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1、制制备基因工程基因工程药物的基本物的基本过程程一，一，获取目的基因取目的基因反转录反转录-聚合酶链反应法聚合酶链反应法(一一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA1,细胞总细胞总RNA的提取的提取:取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。2，从总，从总RNA中分离中分离mRNA：取上述提取的总RNA若干，加入BufferOBB，OligotexSuspension，打匀。70水浴（裂解RNA的二级结构），20-30条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。将Oligot
2、ex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。（二）mRNA转录合成cDNA第一链cDNA 第一链的合成第一链的合成加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-freewater，混匀后,70反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、dNTP（加入放射性同位素利于检验），混匀，稍微离心反应物之后,42放置2分钟。取出置于冰上。电泳分析，同位素活性测定。（三）（三）PCR法扩增，特异合成目的法扩增，特异合成目的cDNA链链通过胰岛素
3、的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链,获得目的基因（通过凝胶电泳回收测序后方可使用）。前端引物：前端引物：5-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3后端引物：后端引物：5-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3PCRPCR法的操作步骤：法的操作步骤：预变性 引物退火 引物延伸 循环25-35次最后延伸二，二，组建重建重
4、组质粒粒采用采用pBR322pBR322作为载体，用双酶切法进行基因重组。作为载体，用双酶切法进行基因重组。一一、pBR322简介介F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。其作为载体的优点为：双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载
5、体越小越好。载体越小越好。载体越小越好。载体越小越好。10kb10kb的的的的DNADNA在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。高拷贝数高拷贝数高拷贝数高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy10003000copy 安全安全安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mobmob（mobilization),mobilization),不能通过接合转移。不能通过接合转移。不能通过接合转移。不能通过接合转移
6、。.双酶切法双酶切法双酶切法双酶切法用两种酶限制性内切核酸酸消化载体用两种酶限制性内切核酸酸消化载体用两种酶限制性内切核酸酸消化载体用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNADNADNADNA和外源和外源和外源和外源DNADNADNADNA片段，使载体和外源目的基片段，使载体和外源目的基片段，使载体和外源目的基片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的
7、作用下相同的黏性末端可退火连接成重组可退火连接成重组可退火连接成重组可退火连接成重组DNADNADNADNA分子，从而实现分子，从而实现分子，从而实现分子，从而实现DNADNADNADNA的定向连接。的定向连接。的定向连接。的定向连接。.重组过程重组过程重组过程重组过程pBR322pBR322pBR322pBR322用用用用Hind Hind Hind Hind 和和和和BamHBamHBamHBamH酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源源源源D
