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1、关于分子生物学研究方法1第一页，本课件共有114页分子生物学研究法分子生物学研究法专题一：序列已知基因的克隆策略专题一：序列已知基因的克隆策略专题二：序列未知基因的克隆策略专题二：序列未知基因的克隆策略专题三：基因表达研究方法专题三：基因表达研究方法专题四：基因功能研究方法专题四：基因功能研究方法专题五：分子杂交技术专题五：分子杂交技术专题六：蛋白质、核酸相互作用技术专题六：蛋白质、核酸相互作用技术2第二页，本课件共有114页基因克隆（基因克隆（gene cloning）n经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程，通常是将单个基因导入宿主细过程，通常是将单个基因导入
2、宿主细胞中复制而成。胞中复制而成。3第三页，本课件共有114页4第四页，本课件共有114页基因克隆的五个步骤基因克隆的五个步骤分、切、连、转、选5第五页，本课件共有114页基因克隆需要什么？基因克隆需要什么？n目的基因目的基因n载体载体n宿主宿主n基因操作方法基因操作方法6第六页，本课件共有114页基因克隆基因克隆n目的基因序列已知目的基因序列已知n目的基因序列未知目的基因序列未知7第七页，本课件共有114页专题一：序列已知基因的克隆策略专题一：序列已知基因的克隆策略n5.1 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术n5.2 载体的发现及其应用载体的发现及其应用n5.3 工具酶的发现和应用工具酶的
3、发现和应用n5.4 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖n5.5 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术8第八页，本课件共有114页5.1 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术nPolymerase chain reaction(PCR)was developed in 1983 by Kary Mullis.nIn 1993,Mullis was awarded the Nobel Prize in Chemistry along with Michael Smith for his work on PCR.nPCR amplifies DNAs by repeated roun
4、ds of DNA replication in vitro.9第九页，本课件共有114页PCR的原理的原理n是在是在模板模板DNA、引物引物和和4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于存在的条件下，依赖于DNA聚合酶聚合酶的酶的酶促合反应，将待扩增的促合反应，将待扩增的DNA片段与其两片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性高温变性低温退火低温退火引物延伸引物延伸”三步反应三步反应的多次循环，使的多次循环，使DNA片段在数量上呈指片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。的大量的特定基因片段。1
5、0第十页，本课件共有114页11第十一页，本课件共有114页1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍12第十二页，本课件共有114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2
6、条单链模板DNA9513第十三页，本课件共有114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点9550引物1引物2DNA引物14第十四页，本课件共有114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶15第十五页，本课件共有114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束95第2轮开始16第十六页，本课件共有114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaq17第十七页，本课件共有114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nP
7、CR的特点72第2轮结束18第十八页，本课件共有114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点19第十九页，本课件共有114页PCR的原理示意图的原理示意图20第二十页，本课件共有114页聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 21第二十一页，本课件共有114页PCR指指数数扩扩增增时时循循环环次次数数与与DNA产产物物数数量量的比较的比较22第二十二页，本课件共有114页PCRPCR过程的过程的“三个步骤三个步骤”n变性变性（90-98）：双链）：双链DNA模板在热作用模板在热作用下，下，氢键断裂，形成单链氢键断裂，形成单链DNA。n退火退火（25-65）：系
8、统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。模板结合，形成局部双链。n延伸延伸（70-75）：在在Taq酶酶的作用下，以的作用下，以dNTP为原料，从引物的为原料，从引物的5端端3端延伸，合成与端延伸，合成与模板互补的模板互补的DNA链链。23第二十三页，本课件共有114页PCRPCR反应程序反应程序n95 5 minn95 30 Sn55 30 Sn72 1 minn72 10 minn43030个循环个循环24第二十四页，本课件共有114页PCRPCR反应体系的反应体系的“五个要素五个要素”n模板模板n引物引物ndNTPn缓冲液（其中需要缓冲液（其中需要Mg2+
