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1、鱼藤酮对小鼠血脑屏障通透性的影响研究目 录摘 要1Abstract3一、材料和方法41.1实验动物及分组41.2制作动物模型41.3检测方式51.3.1脑组织Evans blue的检测51.3.2紧密连接蛋白的检测51.3.3紧密连接蛋白Claudin-5的检测51.4统计学分析6二、结果62.1鱼藤酮对小鼠脑缺血再灌注候脑组织中Evans blue含量的影响62.2鱼藤酮对小鼠紧密连接蛋白所产生的影响72.3使用免疫荧光法检测小鼠紧密连接蛋白Claudin-57三、讨论8四、结论9参考文献9鱼藤酮对小鼠血脑屏障通透性的影响研究摘 要目的：研究鱼藤酮对于缺血再灌注后小鼠血脑屏障通透性的作用。方
2、法：选取240只健康昆明种小鼠，雌雄小鼠数量相同，将这些小鼠分为假手术组、鱼藤酮治疗脑缺血再灌注组以及脑缺血再灌注组，每组各80只小鼠。然后对鱼藤酮治疗脑缺血再灌注组以及脑缺血再灌注组建立脑缺血再灌注模型，将各组的数据进行对比。结果：小鼠大脑缺血再灌注4小时之后其脑组织中的Evans blue含量在不断增加，在48小时的浓度最高。使用鱼藤酮治疗的小鼠在手术之后Evans blue的浓度要比相同时间脑缺血再灌注组的低，其差别具有统计学意义（P0.05）。经过研究发现，鱼藤酮能够对小鼠大脑紧密连接蛋白产生作用且效果比较明显。结论：这次研究发现鱼藤酮能够对脑缺血再灌注时的紧密连接蛋白以及Evans
3、blue的浓度产生影响，因而拥有抵抗脑缺血再灌注损伤时血脑屏障通透性提升的效果。关键词鱼藤酮 脑缺血再灌注 血脑屏障 通透性Effect of Rotenone on Blood-Brain Barrier Permeability in MiceAbstractObjective: To study the effect of rotenone on blood-brain barrier permeability in mice after ischemia-reperfusion. Methods: A total of 240 healthy Kunming mice were sel
4、ected. The number of male and female mice was the same. The mice were divided into sham operation group, rotenone treatment group and cerebral ischemia reperfusion group. mouse. Then, the cerebral ischemia-reperfusion model was established in the rotenone treatment group and the cerebral ischemia-re
5、perfusion group, and the data of each group were compared. Results: After 4 hours of cerebral ischemia-reperfusion in mice, the content of Evans blue in brain tissue increased continuously, with the highest concentration at 48 hours. The concentration of Evans blue after surgery was lower in the mic
6、e treated with rotenone than in the cerebral ischemia-reperfusion group at the same time (P0.05). Studies have found that rotenone can play a role in the tight junction proteins of mouse brain and the effect is more obvious. Conclusion: This study found that rotenone has an effect on the concentrati
7、on of tight junction proteins and Evans blue during cerebral ischemia-reperfusion, and thus has an effect of improving blood-brain barrier permeability against cerebral ischemia-reperfusion injury.Key words rotenone cerebral ischemia-reperfusion blood-brain barrier permeability血脑屏障（blood brain barri