8、NADNADNADNA片段同样也用片段同样也用片段同样也用片段同样也用Hind Hind Hind Hind 和和和和BamHBamHBamHBamH酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源源源源DNADNADNADNA片段混合退火，因为片段混合退火，因为片段混合退火，因为片段混合退火，因为Hind Hind Hind Hind 和和和和BamHBamHBamHBamH的黏性末端不匹配，避免了载体和外源的黏性末端不匹配，避免了载体和外源的黏性末端不匹配，避免了载体和外源的黏
9、性末端不匹配，避免了载体和外源DNADNADNADNA片段的自身连接，外源片段的自身连接，外源片段的自身连接，外源片段的自身连接，外源DNADNADNADNA片段只能定向地连接到载体的片段只能定向地连接到载体的片段只能定向地连接到载体的片段只能定向地连接到载体的Hind Hind Hind Hind 和和和和BamHBamHBamHBamH位点之位点之位点之位点之间。当然也不可避免发生载体的间。当然也不可避免发生载体的间。当然也不可避免发生载体的间。当然也不可避免发生载体的Hind Hind Hind Hind 和和和和BamHBamHBamHBamH的黏性末端之间的两个碱基互补形的黏性末端之
10、间的两个碱基互补形的黏性末端之间的两个碱基互补形的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。三，构建基因工程菌三，构建基因工程菌AA链和链和链和链和BB链同时表达法链同时表达法链同时表达法链同时表达法(一)重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组DNA的转化1,CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞：法制备大肠杆菌感受态细胞：取
11、100 ml 菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体，用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体，冰浴放置12-24小时，备用。2，大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：，大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组，DNA连接液，混匀。冰浴放置半小时。在42 保温 2 分钟（热脉冲），快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 2 分钟。加入1 ml 新鲜培养基，于37 培养 1 小时（扩增）。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。经典的典的CaClCaCl2 2转化方法化方法(二
12、)重组子的筛选和鉴定（载体遗传标记检测）基本操作：基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板，再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上，在Ap平板上生长，但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子。抗药性筛选法：抗药性筛选法：抗药性筛选法：抗药性筛选法：抗药性筛选法的基本原理抗药性筛选法的基本原理抗药性筛选法的基本原理抗药性筛选法的基本原理：将外源将外源DNADNA片段插在片段插在EcoRIEcoRI位点：位点：非重组子呈非重组子呈ApAprr、TcTcrr重组子呈重组子呈ApAprr、TcTcr r 将外源将外源DNADNA片段插在片段插在BamHIBamHI位点：位点：非重组子呈非重
13、组子呈ApAprr、TcTcrr重组子呈重组子呈ApAprr、TcTcs s 再经再经ll琼脂糖凝胶电泳，限制性图普，琼脂糖凝胶电泳，限制性图普，PCRPCR检测检测DNADNA测序以及测序以及SDS-PAGESDS-PAGE等分等分析，检测并证实了整个重组体的构建和表达析，检测并证实了整个重组体的构建和表达筛选过程筛选过程四，培养工程菌四，培养工程菌采用比浊法测定不同时间培养基中菌量，绘制基因工程菌的生长曲线，在摇瓶培养的水平下，采用优化的发酵培养基发酵基因工菌，培养4小时候即进入对数生长期，而且对数生长期可延长至17小时。1，正交优化实验：，正交优化实验：采用正交法，选取摇瓶培养条件中七个
