体载体噬菌体载体（BacteriophageBacteriophage，简称，简称phagephage）第四十八页，本课件共有114页l噬菌体噬菌体(bacteriophage,phage)(bacteriophage,phage)：是感染细菌、真菌、是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。放线菌或螺旋体等微生物的病毒。l噬菌体具有病毒的一些特性：噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小，可以通过滤个体微小，可以通过滤菌器；没有完整的细胞结构，主要由蛋白质构成的衣菌器；没有完整的细胞结构，主要由蛋白质构成的衣壳和包含于其中的核酸组成；只能

14、在活的微生物细胞壳和包含于其中的核酸组成；只能在活的微生物细胞内复制增值，是一种专性细胞内寄生的微生物。内复制增值，是一种专性细胞内寄生的微生物。l噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应的噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应的噬菌体的存在。噬菌体的存在。第四十九页，本课件共有114页第五十页，本课件共有114页一、一、噬菌体的一般生物特性噬菌体的一般生物特性 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：1 1、保护自己的核苷酸分子（、保护自己的核苷酸分子（DNADNA、RN

15、ARNA）免遭环）免遭环境化学物质的破坏；境化学物质的破坏；2 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；3 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒；而长生出大量的子代噬菌体颗粒；4 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒第五十一页，本课件共有114页1.1.噬菌体的结构和其核酸类型噬菌体的结构和其核酸类型：结构：结构：无尾部结构的二十面体型、无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、线状体型线状体

16、型 核酸类型：最常见的是双链线性核酸类型：最常见的是双链线性DNADNA、双链环形双链环形DNADNA、单链环形单链环形DNADNA、单链线形单链线形DNADNA、单链单链RNARNA。第五十二页，本课件共有114页不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。大分子量的噬菌体生命周期也是比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂；对寄主的依赖性较低。比较复杂；对寄主的依赖性较低。有些噬菌体的有些噬菌体的DNADNA碱基不是由标准的碱基不是由标准的A/T/C/GA/T/C/G组成的。组成的。T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA没有没有C C碱基，取代的是碱基

17、，取代的是5-5-羟甲基胞嘧啶羟甲基胞嘧啶（HMCHMC）;SP01;SP01噬菌体噬菌体DNADNA中没有中没有T T碱基，取代的是碱基，取代的是5-5-羟甲羟甲基尿嘧啶（基尿嘧啶（HMUHMU）。）。第五十三页，本课件共有114页2.2.噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的溶菌生命周期 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期；噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期；只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1 1、吸附、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上吸附到位于感染细胞表面的特殊接受

18、器上2 2、注入、注入 噬菌体噬菌体DNADNA穿过细胞壁注入寄主细胞穿过细胞壁注入寄主细胞3 3、转变、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所4 4、合成、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质5 5、组装、组装 包装了包装了DNADNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒头部和尾部组装成噬菌体的颗粒6 6、释放、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来 第五十四页，本课件共有114页第五十五页，本课件共有114页l在液体培养基中，噬菌现象可使浑浊菌液变得澄清。在液体培养基中，噬菌现

19、象可使浑浊菌液变得澄清。l在固体培养基上，若用适量的噬菌体和宿主菌液混合后接种培在固体培养基上，若用适量的噬菌体和宿主菌液混合后接种培养，培养基表面可有透亮的溶菌空斑出现。一个空斑系由一个养，培养基表面可有透亮的溶菌空斑出现。一个空斑系由一个噬菌体复制增殖并裂解细菌后形成，称为噬菌体复制增殖并裂解细菌后形成，称为噬斑噬斑(plaque),不同噬不同噬菌体噬斑的形态与大小不尽相同。菌体噬斑的形态与大小不尽相同。噬斑噬斑荧光假单胞菌荧光假单胞菌第五十六页，本课件共有114页3.3.噬菌体的溶源生命周期噬菌体的溶源生命周期 溶源生长周期：溶源生长周期：是指在感染过程中没有产生出子代是指在感染过程中没