8、er，BBB）就是由内皮细胞紧密连接、基膜和星状胶质细胞所组成的一种物质调节界面，它处于脑与微血管之间，能够对所出入的物质具有选择性1-2。血脑屏障受损是导致脑缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）脑损伤最关键的病理生理基础。炎症以及免疫反应涵盖白细胞浸润，巨噬细胞启动等都会生成许多蛋白水解酶，氧自由基以及各种效应分子，这就会使脑毛细血管内皮和其基底膜受损，使血脑屏障的完整性受到影响，致使血脑屏障的通透性提升。鱼藤酮（Rotenone）又叫做鱼藤精，很多生物细胞中的线粒体、nadh脱氧酶、丁二酸等等都会对鱼藤酮具有一定的敏感性3-4。鱼藤酮能够抑制setayia cerv
9、i线粒体中由nadph至nadh这个过程，同时丝虫寄生物setaria digitata线粒体中的反丁烯二酸还原酶系统的活性对于鱼藤酮具有高度敏感性。这就能够说明鱼藤酮拥有防止凝固以及预防血栓的作用，从而调节血液流变学，调节微循环异常，提升脑血流量和抗自由基等效果。然而现在临床中对于鱼藤酮对于治疗脑缺血再灌注损伤的研究还很少5-7。这次研究就从血脑屏障的方向对脑缺血再灌注之后的受损状况进行分析，以此来研究鱼藤酮的原理。一、材料和方法1.1实验动物及分组共选取240只健康昆明种小鼠，雌雄小鼠数量相同，这些小鼠的体重为（200.5）g。将这些小鼠分为假手术组、鱼藤酮治疗脑缺血再灌注组以及脑缺血再灌
10、注组，每组各80只小鼠。1.2制作动物模型治疗组小鼠的方案：选取清醒的小鼠，对其颈部实施手术将其双侧颈总动脉分析，使用无创动脉夹阻隔其双侧总动脉血流，持续10分钟，然后除去动脉夹，这就形成了再灌注，之后在无菌的情况下对其颈部皮肤进行缝合。假手术组小鼠的方案：选取清醒的小鼠，只将其颈总动脉分离，不对其颈总动脉实施阻隔。治疗组小鼠在手术前15分钟内对其腹腔注射10mg/kg的鱼藤酮注射液，而剩余两组小鼠实施腹腔注射同等剂量的生理盐水。1.3检测方式1.3.1脑组织Evans blue的检测在处死小鼠1小时之前，对其使用经尾静脉注射浓度为2%的Evans blue，直至小鼠的尾部、四肢、粘膜呈现为蓝
11、色，在摘除其脑组织前20分钟内对其实施心脏灌注生理盐水一直到流出清亮液体为止。取出小鼠脑组织后，使用电子天平称量大脑重量，然后将其放到试管之中，同时注入3mL的甲酰胺制作成匀浆，将其放到温度为45的水浴箱中培育两天，然后再将其放到3000r/min的离心机中，离心5分钟之后选取上清液，使用721分光光度计比色（=632mm）。1.3.2紧密连接蛋白的检测采用裂解液裂解同时研磨大脑组织，将总蛋白提取出来，使用BCA法检测蛋白定量，使用SDS-PAGE电泳并分离总蛋白，再将其转移到PVDF膜上，使用浓度为5%的脱脂牛奶封闭1小时之后，使用occludin抗体、抗ZO-1抗体和抗GAPDH抗体在温度
12、为4的温度下培育12小时。在使用TBST对PVDF膜清洗之后，注入HRP标记的羊抗兔，在室温条件下培育1小时，使用ECL发光液进行显影，同时使用X光压片进行曝光。采用Quantity One软件对条带对其进行研究。1.3.3紧密连接蛋白Claudin-5的检测在模型建造完毕之后，使用浓度为3.6%的水合氯醛对小鼠实施腹腔麻醉，然后使用浓度为4%的多聚甲醛对小鼠进行灌注固定，选取针道前后1.5mm左右的脑组织，将其放到包埋架之中同时注入浓度为4%的多聚甲醛在温度为4的情况下固定1天。然后对其使用乙醇进行脱水，同时在使用二甲苯对其透明之后对其进行浸蜡以及包埋。将石蜡标本进行切片，每片的厚度在4m，
13、在室温状态下晾干，然后放到烤箱中烤片保存。对石蜡切片进行正常脱蜡，饭后注入柠檬酸缓冲液放到微波炉中加热对其进行抗原修复，取出后将其放到室温状态下进行冷却，冷却完毕之后使用PBS进行冲洗。使用过氧化物酶对其进行阻断，使用正常山羊血清对其进行封闭，然后注入50L兔抗Rho激酶，然后在温度为4的情况下培育12小时；然后注入即用型生物素标记的羊抗兔二抗IgG，在室温下培育15分钟；再注入SABC溶液在室温状态下培育15分钟；在使用DAB显色之后，使用蒸馏水对其进行冲洗知道反应停止。免疫组化染色结果按照显色之后血管附近呈现棕色或者是棕褐色的颗粒或者是线条状时所名为阳性。使用Image-Pro Plus图
14、像分析软件去评估阳性结果的强度。每只大鼠选取3张石蜡切片，在高倍镜下随意选取5个区域去检测吸光度值，之后再减掉背景区的平均值，这样就能够得到Rho激酶或者是p-MLC的平均吸光度值，将3张切片的平均值当做最终的数据。1.4统计学分析使用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，使用（xs）来表示计量资料，采用t及q检测均数间的对比。二、结果2.1鱼藤酮对小鼠脑缺血再灌注候脑组织中Evans blue含量的影响在这次研究中发现，小鼠大脑缺血再灌注4小时之后其脑组织中的Evans blue含量在不断增加，在48小时的浓度最高。使用鱼藤酮治疗的小鼠在手术之后Evans blue的浓度要比相同时间脑