14、主要因素进行两水平正交优化，该七个因素为：种子活化方式，摇床转速(通风量)，IPTG诱导温度，接种量，IPTG添加量，诱导时间，补料方式。分别用A、B、C、D、E、F、G表示以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的A600为目标量，考察条件优化的效果，进行八次实验，对实验结果进行分析，优化出最佳实验条件。2，其他条件优化：，其他条件优化：在优化发酵条件的基础上，进一步就各种金属元素对苗体生长发重组蛋白诱导的影响作了分析。3，放大培养（比较不同发酵工艺产量）：，放大培养（比较不同发酵工艺产量）：在优化摇瓶水平发酵试验的基础上，放大至1L培养基中比较两种发酵工艺。在不同转速，通气量，pH条件下，比较选
15、择产量最高的发酵工艺。优化发酵条件优化发酵条件五，五，产物分离物分离纯化化由于基因工程药物是从转化细胞、而不是由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。成品加工。发酵液发酵液细胞分离细胞分离胞内产物胞内产物细胞破碎细胞破碎固液分离固液分离包含体包含体细胞碎片分离细胞
16、碎片分离变变 性性复复 性性透析浓缩透析浓缩再复性及酶转化再复性及酶转化高度纯化高度纯化制制 剂剂高速离心高速离心溶菌酶超声破碎细胞溶菌酶超声破碎细胞变性剂&离子型去污剂洗涤洗涤二次复性法复性复性变性剂（尿素）变性变性胞外产物胞外产物二次复性法二次复性法二次复性法二次复性法：005g5g包涵体溶解于一定量的缓冲液包涵体溶解于一定量的缓冲液B(50mmolB(50mmolLLGlyNaOHGlyNaOH，8 mol8 molLL尿素，尿素，B_B_巯基乙醇，巯基乙醇，pH 9pH 95)5)中，使之充分混悬，中，使之充分混悬，静置静置11小时以上。混悬液分步逐滴加入到缓冲液小时以上。混悬液分步逐
17、滴加入到缓冲液C(50mmolC(50mmolLGly-NaOHLGly-NaOH，半胱氨酸一胱氨酸，半胱氨酸一胱氨酸，pH 9pH 95)5)中，中，44静置复性过夜。上样于已用静置复性过夜。上样于已用50mmol50mmolLLGlyNaOH(pH 9GlyNaOH(pH 95)5)平衡的平衡的DEAE-Sepharose FFDEAE-Sepharose FF柱，用柱，用001mol1molLL的氯化钠梯度洗脱，通过的氯化钠梯度洗脱，通过SDS-PAGESDS-PAGE确定确定RRhPIRRhPI位置，用位置，用DEAE-SepharoseFFDEAE-SepharoseFF做离做离子交
18、换层析，子交换层析，收集含收集含RRhPIRRhPI的洗脱峰的洗脱峰22，层析图谱见（图，层析图谱见（图66）。电泳检测显示）。电泳检测显示(图图11)11)峰峰22主要为主要为RRhPIRRhPI，及少量高分子杂质，及少量高分子杂质，收集峰收集峰22做再复性。峰做再复性。峰11为为pHpH高于高于9955及及一些疏水性蛋白质形成的穿透峰，绝大部分一些疏水性蛋白质形成的穿透峰，绝大部分pHpH低于低于RRhPIRRhPI的蛋白质和核酸类杂质的蛋白质和核酸类杂质则牢固地结合在柱子上，在较高盐浓度及则牢固地结合在柱子上，在较高盐浓度及2mol2molL NaClL NaCl的条件下被洗脱下来，形的
19、条件下被洗脱下来，形成其他峰成其他峰33和峰和峰44。胰岛素原（胰岛素原（RRhPIRRhPI）的再复性及酶切转化：）的再复性及酶切转化：1,复性将初步复性及纯化后的RRhPI通过透析浓缩，先后转换到缓冲液B和D(50mmolL G1y-NaOH，氧化型谷胱甘肽(GSSG)一还原型谷胱甘(GSH)pH95)中，使蛋白浓度为01O6 mgml，4静置过夜。2,酶切复性后的RRhPI复性液调节pH后加入一定量的胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidase B)在37。C进行协同酶切一段时间，然后滴加2 molL ZnCI：至ZnCl：浓度为01molL终止反应并沉淀生成的
20、hI，用双蒸水洗涤沉淀得较纯B9重组人胰岛素约79 mg/L培养基。重组胰岛素粗品的纯化：重组胰岛素粗品的纯化：胰岛素粗品用02molLNaAcHAc，pH40溶解。溶解后的样品通过Superdex75进行纯化(图10)，得1、2、3峰，收集峰3，透析后冻干即为胰岛素产品所得胰岛素产品用SDS-PAGE分析为单带，电泳检测见图11。六，除菌六，除菌过滤传统过滤只能滤去空气中的尘埃、液体中的异物微粒，很难去传统过滤只能滤去空气中的尘埃、液体中的异物微粒，很难去除微生物活体（细菌、病毒及热原体）；薄膜过滤是微孔筛分，大于除微生物活体（细菌、病毒及热原体）；薄膜过滤是微孔筛分，大于孔径的微粒均被截留