20、有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的噬菌体颗粒，噬菌体的DNADNA是整合到寄主细胞染色是整合到寄主细胞染色体体DNADNA上，成为它的一个组成部分。上，成为它的一个组成部分。现知道只有双链现知道只有双链DNADNA的噬菌体才具有溶源周期的噬菌体才具有溶源周期第五十七页，本课件共有114页温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶 源生命周期。源生命周期。溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源化：溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶 源性细菌的过程源性细菌的过

21、程整合：整合：噬菌体的噬菌体的DNADNA是被包容在寄主细胞染色体是被包容在寄主细胞染色体DNADNA中中原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的 噬菌体噬菌体超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。使之溶源化的同种噬菌体再感染。第五十八页，本课件共有114页溶源周期的主要特征溶源周期的主要特征：1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬

22、菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。第五十九页，本课件共有114页 溶源噬菌体的诱发：溶源噬菌体的诱发：依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌体转录。需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染色体上删除下来，使之形成环形的DNA分子，恢复溶源周期开始时的状态。第六十页，本课件共有114页第六十一页，本课件共有114页裂解的级联调节裂解的级联调节噬菌体长48502nt共61个基因，其中32个较为重要溶原化周期(LYSOGENIC)裂解周期(LYTIC)第六十二页，本课件共有114页第六十三页，本课件共有114页第六十四页，本课件

23、共有114页二、二、噬菌体载体噬菌体载体第六十五页，本课件共有114页噬噬菌菌体体(bacteriophage,phage)是是感感染染细细菌菌的的病病毒毒，用用作作克克隆隆载载体体的的噬噬菌菌体体有有两两种种：一一种种是是噬菌体，另一种是噬菌体，另一种是M13噬菌体。噬菌体。野野生生型型噬噬菌菌体体经经过过改改造造，已已衍衍生生出出100多多种种克克隆隆载载体体。噬噬菌菌体体载载体体分分为为插插入入型型和和替替换换型型(置置换型换型)两类。两类。目目前前应应用用较较广广的的是是EMBL系系列列、gt系系列列和和Charon系列等。系列等。第六十六页，本课件共有114页噬菌体载体噬菌体载体 噬

24、菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。噬菌体基因组为长度为溶源状态，也可进入裂解循环。噬菌体基因组为长度为 48.5kb 48.5kb 的的双链双链 DNA DNA 分子，在噬菌体颗粒内，基因组分子，在噬菌体颗粒内，基因组 DNA DNA 呈线性，其两端的呈线性，其两端的 5 5 末端带有末端带有 12 12个碱基的互补单链（粘性末端），个碱基的互补单链（粘性末端），12 12 个碱基的序个碱基的序列为列为 5-GGGCGGCGACCT-3 5-GGGCGGCGACCT-3。当噬菌体。当噬菌体 DN

25、A DNA 进入宿主细胞后，其两进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA DNA 分子，噬菌体可选择进入分子，噬菌体可选择进入裂解生长状态或者进入溶源状态。裂解生长状态或者进入溶源状态。这这种由粘性末端种由粘性末端结结合形成的双合形成的双链链区段称区段称为为coscos位点位点位点位点第六十七页，本课件共有114页5-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5Cleavage Ligation(during packaging)(after infection)GGGCGGGCGACCTCG-35-CG+GC-5

26、3-GCCCCGCCGCTGGAThe phage cos endsCircular form Linear form 第六十八页，本课件共有114页第六十九页，本课件共有114页第七十页，本课件共有114页AWBCDEFZUVGHMLKIJb2cIcIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOS COS 头部基因头部基因 尾部基因尾部基因 功能不明区功能不明区 溶源化溶源化 重组重组 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNA DNA合成合成 溶菌溶菌生长非必须区段生长非必须区段cI cI基因：溶源过程控制基因。基因：溶源过程控制基因。噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构第七

