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1、不同浓度氯化钴诱导小鼠海马神经元细胞缺氧损伤模型的比较肖婷婷1，王莉1，曹相玫2，倪新莉1*(宁夏医科大学: 1.临床医学院，2.基础医学院，银川 750004 )基金项目:国家自然科学基金地区项目（81660229）; 宁夏科技创新领军人才项目（KJT2015017）* 通讯作者:倪新莉 电话: 13909586966; E-mail: 1284813176;【摘要】 目的:研究不同浓度的氯化钴 (CoCl2)诱导小鼠海马神经元细胞（HT22）缺氧损伤模型的比较。方法:用不同浓度 (0、50、100、200mol/L) CoCl2建立HT22细胞缺氧模型。通过HE染色观察HT22细胞轴突生长
2、的特征，CCK8法检测HT22细胞体外增殖活性的变化， 同时，Western Blot检测HT22细胞中HIF-1、tau5的表达情况。结果: HE显示CoCl2可致HT22细胞轴突断裂，CCK8显示CoCl2对HT22细胞增殖抑制作用表现出浓度依赖性。Western Blot显示CoCl2浓度为200mol/L时, HIF-1、Tau5蛋白表达与对照组相比差异有统计学意义。 结论：CoCl2可剂量依赖性上调HT22细胞HIF-1表达，致轴突损伤及tau5降低，建立细胞缺氧模型简单易行。【关键词】HT22细胞; 氯化钴; 轴突；HIF-1Comparison of hypoxic injury
3、 models of hippocampal neurons induced by different concentrations of cobalt chloride in miceXiao Tingting1, Wang Li1,Cao Xiangmei2,Ni Xinli1 *( 1.SchoolofClinicalMedicine, 2.School of Basic Medicine,，Ningxia Medical University Yinchuan 750004, China)Abstract: Objective: To compare the hypoxia injur
4、y model of mouse hippocampal neuron cells (HT22) induced by different concentrations of cobalt chloride (CoCl2). Methods: The hypoxia model of HT22 cells was established with different concentrations (0, 50, 100, 200 mol / L) of CoCl2. The characteristics of axon growth of HT22 cells were observed b
5、y HE staining. The CCK8 method was used to detect the changes of HT22 cell proliferation activity in vitro. At the same time, Western Blot was used to detect the expression of HIF-1 and tau5 in HT22 cells. Results: HE showed that CoCl2 could cause axon rupture in HT22 cells, and CCK8 showed that CoC
6、l2 had a concentration-dependent inhibition effect on HT22 cell proliferation. Western Blot showed that when the concentration of CoCl2 was 200 mol / L, the expressions of HIF-1 and Tau5 protein were significantly different from those of the control group. Conclusion: CoCl2 can up-regulate HIF-1 exp
7、ression in HT22 cells in a dose-dependent manner, cause axonal damage and decrease tau5, and it is easy to establish a model of cell hypoxia.Keywords HT22 cells; Cobalt chloride; axons; HIF-1缺氧缺血性（hypoxia ischemia，HI）脑损伤是窒息、心脏骤停以及心肺复苏后最常见的神经系统后遗症，也是致残致死的严重疾病之一。有研究表明HI脑损伤后期的脑瘫、癫痫、行为和学习障碍可能与神经元轴突功能异常有