21、，微生物粒子大小为孔径的微粒均被截留，微生物粒子大小为0.5-20.5-2微米，只要选用微米，只要选用0.450.45微米微米的微孔滤膜即可将微生物截留去除，用的微孔滤膜即可将微生物截留去除，用0.220.22微米的微孔滤膜则微米的微孔滤膜则可能将病毒、热原体去除。可能将病毒、热原体去除。注射用药液除用传统过滤器去除药液中的异物外，现已采用微注射用药液除用传统过滤器去除药液中的异物外，现已采用微孔滤膜将澄清的药液再次除菌、除热原，其滤膜孔径最好在孔滤膜将澄清的药液再次除菌、除热原，其滤膜孔径最好在0.220.22微米微米以下。制药空气的过滤亦因以下。制药空气的过滤亦因GMPGMP的不同级别要求
22、而采用相应的器材、的不同级别要求而采用相应的器材、过滤器。要指出的是，制药无菌空气的供应仅采用传统滤材、滤器往过滤器。要指出的是，制药无菌空气的供应仅采用传统滤材、滤器往往不能达到要求，其终端必须选用微孔薄膜，孔径必须在往不能达到要求，其终端必须选用微孔薄膜，孔径必须在00。4545微米微米以下。以下。注射用无菌药液的处理注射用无菌药液的处理注射用无菌药液的处理注射用无菌药液的处理：按：按GMPGMP要求，注射用药液应当无菌无热原，要求，注射用药液应当无菌无热原，本品药液配制好后，经过粗砂棒、细砂棒（本品药液配制好后，经过粗砂棒、细砂棒（适当使用滑石粉或碳粉）适当使用滑石粉或碳粉）过滤成澄明液
23、后，再经过过滤成澄明液后，再经过0.450.45微米微米多层微孔滤芯除菌，终端通过多层微孔滤芯除菌，终端通过0.220.22微米单层超微孔滤膜后上机灌装。微米单层超微孔滤膜后上机灌装。除菌除菌除菌除菌过滤过滤器最重要的部分器最重要的部分器最重要的部分器最重要的部分为过滤为过滤材料，材料，材料，材料，目前，用于过滤器常用的主要过滤材料大致有以下几种：混合纤维素酯混合纤维素酯常用来制成圆形的单片平板滤膜，用于液体和气体的精过滤；聚丙烯聚丙烯(PP)做成折叠式，常用于筒式过滤器，有较大的孔径，其具有亲水性，属粗过滤材料；聚偏二氟乙烯聚偏二氟乙烯(PVDF)属精过滤材料，耐热和耐化学稳定，蒸汽灭菌承受
24、性良好，可制成亲水性滤膜，较广泛应用于制药工业无菌制剂用水及注射用水的过滤；聚醚砜聚醚砜(PES)做成折叠式，常用于筒式过滤器，耐温耐水解性能好，亲水性材料，用于精度较高的溶液的精过滤；尼龙尼龙做成折叠式，常用于筒式过滤器，亲水性材料，常用作液体的精过滤；聚四氟乙烯聚四氟乙烯(PTFE)做成折叠式，常用于筒式过滤器，疏水性材料，其是使用相当广泛的一种材料，耐热耐化学稳定，常用于水、无机溶剂及空气的精过滤。除菌除菌过滤器的特点器的特点（1）除菌过滤器一般采用十字悬挂式，水平进出。多芯过滤器可设计成落地式。（2）有些使用场合根据实际需要分成预过滤器、精过滤器两种。（3）空气流向：从外向内穿过滤芯。
25、（4）进入除菌过滤器的压缩空气必须先经过至少三级的精密过滤器及干燥机。除油、除水、除尘，油雾浓度应0.01PPM，否则将影响除菌滤芯的寿命，达不到预期的除菌效果。（5）定期杀菌，根据实际使用情况每周或每月12次，每次30分钟，采用经过1过滤精度的洁净饱和蒸汽杀菌。蒸汽温度140，蒸汽压力0.3MPa。阀门缓慢开关。（6）作为罐体、设备的呼吸器使用时，其作用主要在于连通大气防止设备内部负压和隔离开空气中的污染源，过滤方面的功能不大，因此在过滤上基本无要求。七，半成品七，半成品检定定重组人胰岛素半成品检测（检测提取纯化后重组人胰岛素样品）：重组人胰岛素半成品检测（检测提取纯化后重组人胰岛素样品）：
26、（一）杂质检定（一）杂质检定1，有关物有关物质：取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含3.5mg的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液20l注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，含A21脱酰胺人胰岛素不得过1.5%，其他有关物质总量不得过2.0%。2，高分子蛋白高分子蛋白质：取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液，作为供试品溶液。按照分子排阻色谱法试验。以色谱用亲水改性硅胶为填充剂（510m）；冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液（15：20：65）为流动相，流速为每分钟0.5ml，检测波长为276nm。取重组人胰岛素单体-二聚体对照品，用0