9、）nDNA聚合酶聚合酶25第二十五页，本课件共有114页PCR反应体系反应体系10扩增缓冲液扩增缓冲液10LMg2+1.5mmol/L4种种dNTP混合物混合物200mol/L引物引物110100pmol 引物引物210100pmol模板模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶聚合酶2.5 加双或三蒸水加双或三蒸水100 L26第二十六页，本课件共有114页DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）nTaq DNA polymerase，1976年从粞热水生菌年从粞热水生菌（Thermus aquaticus）分离，耐高温，具有）分离，耐高温，具有5-3外切酶活性，外切酶活性，不具有
10、不具有3-5外切酶活性外切酶活性，PCR产物产物具有具有3突出的单突出的单A核苷酸尾核苷酸尾。nPfu DNA polymerase，从，从火球菌（火球菌（Pyrococcus furiosis）分离，耐高温，不具有）分离，耐高温，不具有5-3外切酶活外切酶活性，性，具有具有3-5外切酶活性外切酶活性，PCR产物为平末端产物为平末端。27第二十七页，本课件共有114页模板（模板（Template）n单、双链单、双链DNA均可。均可。n不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑聚合酶抑制剂、制剂、DNA结合蛋白类。结合蛋白类。n模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过
11、高会导致反应的非特异性增加。n可以是复杂样品。可以是复杂样品。28第二十八页，本课件共有114页引物（引物（primers)n引物是人工合成的两引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域个引物与感兴趣区域一端的一条一端的一条DNA模板模板链互补，另一个引物链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端与感兴趣区域另一端的另一条的另一条DNA模板链模板链互补。互补。3355Sense primerAntisense primer29第二十九页，本课件共有114页 引物设计原则引物设计原则（1 1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。）序列应位于高度保守区，与非扩增区无
12、同源序列。）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2 2）引物长度以）引物长度以）引物长度以）引物长度以15-40 bp15-40 bp为宜。为宜。为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布，碱基尽可能随机分布，碱基尽可能随机分布，碱基尽可能随机分布，G+CG+C占占占占50-60%50-60%。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（6 6）引物）引
13、物）引物）引物33端为关键碱基；端为关键碱基；端为关键碱基；端为关键碱基；55端无严格限制。端无严格限制。端无严格限制。端无严格限制。30第三十页，本课件共有114页33535限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变探针标记探针标记31第三十一页，本课件共有114页引物设计软件引物设计软件nPrimer Premier 5.0 nOligonFPCRnPrimer-Blast32第三十二页，本课件共有114页PCR反应的特点反应的特点n特异性强特异性强n灵敏度高灵敏度高n简便、快速简便、快速n对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低33第三十三页，本课件共有
14、114页PCRPCR的应用的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他34第三十四页，本课件共有114页PCR的种类的种类n基因组基因组PCRPCRn反（逆）转录反（逆）转录PCRPCRn实时定量实时定量PCRPCRn扩增已知序列两侧扩增已知序列两侧DNADNA的的PCRPCRn致突变致突变PCRPCRn扩增未知扩增未知DNADNA序列的序列的PCRPCRn重组重组PCRPCR推荐书目推荐书目PCR最新技术原理、方法及应用，黄留玉主编最新技术原理、方法及应用，黄留玉主编 35第
15、三十五页，本课件共有114页载体主要是小分子量的复制子如：病毒、噬菌体、质粒。载体主要是小分子量的复制子如：病毒、噬菌体、质粒。1972年，美国年，美国Stanford大学的大学的P.Berg 等首次成功地实现了等首次成功地实现了DNA的体外重组；的体外重组；5.2 载体的发现及其应用载体的发现及其应用36第三十六页，本课件共有114页载体（载体（vector）p是携带是携带靶靶DNA（目的（目的DNA）片段进入）片段进入宿宿主细胞主细胞进行进行扩增和表达扩增和表达的运载工具。的运载工具。37第三十七页，本课件共有114页载体的功能载体的功能n运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受
16、体细胞n为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力n为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件38第三十八页，本课件共有114页39General features of a Vector1.They contain an origin of replication and can autonomously replicating DNA independent of hosts genome.2.Contains at least one selective marker,which allows host cells containing
17、 the vector to be selected amongst those which do not.3.Contains a multiple cloning site(MCS)to be cut by restriction enzymes for DNA manipulation.4.Easily to be isolated from the host cell.Most are circular,some are linear(e.g.YAC vector).39第三十九页，本课件共有114页用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体n质粒载体质粒载体：10kb以下以下n噬菌体载体噬