8、关1,2，但缺氧缺血对神经元轴突生长的具体作用还有待证实。常用细胞缺血缺氧模型制备需要包括三气培养箱、气源等设备3。在实验室基础设施有限的条件下，本研究利用CoCl2构建HT22细胞缺氧模型，通过形态学观察缺氧对神经元细胞增殖及轴突生长的影响，以及缺氧诱导因子HIF-1和轴突标志蛋白tau5的表达，为研究轴突对HI脑损伤远期功能的影响奠定实验基础。1 材料与方法1.1 细胞与主要试剂小鼠海马神经元细胞系HT22, 由宁夏医科大学组织与胚胎学黑长春教授惠赠。DMEM/F12培养液购自美国Hyclone公司；胎牛血清FBS购自BI公司；氯化钴购自上海广诺化学科技有限公司；抗HIF-1抗体、抗 -a
9、ctin 抗体均购自北京博奥森公司；抗tau5抗体购自abcam公司；HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗和山羊抗小鼠 IgG 二抗购自Abbkine公司；CCK-8试剂盒购自上海尚宝公司；全蛋白提取试剂盒、 BCA蛋白含量检测试剂盒和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒均购自江苏凯基生物技术股份有限公司。 1.2 实验方法 1.2.1细胞培养小鼠海马神经元细胞系HT22接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液中， 置于37 、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养, 细胞复苏后, 培养12代进行缺血缺氧细胞的模型建立。1.2.2 缺血缺氧细胞模型的制备 将适量的化学缺氧剂CoCl2溶于
10、DMEM/F12培养基中, 配制成1000mmol/L的母液, 分装入EP管, -20冰箱保存。待细胞培养至对数生长期后，用不同终末浓度（0mol/L、50mol/L、100mol/L、200mol/L）的氯化钴培养基干预细胞24小时，用于模拟细胞缺氧微环境。1.2.3CCK8法检测 将对数生长期HT22细胞以1104个接种于96孔板，每组设5个复孔，24小时细胞贴壁后，向每孔加入氯化钴终浓度为：0umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L的培养基，培养24小时后换液，加入正常培养液每孔100l及CCK8 溶 液每孔10l，孵育2小时后，用酶标仪测定在450 nm处
11、的吸光度。 1.2.4 HE染色 调整细胞密度至4104个/ml，以500l/孔接种于24孔板进行细胞爬片，过夜贴壁后用氯化钴进行缺氧干预。24h后用4%多聚甲醛固定，苏木素-伊红（HE）染色，脱水后中性树胶封片。显微镜下观察神经元轴突损伤情况、拍照。1.2.5 Western Blot 收集不同浓度 (0、50、100、200mol/L) CoCl2诱导24 h的HT22细胞, 提取全蛋白100煮沸5min, 冷却后 (10000 r/min 1 min) 离心, 蛋白变性后保存于-80备用。用 BCA试剂盒定量蛋白，使用等量蛋白( 50 g/10 l) 上样进行聚丙烯氨凝胶电泳，湿转电泳转
12、移蛋白至PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭2h，用WB 一抗稀释液稀释一抗 ( HIF-1 1 500、tau5 1:1000、 -actin 1 1000) 4孵育过夜。二抗 ( 山羊抗兔 IgG，山羊抗鼠 IgG 1 2000) 室温孵育 1 h，化学发光试剂显色1 min，曝光并进行灰度测量。1.3统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。各独立实验均重复3次，计量资料以xs 表示，CoCl2干预组和空白对照组的比较，采用独立样本t 检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 CoCl2对HT22细胞增殖能力影响 HT22细胞在含有不同浓度（50、100、200mol/L
13、）CoCl2的培养基中培养24h后，细胞增殖能力与阴性对照组比较，细胞活性显著降低，差异具有统计学意义（Fig1A）。提示：氯化钴明显抑制小鼠HT22细胞的生长，且呈剂量依赖性。形态观察结果显示，对照组HT22细胞贴壁，分散均匀。细胞伸出单个或多个突起，呈锥形立体感较强。CoCl2损伤后，细胞突起变短或丢失、胞体变圆，细胞立体感下降。且随着氯化钴浓度的升高，细胞损伤程度逐渐加重（Fig1B）。Fig.1: Effect of CoCl2 on the proliferation ability of HT22 cells: * represents P 0.01, * represents P