27、.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液；取100l注入液相色谱仪，重组人胰岛素单体与二聚体的分离度应符合要求。取供试品溶液100l，注入液相色谱仪，记录色谱图，除去保留时间大于人胰岛素主峰的其它峰面积，保留时间小于人胰岛素主峰的所有峰面积之和不得过1.0%。22，锌，锌，锌，锌：对照品溶液的制备：对照品溶液的制备精密量取锌标准溶液（精密量取锌标准溶液（1000g/ml1000g/ml）5ml5ml，置，置100ml100ml量瓶中，加量瓶中，加0.01mol/L0.01mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀。供试品溶液的制备盐酸溶液至刻度，摇匀。供试品溶液的制备精密称取本品适量，用精密称
28、取本品适量，用0.01mol/L0.01mol/L盐酸溶液制成每盐酸溶液制成每1ml1ml中含锌约中含锌约0.40.8g0.40.8g的的溶液，摇匀。测定法精密量取对照品溶液，用溶液，摇匀。测定法精密量取对照品溶液，用0.01mol/L0.01mol/L盐酸溶液分别稀释盐酸溶液分别稀释成每成每1ml1ml锌含量为锌含量为0.20g0.20g、0.40g0.40g、0.60g0.60g、0.80g0.80g、1.00g1.00g的溶液。将的溶液。将上述各溶液与供试品溶液，照原子吸收分光光度法，在上述各溶液与供试品溶液，照原子吸收分光光度法，在213.9nm213.9nm的波长处的波长处测定，按干
29、燥品计，含锌量不得过测定，按干燥品计，含锌量不得过1.0%1.0%。33，炽灼残渣，炽灼残渣，炽灼残渣，炽灼残渣 ：取本品约取本品约0.2g0.2g，依法检查，遗留残渣不得过，依法检查，遗留残渣不得过2.0%2.0%。（二）效价测定：（二）效价测定：（二）效价测定：（二）效价测定：按照高效液相色谱法测定按照高效液相色谱法测定取本品适量，精密称定，用取本品适量，精密称定，用0.01mol/L0.01mol/L盐酸溶液定量稀释至每盐酸溶液定量稀释至每1ml1ml中约含中约含1010单位的溶液（临用新配）。精密量取单位的溶液（临用新配）。精密量取2020ll注入液相色谱仪，记录色谱图；注入液相色谱仪
30、，记录色谱图；另取重组人胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以人胰岛素峰面积另取重组人胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以人胰岛素峰面积（包括（包括A21A21脱酰胺峰面积）计算，即得。脱酰胺峰面积）计算，即得。（三）胰（三）胰岛素生物素生物测定法：定法：溶剂制备溶剂制备 容器处理容器处理 工艺流程工艺流程 （四）注射液制备流程：（四）注射液制备流程：冷冻干燥技术冷冻干燥技术冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。冷冻干燥有下列优点：一冷冻干燥在低温下进行，
31、因此对于许多热敏性的物质特别适用。如蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力。因此在医药上得到广泛地应用。二在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小，适合一些化学产品，药品和食品干燥。三在冷冻干燥过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性装。四由于在冻结的状态下进行干燥，因此体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象。五干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状。六由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护。七干燥能排除 95-99%以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质。因此，冷冻干燥目前在医药工业，
32、食品工业，科研和其他部门得到广泛的应用。11，渗透压摩尔浓度，渗透压摩尔浓度，渗透压摩尔浓度，渗透压摩尔浓度：除另有规定外，静脉输液及椎管注射用注射液按各品种除另有规定外，静脉输液及椎管注射用注射液按各品种项下的规定，照渗透压摩尔浓度测定法检查，应符合规定。项下的规定，照渗透压摩尔浓度测定法检查，应符合规定。22，可见异物，可见异物，可见异物，可见异物:除另有规定外，照可见异物检查法检查，应符合规定。除另有规定外，照可见异物检查法检查，应符合规定。3 3，不溶性微粒，不溶性微粒，不溶性微粒，不溶性微粒：除另有规定外，溶液型静脉用注射液、注射用无菌粉末及注：除另有规定外，溶液型静脉用注射液、注射