27、十一页，本课件共有114页第七十二页，本课件共有114页DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong(left)armshort(right)armExogenous DNA(20-23 kb)phagephage12bp第七十三页，本课件共有114页 Viruses that can infect bacteria.48.5 kb in lengthLinear or circular genome(cos ends)phagephageLytic phase(Replicate and release)Lysogenic phase(integr

28、ate into host genome)第七十四页，本课件共有114页野生型野生型噬菌体在带有噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性原噬菌体的溶源性E.coli 中中的的生长会受到限制的表型，称作生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对，即对P2噬菌体的干扰敏感噬菌体的干扰敏感（sensitivetoP2interference）。如果）。如果噬菌体缺少两个参与重组的噬菌体缺少两个参与重组的基因基因red 和和gam，同时带有，同时带有chi 位点，并且宿主菌为位点，并且宿主菌为rec+，则，则可以在可以在P2溶源性溶源性E.coli 中生长良好，中生长良好，噬菌体的这种表型称作噬菌体的这种表型称

29、作Spi-。因此，通过。因此，通过噬菌体载体噬菌体载体DNA上的上的red 和和/或或gam 基因的缺失或基因的缺失或替换，可在替换，可在P2噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。噬菌体。Spi筛选筛选第七十五页，本课件共有114页噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型1.插入式载体插入式载体 一种只具有一个可供外源一种只具有一个可供外源DNADNA插入的克隆位点的插入的克隆位点的 派生载体。派生载体。2.2.替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可区段可以被

30、外源插入的以被外源插入的DNA片段所取代。片段所取代。3.3.凯伦噬菌体载体凯伦噬菌体载体第七十六页，本课件共有114页1.1.插入式载体插入式载体噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于一般用于cDNAcDNA文库或基因组文库的构建。文库或基因组文库的构建。cI cI基因插入失活基因插入失活：如如 gt10 gt10、NM1149NM1149等载体，在等载体，在cI cI基因上有基因上有EcoR IEcoR I及及Hind IIIHind III的酶切位点。外源基因插入的酶切位点。外源基因插入后将导致后将导致cI cI基因的失活

31、。基因的失活。cI cI基因失活后将导致噬菌体不基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。菌斑。Lac ZLac Z基因插入失活基因插入失活：如如charon16Acharon16A载体，在非必须区段载体，在非必须区段引入引入lac Zlac Z基因，在基因，在lac Zlac Z基因上有基因上有EcoR IEcoR I位点，插入失活后位点，插入失活后利用利用X-galX-gal法筛选（兰白筛选）。法筛选（兰白筛选）。第七十七页，本课件共有114页cIEcoRILA32.7RA10.6gt10lacZLA19.9R

32、A21.9EcoRICharon16A第七十八页，本课件共有114页第七十九页，本课件共有114页2.2.2.2.替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）外源外源DNADNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段染和复制非必要的片段(-20 kb)(-20 kb)高感染效率高感染效率(10(109 9 转化株转化株/ug/ug 载体载体 DNA,DNA,比质粒比质粒高高100-100-倍倍)e.g.EMBL3,DASH第八十页，本课件共有114页替换式载体替换式载体 野生型噬菌体染色体的中段对

33、于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、EMBL 3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。替换型噬菌体是使用最广泛的载体。第八十一页，本课件共有114页Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Char

34、on40第八十二页，本课件共有114页第八十三页，本课件共有114页替换型载体克隆外源替换型载体克隆外源DNADNA的步骤的步骤 1.1.应用适当的核酸内切酶消化应用适当的核酸内切酶消化载体，除去载体，除去可取代的可取代的DNADNA片段；片段；2.2.将上述所得的将上述所得的 DNADNA载体臂同外源载体臂同外源DNADNA片片段的连接；段的连接；3.3.对重组体的对重组体的DNADNA分子进行包装和增殖，分子进行包装和增殖，以得到有感染性的以得到有感染性的重组噬菌体重组噬菌体第八十四页，本课件共有114页 取代载体取代载体取代载体取代载体2.组装组装.1.连接连接3.侵染侵染第八十五页，本