14、 0.001, and A: CCK8 detects cell viability. B: Morphological observation (20X inverted microscope). 2.2 CoCl2对HIF-1蛋白表达的影响细胞经CoCl2处理后，Western blot-ting检测HIF-1蛋白表达。实验结果显示，正常情况下，HIF-1蛋白在HT22细胞中的表达非常低。随着氯化钴浓度的增加，HIF-1蛋白表达逐渐增多，当氯化钴浓度为100mol/L时,与对照组相比差异具有统计学意义P0.05。当氯化钴浓度为200mol/L时，HIF-1蛋白表达与对照组相比差异更加显著P
15、0.01（Fig2）。Fig.2:The expression of HIF-1 protein level of HT22 cells was detected by Western Blot in each group A: shows HIF-1 and -actin detected in 92 kD and 42 kD，respectively; B: shows the relative protein expression of HIF-1 in HT22 cells * Represents P 0.05, * represents P 0.01. 2.3 CoCl2对HT22
16、细胞轴突生长的影响 HT22细胞经不同浓度（0、50、100、200mol/L）CoCl2处理后，HE染色观察可见，随着干预浓度的增加，神经元轴突逐渐缩短、断裂（Fig3A,B）。W-b测定轴突标志物蛋白Tau5的表达，结果显示，随着损伤程度的增加，Tau5蛋白的表达量呈剂量依赖性降低，与对照组相比差异具有统计学意义P0.05。且氯化钴浓度为200mol/L时，Tau5蛋白的表达量最低（Fig3C,D）。Fig.3: Effect of CoCl2 on axon growth of HT22 cells: HE staining observation: A (10X upright mic
17、roscope), B (20X upright microscope); C:The expression of Tau5 protein level of HT22 cells was detected by Western Blot in each groupD: shows the relative protein expression of Tau5 in HT22 cells,* Represents P 0.05, * represents P 0.01.3 讨论 钴是缺氧样反应中著名的化学诱导剂之一4,5，是一种具有广泛工业和生物应用的铁磁金属。一些报道显示，在不同来源的细胞中
18、，氯化钴（CoCl2）可以决定HIF-1调节亚基的稳定性，从而激活促红细胞生成素，VEGF和其他基因6,7。钴通过取代卟啉环中的铁来激活细胞氧传感器8，从而导致细胞和组织缺氧，并上调细胞内HIF-1的表达。有研究表明CoCl2可能通过以下两种方式来增加HIF-1的蛋白表达：一是通过蛋白酶体抑制HIF-1的降解，增加其稳定性；二是通过ROS形成直接增强HIF-1的稳定9-11。神经元是一种高度分化的细胞，是神经系统的基本结构和功能单位。轴突作为神经元的组成结构，具有输出胞体整合的神经电信号的功能。既往研究显示，缺氧缺血后神经元轴膜通透性改变、轴突外侧 Ga2+内流、蛋白酶激活、线粒体结构破坏、功
19、能受损、轴突断裂，无法延伸；同时，缺氧选择性的改变了髓鞘磷脂蛋白在发育中脑白质髓鞘形成进程中的表达，影响了神经纤维细丝正常的磷酸化，限制了轴突径向生长的能力，导致轴突直径变细、髓鞘厚度变薄，轴突数量减低，突触形成困难12,13。本研究利用CoCl2的作用特性，诱导小鼠海马神经元细胞缺氧。CCK8实验显示，HT22细胞活性显著降低，Western blot实验显示，细胞经CoCl2处理后，HIF-1蛋白的表达显著上调。这在一定程度上证实了本实验采用氯化钴诱导化学缺氧模型的可靠性，与国内外的研究结果一致14,15。神经元轴突功能异常是缺血缺氧脑损伤后神经功能障碍的重要病理基础，本研究形态观察结果显
20、示，随着氯化钴浓度的增加，轴突断裂程度增加。W-b测定轴突标志物蛋白Tau5的表达，结果显示，随着损伤程度的增加，Tau5蛋白的表达量逐渐降低，该结果也和之前文献报道的结果相符16。综上所述，本研究利用氯化钴诱导HT22细胞化学缺氧，操作简便，结果稳定、可靠。并且证明缺氧会使神经元轴突缩短，为改善缺血缺氧后脑功能障碍提供新思路。参考文献1 Ferriero DM. Neonatal brain injury. N Engl J Med 2004; 351: 1985-952 Drobyshevsky A, Jiang R,Lin L,Derrick M, Luo K, Back SA, Tan
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