33、用无菌粉末及注射用浓溶液照不溶性微粒检查法检查，均应符合规定。射用浓溶液照不溶性微粒检查法检查，均应符合规定。3 3，无菌，无菌，无菌，无菌:按照无菌检查法检查，应符合规定。按照无菌检查法检查，应符合规定。4 4，细菌内毒素或热原：，细菌内毒素或热原：，细菌内毒素或热原：，细菌内毒素或热原：除另有规定外，静脉用注射剂按各品种项下的规定，除另有规定外，静脉用注射剂按各品种项下的规定，照细菌内毒素检查法或热原检查法检查，应符合规定。照细菌内毒素检查法或热原检查法检查，应符合规定。（五）注射液检测：（五）注射液检测：热原（热原（热原（热原（pyrogenpyrogen）1.1.热原的定义热原的定义热
34、原的定义热原的定义 :注射后能引起人体特殊致热反应的物质。注射后能引起人体特殊致热反应的物质。注射后能引起人体特殊致热反应的物质。注射后能引起人体特殊致热反应的物质。2.2.热原的组成热原的组成热原的组成热原的组成 :热原是微生物的代谢产物，是微生物的一种内热原是微生物的代谢产物，是微生物的一种内热原是微生物的代谢产物，是微生物的一种内热原是微生物的代谢产物，是微生物的一种内毒素，大多数细菌都能产生热原，革兰氏阴性杆菌致热力最强。热毒素，大多数细菌都能产生热原，革兰氏阴性杆菌致热力最强。热毒素，大多数细菌都能产生热原，革兰氏阴性杆菌致热力最强。热毒素，大多数细菌都能产生热原，革兰氏阴性杆菌致热
35、力最强。热原由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物，其中脂多糖是致热活原由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物，其中脂多糖是致热活原由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物，其中脂多糖是致热活原由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物，其中脂多糖是致热活性中心。脂多糖组成因菌种的不同而异，热原的分子量性中心。脂多糖组成因菌种的不同而异，热原的分子量性中心。脂多糖组成因菌种的不同而异，热原的分子量性中心。脂多糖组成因菌种的不同而异，热原的分子量106106左右。左右。左右。左右。3.3.热原的危害热原的危害热原的危害热原的危害 :含热原的注射剂输入人体后，约半小时人体就含热原的注射剂输入人体后，约半小时人体
36、就含热原的注射剂输入人体后，约半小时人体就含热原的注射剂输入人体后，约半小时人体就发冷、寒战、体温升高、全身痛、出汗、恶心呕吐等，严重时高烧发冷、寒战、体温升高、全身痛、出汗、恶心呕吐等，严重时高烧发冷、寒战、体温升高、全身痛、出汗、恶心呕吐等，严重时高烧发冷、寒战、体温升高、全身痛、出汗、恶心呕吐等，严重时高烧4040度、昏迷、虚脱、甚至死亡。度、昏迷、虚脱、甚至死亡。度、昏迷、虚脱、甚至死亡。度、昏迷、虚脱、甚至死亡。八，成品八，成品检定定重组人胰岛素成品检测（即检测重组人胰岛素注射液样品）：重组人胰岛素成品检测（即检测重组人胰岛素注射液样品）：重组人胰岛素成品检测（即检测重组人胰岛素注射
37、液样品）：重组人胰岛素成品检测（即检测重组人胰岛素注射液样品）：本品为重组人胰岛素的无菌水溶液。其效价应为标示量的本品为重组人胰岛素的无菌水溶液。其效价应为标示量的90.090.0110.110.。本品可加入适量的苯酚或间甲酚作抑菌剂。本品可加入适量的苯酚或间甲酚作抑菌剂。【鉴别鉴别】（11）取本品，按照重组人胰岛素项下的鉴别项试验，显相同的结果。取本品，按照重组人胰岛素项下的鉴别项试验，显相同的结果。（22）在苯酚或间甲酚检查项下记录的色谱图中，供试品溶液中苯酚峰或间）在苯酚或间甲酚检查项下记录的色谱图中，供试品溶液中苯酚峰或间甲酚峰的保留时间应与苯酚或间甲酚对照品的保留时间一致。甲酚峰的保
38、留时间应与苯酚或间甲酚对照品的保留时间一致。【检查检查】11，有关物质，有关物质，有关物质，有关物质取本品，每取本品，每1ml1ml中加中加9.6mol9.6molLL盐酸溶液盐酸溶液3l3l酸化，混匀后作为酸化，混匀后作为供试品溶液；取供试品溶液适量（约相当于人胰岛素供试品溶液；取供试品溶液适量（约相当于人胰岛素22单位），按照重组人单位），按照重组人胰岛素项下的方法检查，扣除苯酚峰和间甲酚峰，按面积归一化法计算，胰岛素项下的方法检查，扣除苯酚峰和间甲酚峰，按面积归一化法计算，A21A21脱酰胺人胰岛素不得过脱酰胺人胰岛素不得过2.0%2.0%，其他有关物质总量不得过，其他有关物质总量不得过