18、菌体载体：20kbn黏粒（黏粒（cosmid）噬菌体）噬菌体：50kbn人工染色体人工染色体：200kb-1Mbn土壤农杆菌土壤农杆菌Ti质粒质粒：植物细胞，：植物细胞，200kb40第四十页，本课件共有114页质粒质粒pPlasmids:small,extrachromosomal circular molecules,from 2 to 200 kb in size,which exist in multiple copies within the host cells.p严紧型质粒严紧型质粒 拷贝数拷贝数1-2/cellp松弛型质粒松弛型质粒 拷贝数拷贝数10/cell41第四十一页，本
19、课件共有114页克隆载体和表达载体克隆载体和表达载体n克隆载体（克隆载体（Cloning Vector）可携带插入的目的可携带插入的目的DNA进入宿主细胞内并进入宿主细胞内并能自我复制的能自我复制的DNA分子。此种分子。此种DNA分子含有能分子含有能在宿主中复制的位点和便于筛选的遗传标志。在宿主中复制的位点和便于筛选的遗传标志。n表达载体（表达载体（Expression Vector）在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基、终止子等），是目的基因能够表达的载体。因能够表达的载体。42第四十二页，本课件共有
20、114页43第四十三页，本课件共有114页44第四十四页，本课件共有114页n限制性内切酶（限制性内切酶（Restriction endonuclease）nDNA连接酶（连接酶（DNA ligase）n反转录酶（反转录酶（Reverse transcripatase）n碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase）nDNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）5.3 工具酶的发现和应用工具酶的发现和应用45第四十五页，本课件共有114页1970年，年，Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II，1972年，年，Boyer等
21、相继发现了等相继发现了EcoR I 一类重要的限制性内切酶。一类重要的限制性内切酶。1）限制性内切酶的发现和应用）限制性内切酶的发现和应用46第四十六页，本课件共有114页限制性内切酶限制性内切酶（restriction endonuclease）n定义定义：能够识别：能够识别DNA上的特定碱基序列上的特定碱基序列并从这个位点切开并从这个位点切开DNA分子。分子。n限制性外切酶限制性外切酶：n是一类能从多核苷酸链的一端开始按序是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解催化水解3,5-磷酸二酯键，降解核苷磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸
22、。苷酸。47第四十七页，本课件共有114页48第四十八页，本课件共有114页nWhy being used?-To break large DNA molecules into manageable fragments.Nucleic acids-Restriction digestionNucleic acids-Restriction digestionRestriction endonucleases(限限制性内切酶制性内切酶)cleave DNA molecules at particular sites by the recognition of specific sequences
23、.49第四十九页，本课件共有114页n来源来源：细菌的限制修饰系统。：细菌的限制修饰系统。n命名命名：微生物属名的第一个字母和种名：微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌的前两个字母组成，第四个字母表示菌株株(品系品系)。限制性内切酶限制性内切酶50第五十页，本课件共有114页51the 1st such enzyme foundEscherichia coli Species categoryR13strainHow to name a restriction endonuclease?EcoRI51第五十一页，本课件共有114页限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶
24、的分类pI型限制酶型限制酶 属于复合功能酶，兼有修饰和切割属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性，两种特性，随机切割。随机切割。pII型限制酶型限制酶 识别序列一般为识别序列一般为4-6个碱基对个碱基对，通常是反，通常是反转重复顺转重复顺序序(回文结构回文结构)，具有，具有180的旋转对称性，的旋转对称性，特异性切割特异性切割。pIII型限制酶型限制酶 在在DNA链上有特异位点切割，其切割位点在识链上有特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。别位点以外。52第五十二页，本课件共有114页53nRE used in molecular biology typically recognize
25、(识别识别)short(4-8bp)target sequences that are usually palindromic(回文结构回文结构),and cut(切割切割)at a defined sequence within those sequences.e.g.EcoRI5.GAATTC.3 .CTTAAG.53第五十三页，本课件共有114页54The random occurrence of the hexameric(六核苷酸的六核苷酸的)sequence:1/4096 (4-6=1/46)What are the frequencies if the recognition s