35、课件共有114页体外包装体外包装 噬菌体噬菌体DNADNA体外重组后，一般必须经过体外包体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNADNA导入导入E.coliE.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达可达10106 6-10-108 8/gDNA/gDNA，而以，而以转染转染（translationtranslation）的）的方式导入的频率仅为方式导入的频率仅为10103 3-10-105 5/gDNA/gDNA。噬菌体的包装限制为野生噬菌体噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNADNA（

36、约（约48.5 48.5 kbkb）的）的75%-105%75%-105%。第八十六页，本课件共有114页 由于由于噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%-105%左右的，要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。插入式载体可携带的外源片段较替换式为小。第八十七页，本课件共有114页3.3.凯伦噬菌体载体凯伦噬菌体载体既有插入型；又有替换型既有插入型；又有替换型在基因工程实验中的用途十分广泛在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源承受外源DNADNA的能力：几个的能力：几个kbkb到到

37、23kb23kb第八十八页，本课件共有114页（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）第八十九页，本课件共有114页根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选第九十页，本课件共有114页3.3 3.3 单链丝状噬菌体载体单链丝状噬菌体载体 第九十一页，本课件共有114页单链单链DNADNA噬菌体载体噬菌体载体M13、f1、fd。优越性：优越性：1.1.单链单链DNADNA噬菌体的复制，是以双链环形的噬菌体的复制，是以双链环形的DNADNA为为媒介的，这种复制形式媒介的，这种复制形式 的的 DNA DNA简称简称RFDNARFDNA；2.2.不论是不论

38、是RFDNARFDNA还是还是ssDNAssDNA都能感染大肠杆菌；都能感染大肠杆菌；3.3.单链单链DNADNA噬菌体颗粒的大小，是受其噬菌体颗粒的大小，是受其DNADNA的多制的多制约的，不存在包装限制问题；约的，不存在包装限制问题；4.4.容易测定外源容易测定外源DNADNA片断的插入取向；片断的插入取向；5.5.可产生含外源片断的单链可产生含外源片断的单链DNADNA分子。分子。第九十二页，本课件共有114页M13M13噬菌体载体噬菌体载体 M13M13是一种含单链（是一种含单链（+）DNADNA（ssDNAssDNA）的）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为丝状大肠杆菌噬菌体，其基因

39、组大小为6.4kb6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（测定序列（sangersanger双脱氧法）、基因的双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链定点突变研究、异源双链DNADNA的分析等。的分析等。第九十三页，本课件共有114页第九十四页，本课件共有114页M13M13噬菌体的特点噬菌体的特点感染感染EcoliEcoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型后，在宿主细胞内会形成双链的复制型（replicationformDNA,RFDNA）。）。可以象可以象质粒那样在体

40、外进行纯化和操作。质粒那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coliE.coli的的F F+细胞，这是因细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF RF DNADNA或或ss DNAss DNA都能转染都能转染E.coliE.coli的的F F+或或F F-细胞。细胞。噬菌体颗粒的大小是受其的大小制约的，这一噬菌体颗粒的大小是受其的大小制约的，这一点正好与点正好与噬菌体相反。所以噬菌体相反。所以M13M13噬菌体并不存在包装噬菌体并不存在包装限制的问题。限制的问题。第九十五页，本课件共有114

41、页M13M13单链单链DNADNA噬菌噬菌体的生命体的生命周期周期第九十六页，本课件共有114页RFDNA第九十七页，本课件共有114页第九十八页，本课件共有114页PhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIIIRFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.第九十九页

42、，本课件共有114页M13M13载体载体 具有多克隆位点具有多克隆位点(MCS)(MCS)，方便克隆。许多，方便克隆。许多M13M13载体的多克载体的多克隆位点与质粒载体隆位点与质粒载体pUCpUC序列的多克隆位点是相同的，在克序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。隆位点选择上更为方便。可可以以定定向向地地克克隆隆DNADNA片片段段，克克隆隆在在M13 M13 RF RF DNADNA分分子子上上的的双双链链DNADNA片片段段，到到了了子子代代噬噬菌菌体体便便成成了了单单链链的的形形式式。所所以以如如果果要要同同时时分分离离分分子子中中的的双双链链，则则需需要要两两种种独独立