15、缺血再灌注组的低，其差别具有统计学意义（P0.05）。附图1。图1脑缺血再灌注治疗组小鼠与脑缺血再灌注小鼠Evans blue浓度对比Figure 1 Comparison of Evans blue concentration in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury and cerebral ischemia-reperfusion72 hours2.2鱼藤酮对小鼠紧密连接蛋白所产生的影响这次发现将鱼藤酮治疗组小鼠和脑缺血再灌注组小鼠进行对比发现，治疗组小鼠的大脑紧密连接蛋白产生反应且效果明显。附图2。图2脑缺血再灌注治疗组小鼠与脑
16、缺血再灌注小鼠紧密连接蛋白对比Figure 2 Comparison of tight junction proteins in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury and cerebral ischemia-reperfusion2.3使用免疫荧光法检测小鼠紧密连接蛋白Claudin-5这次研究使用免疫荧光染色法检测发现，治疗组紧密连接蛋白Claudin-5的含量和脑缺血再灌注组相比，治疗组紧密连接蛋白Claudin-5含量呈明显下降的趋势，附图3。图3免疫荧光染色法检测脑缺血再灌注治疗组小鼠与脑缺血再灌注小鼠紧密连接蛋白状况Figu
17、re 3 Immunofluorescence staining for detection of tight junction protein in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury and cerebral ischemia-reperfusion三、讨论血脑屏障是脑屏障的一个关键组成，它的位置是在血液和中枢神经系统的神经组织之间，它是由内皮细胞紧密连接、基膜和星状胶质细胞所组成的一种物质调节界面，能够对所出入的物质具有选择性。血脑屏障受损是导致脑缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）脑损伤最关键的病理生理基
18、础，然而星形胶质细胞会对血脑屏障的完整性产生引导以及维持的效果。纤维连接蛋白、层黏连蛋白以及型蛋白共同组成了基底膜。血脑屏障对所通过的内皮细胞具有高度的选择性以及通透性，能够阻止毒素以及其他物质进入到达到，以此来保护神经系统内环境的稳定性，它和神经元的代谢、生长、发育等等有紧密联系。经常将Evans blue的浓度当做评判血脑屏障通透性的一个标准8-11。Evans blue系的小分子在和血浆蛋白融合之后，无法穿过血脑屏障，这是最为普遍的BBB指示剂，当血脑屏障受损时，Evans blue会和血浆蛋白融合进入到大脑之中，会使血脑屏障受损的部位产生蓝染，这时能够采用检测脑组织中Evans blu
19、e的浓度来分析血脑屏障的受损状况。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是构成血脑屏障基底膜的主要物质，而细胞外基质是由内皮细胞中的各种蛋白质以及非蛋白质构成的，它拥有支持、连接、营养等各种效果，细胞外基质以及基底膜的降解会对血管产生影响，从而对血脑屏障的通透性产生一定的作用12-15。和降解ECM的相关的蛋白酶主要为4大类：（1）丝氨酸蛋白酶类。（2）半胱氨酸蛋白酶类。（3）天冬氨酸蛋白酶类。（4）MMPs，在这之中尤为因组织特异性的差别，MMPs可分成：胶原酶、明胶酶、间质溶素等等。当出现脑缺血再灌注之后会产生许多白细胞浸润，白细胞被启动之后会生成许多蛋白水解酶，在
20、这之中主要以MMPs酶类为主。在脑组织中的许多细胞都能够生成MMPs，涵盖有胶质细胞、小胶质细胞、毛细血管内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等等。MMPs是一类Zn依赖性酶，能够经过降解基底膜细胞外基质从而打开血脑屏障。这次研究对两组小鼠使用免疫荧光染色后发现，脑缺血再灌注组小鼠紧密连接蛋白claudin-5在血脑屏障内皮细胞之间具有较强的表达能力，而治疗组小鼠的紧密连接蛋白claudin-5在1天后的表达能力会逐渐降低，在48小时达到最低，7天后小鼠紧密连接蛋白claudin-5的表达能力恢复正常。四、结论通过此次研究可以得出，鱼藤酮能够干预脑缺血再灌注时所出现的Evans blue浓度以及紧密
21、连接蛋白等，使其拥有抵抗脑缺血再灌注受损时血脑屏障通透性上升的效果。值参考文献1Small DL, Morley P, Buchan AM, et al. Biology of ischemic cerebral cell death. Prog Cardiovasc Dis , 2016 ;42(3):185207.2 Heo JH, Lucero J, Abumiya J, et al. Matrix metalloproteinases increase very early during experimental focal cerebral ischemia. J Cerebral
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