26、equences are four(tetrameric)and eight(octameric)nucleotides?How to estimate the frequency of the RE in a DNA molecule or genome?54第五十四页，本课件共有114页55Table 1 Table 1 Some restriction Endonucleases and their Some restriction Endonucleases and their recognition sequencesrecognition sequencesEnzymeEnzyme
27、SequenceSequenceFrequency Frequency Sau3A1Sau3A1EcoRIEcoRINotI NotI 5-GATC-35-GATC-35-GAATTC-35-GAATTC-35-GCGGCCGC-35-GCGGCCGC-30.25 kb0.25 kb4 kb4 kb65 kb65 kb55第五十五页，本课件共有114页56(1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity:target sites are different.(2)Restriction enzymes differ in
28、the length they recognized,and thus the frequencies differ.(3)Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate:blunt/flush ends(平末端平末端),sticky/staggered ends(粘性末端粘性末端).(4)Restriction enzymes differ in the cleavage activity.Characteristics of RE56第五十六页，本课件共有114页57sticky ends(粘性末
29、端粘性末端)blunt ends(平末端平末端)Fig 2 Recognition sequences and cut sites of various endonucleases57第五十七页，本课件共有114页同裂酶（isoschizomer）：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。5 C C G G 3 3 G G C C 5 5 C C G G 3 3 G G C C 5HpaHpaIIII、MspMspI I少数有特殊性质的少数有特殊性质的IIII型酶型酶58第五十八页，本课件共有114页同尾酶（isocaudarner)：作用后能产生相同的粘性末端。5 5 GG G A T C C
30、3 G A T C C 33 C C T A G 3 C C T A G G G 555 5 A A G A T C C 3 G A T C C 33 C C T A G 3 C C T A G A A 55BamH IBamH IBag IIBag II59第五十九页，本课件共有114页几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端内切酶所识别的序列及其酶切末端60第六十页，本课件共有114页1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连连接酶，特别是接酶，特别是1970年年H.G.Khorana等发现的等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性
31、。连接酶具有更高的连接活性。2）DNA连接酶的发现和应用连接酶的发现和应用61第六十一页，本课件共有114页 DNA连接酶连接酶（DNA ligase）n一种封闭一种封闭DNA链上缺口链上缺口的酶，借助的酶，借助ATP或或NAD水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNA链的链的5-PO4与另一与另一DNA链的链的3-OH生成生成磷磷酸二酯键酸二酯键。nEcoli DNA连接酶连接酶 nT4 DNA连接酶连接酶 62第六十二页，本课件共有114页连接反应体系连接反应体系n三蒸水三蒸水 0.5 Ln目的基因目的基因 6 Ln载体载体 2 Ln缓冲液缓冲液 1 Ln连接酶连接酶 0.5Ln温度温度
32、4,1663第六十三页，本课件共有114页nDNA连接酶只能作用于连接酶只能作用于双链双链DNA分子分子而不能将二而不能将二个单链个单链DNA分子连接。分子连接。nT4噬菌体噬菌体DNA连接酶可连接连接酶可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链和双链DNA粘性末端或平头粘性末端或平头末端。末端。n大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端连接酶不能连接平末端DNA分子。分子。nDNA重组技术常用重组技术常用T4噬菌体噬菌体DNA连接酶。连接酶。注意：64第六十四页，本课件共有114页5.4 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖n细菌转化细菌转化（transf
33、ormation），是指一），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过而导致性状特征发生遗传改变的过程。程。n提供转化提供转化DNA的菌株叫作的菌株叫作供体菌株供体菌株。n接受转化接受转化DNA的细菌菌株则被称为的细菌菌株则被称为受体受体菌株菌株。65第六十五页，本课件共有114页为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的能力。经过这种处理的细胞被称作的细胞被称作感受态细胞感受态细胞（competent cells）。）。感受态细胞感受
34、态细胞（competent cells）66第六十六页，本课件共有114页 CaCl2法法大肠杆菌培养至大肠杆菌培养至OD=0.2-0.80预处理的低渗预处理的低渗CaCl2-甘油溶液甘油溶液42 90s或或37 5min转化效率：转化效率：51062107个个/g DNA。67第六十七页，本课件共有114页电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。进入细胞质。将将生生长长至至对对数数中中期期的的E.