43、立的的克克隆隆。根根据据M13M13的的生生物物学学特特性性知知道道，M13M13子子代代噬噬菌菌体体中中总总是是只只含含有有（）链链，所所以以M13M13载载体体克克隆隆的的外外源源DNADNA片片段段在在子子代代噬噬菌菌体体中中究究竟竟是是含含有有DNADNA分分子子中中的的哪哪条条链链，则则完完全全取取决决于于外外源源克克隆隆时时的的取取向向。这这样样一一来来，为为分分别别分分离离外外源源分分子子的的两两条条链链带带来来一一定定的的麻麻烦烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术定向克隆技术定向克隆技术定向克隆技术。第一百页，本课件共有114

44、页Blue-white selection 第一百零一页，本课件共有114页M13M13载体系列的优点载体系列的优点 1.在这类载体的基因组中有一条饰变的-半乳糖苷酶基因片段（Hind片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列；2.M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。第一百零二页，本课件共有114页第一百零三页，本课件共有114页M13mp18MCSM13mp19MCSEcoRIBamHIHindIIIPstIBglIBglIPstIHindIIIBamHIEcoRIBPPBBPBPBPBamHI&PstI第一百零四页，本课件共有114页

45、M13M13克克隆载体隆载体分子结分子结构图构图第一百零五页，本课件共有114页3.4 3.4 噬菌粒载体噬菌粒载体第一百零六页，本课件共有114页噬菌粒载体噬菌粒载体由由质粒质粒载体和载体和单链噬菌体单链噬菌体载体结合而成的新载体结合而成的新型的载体系列。型的载体系列。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便点等，方便DNADNA的操作，可在细胞内稳定存在；的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体辅助噬菌体的的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代存在下，可进行噬菌体的繁殖，产

46、生单链的子代噬菌体。噬菌体。第一百零七页，本课件共有114页常用的噬菌粒载体常用的噬菌粒载体pUC118pUC118和和pUC119pUC119 1.1.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNADNA，可克隆可克隆10kb10kb的外源的外源DNADNA片段，并易于进行分离与操作；片段，并易于进行分离与操作；2.2.编码一个编码一个AmpAmpr r基因作为选择记号，因此只有携带基因作为选择记号，因此只有携带pUC118pUC118或或pUC119pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄

47、青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；3.3.拷贝数含量高，每个寄主可高达拷贝数含量高，每个寄主可高达500500个，所以只要用个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNADNA；4.4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNADNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；第一百零八页，本课件共有114页5.5.由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ

48、lacZ基因的基因的5-5-端编码区端编码区，可按照，可按照IPTGIPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；组织化学显色反应试验，筛选重组子；6.lacZ6.lacZ基因是置于基因是置于laclac启动子的控制之下，这样插入的外源基启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；因便会以融合蛋白质的形式表达；7.7.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链大量的双链DNADNA分子分子8.8.带有一个带有一个M13M

49、13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单寄主细胞中，可以合成出单DNADNA拷贝，并包装成噬菌体颗拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；分泌到培养基中；第一百零九页，本课件共有114页9.9.在在pUC118pUC118和和pUC119pUC119这两个载体中，多克隆位点这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链中的一个可转录克隆基因的正链DNADNA，另一个，另一个则可转录出负链则可转录出负链DNADNA；10.10.可以直接对克隆的可

50、以直接对克隆的DNADNA片断进行核苷酸的片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。一烦琐的亚克隆步骤。第一百一十页，本课件共有114页第一百一十一页，本课件共有114页pBluescriptpBluescript噬菌粒载体噬菌粒载体基本结构：1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；3.编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记