39、6.0%6.0%。22，高分子蛋白质，高分子蛋白质，高分子蛋白质，高分子蛋白质取本品，每取本品，每1ml1ml加加9.6mol9.6molLL盐酸溶液盐酸溶液3L3L酸化，混酸化，混匀后作为供试品溶液；取供试品溶液匀后作为供试品溶液；取供试品溶液100L100L，按照重组人胰岛素项下，按照重组人胰岛素项下方法检查，除去保留时间大于人胰岛素主峰的其它峰面积，保留时间方法检查，除去保留时间大于人胰岛素主峰的其它峰面积，保留时间小于人胰岛素主峰的所有峰面积之和不得过小于人胰岛素主峰的所有峰面积之和不得过2.0%2.0%。3 33 3，锌：，锌：，锌：，锌：取本品适量，用取本品适量，用0.01mol/
40、L0.01mol/L盐酸溶液制成每盐酸溶液制成每1ml1ml含锌约含锌约0.40.40.8g0.8g的溶液作为供试品溶液，按照重组人胰岛素项下的方法检查，的溶液作为供试品溶液，按照重组人胰岛素项下的方法检查，每每100100单位中含锌量应为单位中含锌量应为101040g40g。44，苯酚或间甲酚：，苯酚或间甲酚：，苯酚或间甲酚：，苯酚或间甲酚：取苯酚或间甲酚（纯度取苯酚或间甲酚（纯度99.599.5），精密称定，），精密称定，用用0.01mol0.01molLL盐酸溶液定量稀释制成每盐酸溶液定量稀释制成每1ml1ml中约含苯酚或间甲酚中约含苯酚或间甲酚0.25mg0.25mg的溶液，作为苯酚或
41、间甲酚对照品溶液；精密量取本品适量，的溶液，作为苯酚或间甲酚对照品溶液；精密量取本品适量，用用0.01mol0.01molLL盐酸溶液定量稀释成每盐酸溶液定量稀释成每1ml1ml约含苯酚或间甲酚约含苯酚或间甲酚0.25mg0.25mg的的溶液，作为供试品溶液。按照重组人胰岛素效价测定项下方法检查，溶液，作为供试品溶液。按照重组人胰岛素效价测定项下方法检查，检测波长为检测波长为270nm270nm。取重组人胰岛素对照品适量，用苯酚或间甲酚对。取重组人胰岛素对照品适量，用苯酚或间甲酚对照品溶液制成每照品溶液制成每1ml1ml中含重组人胰岛素中含重组人胰岛素1mg1mg的溶液，取的溶液，取20l20
42、l注入液相注入液相色谱仪，苯酚峰、间甲酚峰与人胰岛素主峰的分离度应符合要求。精色谱仪，苯酚峰、间甲酚峰与人胰岛素主峰的分离度应符合要求。精密量取苯酚或间甲酚对照品溶液及供试品溶液各密量取苯酚或间甲酚对照品溶液及供试品溶液各20L20L，分别注入液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。每相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。每1ml1ml含苯酚或间含苯酚或间甲酚应为甲酚应为2.002.002.75mg2.75mg。九，包装九，包装生物制品包装规程生物制品包装规程生物制品包装规程生物制品包装规程1.1.同一车间有数条包装生产线同时进行包装时，各包装线之间应同一车间有数条包装
43、生产线同时进行包装时，各包装线之间应有隔离设施。外观相似的制品不得在相邻的包装线上包装。每条有隔离设施。外观相似的制品不得在相邻的包装线上包装。每条包装线均应标明正在包装的药品名称、批号。包装线均应标明正在包装的药品名称、批号。2.2.药品的内包装和外包装标签的内容、格式应符合国家药品监督药品的内包装和外包装标签的内容、格式应符合国家药品监督管理部门的有关规定。管理部门的有关规定。3.3.包装制品应在包装制品应在2525以下进行。有专门规定者应按各论执行。以下进行。有专门规定者应按各论执行。4.4.瓶签要求贴牢，直接印字的制品要求字迹清楚，不易脱落或模瓶签要求贴牢，直接印字的制品要求字迹清楚，
44、不易脱落或模糊，瓶签内容不得用粘贴、剪贴的方式进行修改或补充。糊，瓶签内容不得用粘贴、剪贴的方式进行修改或补充。5.5.制品包装全部完成后，在未收到产品合格证前，应在待检区封制品包装全部完成后，在未收到产品合格证前，应在待检区封存。收到合格证后，方可填写入库单，交送成品库。存。收到合格证后，方可填写入库单，交送成品库。6.6.每个最小包装盒内均应附有药品说明书。每个最小包装盒内均应附有药品说明书。7.7.药品说明书应符合药品说明书应符合中华人民共和国药品管理法中华人民共和国药品管理法及国家药品及国家药品监督管理部门对药品说明书的规定，并根据国家药品监督管理部监督管理部门对药品说明书的规定，并根据国家药品监督管理部门批准的内容编写。门批准的内容编写。粉针剂示意图安瓿注射剂示意图成品成品小组成员：小组成员：小组成员：小组成员：沈迪、曾宇、屠言贝、张钰英、张寒沈迪、曾宇、屠言贝、张钰英、张寒沈迪、曾宇、屠言贝、张钰英、张寒沈迪、曾宇、屠言贝、张钰英、张寒光、温馨、谢丹、王亮杰、郭正兵、光、温馨、谢丹、王亮杰、郭正兵、光、温馨、谢丹、王亮杰、郭正兵、光、温馨、谢丹、王亮杰、郭正兵、周明毅周明毅周明毅周明毅