35、coli菌菌液液冷冷却却至至4后后离离心心，洗洗菌菌后后用用10%的的甘甘油油悬悬浮浮，将将高高密密度度菌菌液液（21010/ml）置置于于特特制制的的电击杯中进行电击。电击杯中进行电击。68第六十八页，本课件共有114页电穿孔仪电穿孔仪电击杯电击杯69第六十九页，本课件共有114页细菌转化及蓝白斑筛选细菌转化及蓝白斑筛选（Blue-white screening）70第七十页，本课件共有114页5.5 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术p一一种种分分子子被被放放置置到到电电场场中中，它它就就会会以以一一定定的的速速度度移移向向适适当当的的电电极极。我我们们把把这这种种电电泳泳分分子子在在电电场
36、场作作用用下下的的迁迁移移速速度度，叫叫做做电电泳泳的的迁迁移移率率，它它与与电电场场强强度度和和电电泳泳分分子子本本身身所所携携带带的的净净电电荷荷数数成成正正比比，与片段大小成反比。与片段大小成反比。71第七十一页，本课件共有114页核酸电泳的核酸电泳的用途用途n确定确定DNA或或RNA的大小的大小n纯化纯化DNA或或RNA片段片段n分离分离DNA或或RNA片段片段72第七十二页，本课件共有114页Fig 3:DNA is separated by gel electrophoresislargemoderate small73第七十三页，本课件共有114页741.DNA and RNA
37、molecules are negatively charged,thus move in the gel matrix(胶支持物胶支持物)toward the positive pole(正电极正电极).2.Linear DNA molecules are separated according to sizes.The large DNA molecules move slower than the small molecules.3.The mobility of circular DNA molecules is affected by their topological struct
38、ures.The mobility of the same molecular weight DNA molecule with different shapes is:supercoiled(超螺旋超螺旋)linear(线性线性)nicked or relaxed(缺刻或松散缺刻或松散)DNA gel mobility(DNA在胶上的迁移性在胶上的迁移性)74第七十四页，本课件共有114页75Gel matrix(胶支持物胶支持物)is an inserted,jello-like porous material that supports and allows macromolecules
39、 to move through.Gel matrix(胶支持物胶支持物)75第七十五页，本课件共有114页76Agarose(琼脂糖琼脂糖):(1)a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kb1 kb0.5 kb2 kb3 kb4 kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes,such as ethidium bromide(EB 溴化乙锭溴化乙锭)7
40、6第七十六页，本课件共有114页77Polyacrylamide(聚丙稀酰聚丙稀酰胺胺):(1)has high resolving capability,and can resolve DNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range(1 to a few hundred bp).77第七十七页，本课件共有114页凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp）
41、0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50178第七十八页，本课件共有114页溴溴化化乙乙锭锭染染料料的的化化学学结结构构及及其其对对DNA分分子子的的插插入入作作用用。由由于于插插入入了了溴溴化化乙乙锭锭分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中DNA的的条条带带便便呈呈现现出出橘橘黄黄色色荧荧光光，易易于于鉴定。鉴定。79第七十九页，本课件共有1
42、14页常用缓冲液常用缓冲液nTAE：Tris-乙酸乙酸缓冲容量小，溶解度大，易储存，可用于核酸纯化。缓冲容量小，溶解度大，易储存，可用于核酸纯化。nTBE：Tris-硼酸硼酸缓冲容量大，溶解度小，不易储存，不用于核酸纯化。缓冲容量大，溶解度小，不易储存，不用于核酸纯化。nTPE：Tris-磷酸磷酸缓冲容量大，不可用于核酸纯化。缓冲容量大，不可用于核酸纯化。80第八十页，本课件共有114页n5.1 聚合酶链式聚合酶链式反应技术反应技术n5.2 载体载体的发现及其应用的发现及其应用n5.3 工具酶工具酶的发现和应用的发现和应用n5.4 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖n5.5
43、 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术专题一：序列已知基因的克隆策略专题一：序列已知基因的克隆策略81第八十一页，本课件共有114页部分考研题部分考研题1.Blue-white screening（武汉大学2008）2.Vector（上海交大2004，浙江大学2004、2006）3.聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）（北京师范2008）4.限制性酶图谱（华南理工2005）5.黏性末端（南京师范2006）6.同裂酶（南京师范2006）7.设计PCR引物的主要原则是什么？（中科院2007）8.描述PCR技术原理（浙江大学2004、2006）9.分子生物学研究中经常用各
44、种载体进行研究工作，试问有哪些不同大小类型的载体，各自的主要特点是什么？（武汉大学2005、2009）10.碱法质粒提取用到的溶液成分的作用时什么？操作中有哪些注意事项？（北京大学2010）82第八十二页，本课件共有114页思考题思考题n请设计一组试验来请设计一组试验来克隆一个你所感兴克隆一个你所感兴趣的人类基因；趣的人类基因；并对基因产物大量表并对基因产物大量表达与纯化；达与纯化；然后研究该基因的生物学然后研究该基因的生物学功能。（武汉大学功能。（武汉大学2005）83第八十三页，本课件共有114页专题二：序列未知基因的克隆策略专题二：序列未知基因的克隆策略5.6 构建基因组文库构建基因组文
45、库5.7 构建构建cDNA文库文库5.8 文库筛选文库筛选5.9 RACE84第八十四页，本课件共有114页85Libraries of DNA molecules can be created by cloning(Genomic library and cDNA library)A DNA library(DNA文库文库)is a population of identical vectors that each contains a different DNA insert.Genomic Library(基因组文库基因组文库):the DNA inserts in a DNA libr
46、ary is derived from restriction digestion or physical shearing of the genomic DNA.cDNA library(cDNA文库文库):the DNA inserts in a DNA library is converted from the mRNAs of a tissue,a cell type or an organism.cDNA stands for the DNA copied from mRNA.85第八十五页，本课件共有114页5.6 基因组基因组DNA文库构建文库构建把某种生物的基因组把某种生物的基
47、因组DNADNA切成适当大小，分切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有隆。汇集包含基因组中所有DNADNA序列的克隆序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为样的克隆片段的总汇，称为基因组基因组DNADNA文库文库。86第八十六页，本课件共有114页Clark和Carbon于1975年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式中：N表示一个基因组文库所应该包含的重组克隆数目；p表示所期望的靶基因在文库中出现的概率；f表示重组克隆平均插入片段的长度与基因组
48、DNA总长的比值。87第八十七页，本课件共有114页构构建建基基因因组组文文库库最最常常用用的的是是噬噬菌菌体体载载体体（克克隆隆能能力力约约1520kb）和）和限制性内切酶部分消化法限制性内切酶部分消化法。88第八十八页，本课件共有114页5.7 cDNA文库的构建文库的构建1 总总RNA的提取的提取2 mRNA的纯化的纯化3 cDNA的合成的合成4 cDNA文库的构建文库的构建cDNA文库的文库的构建过程构建过程89第八十九页，本课件共有114页细细胞胞中中的的总总RNA包包括括mRNA，rRNA，tRNA以以及及一一些小些小RNA（sRNA）。）。一个典型的动物细胞约含一个典型的动物细胞
49、约含10-5g RNA，其中：，其中：80%-85%为为rRNA15%-20%为为tRNA及及sRNAmRNA约占总约占总RNA 的的1%-5%1 总总RNA的提取的提取90第九十页，本课件共有114页总总RNA的抽提方法的抽提方法p异硫氰酸胍异硫氰酸胍-苯酚抽提法苯酚抽提法(TRIzol(TRIzol法法)p硅胶膜纯化柱硅胶膜纯化柱91第九十一页，本课件共有114页RNA的的浓浓度度和和纯纯度度可可以以通通过过测测定定其其OD260和和OD280来来判判断断。OD260为为1时时相相当当于于浓浓度度为为40g/ml，而而OD260/OD280的的比比值值如如果果在在1.8-2.0之之间间，表
50、表示示所所提提取取的的RNA纯纯度度较较好好，如如果果样样品品中中有有蛋蛋白白质质或或酚酚污污染，则染，则OD260/OD280的比值将明显低于的比值将明显低于1.8。92第九十二页，本课件共有114页RNA的琼脂糖电泳检测变性条件下，甲醛是最常用的变性剂，也可用加热或尿素等变性剂。28S和18S亮度2:1rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和和18S特征性条特征性条带是电泳鉴定总带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。纯度和完整性的重要参数。93第九十三页，本课件共有114页2 mRNA的纯化的纯化5端帽子结构和端帽子结构和3端的端的