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1、 题 目： 芽孢杆菌提取物脂肽类物 质对党参灰霉病的抑制作用 2.目录摘要1关键词11.前言31.1灰霉病及其防治方法31.2芽孢杆菌41.3研究目的及意义42.材料与方法52.1供试材料52.2方法52.2.1芽孢杆菌发酵及制备粗提物52.2.2粗提物的分离与纯化52.2.3芽孢杆菌粗提物对灰霉菌分生孢子萌发影响52.2.4芽孢杆菌粗提物对离体叶片发病率影响62.3数据统计与分析63.结果与分析73.1芽孢杆菌提取物分离与鉴定73.2芽孢杆菌粗提物对灰霉菌分生孢子萌发影响7 3.3芽孢杆菌粗提物对离体叶片发病率影响84.结论与讨论9参考文献10致谢12芽孢杆菌提取物脂肽类物质对党参灰霉病的抑
2、制作用摘 要:由于化学制剂对植物病害防治造成的环境问题越来越多，环保问题愈加显著，生物防治以其无害无污染的优点逐渐成为生物病害防治的焦点。本研究从短小芽孢杆菌粗提物中分离纯化得到脂肽surfactin，并通过离体实验和体外防治实验测定其对党参灰霉病的抑制作用。实验结果表明，从短小芽孢杆菌粗提物中分离出的脂肽surfactin对党参灰霉病具有抑制作用，经高浓度（50 m）脂肽surfactin处理24 h后，灰葡萄孢菌孢子萌发率为14.41，对照为90.10；在离体叶片上，经高浓度（50 m）脂肽surfactin处理24 h后，灰霉病发病率为23.34，对照为83.34。脂肽surfactin
3、对党参灰霉病菌的孢子萌发和离体感染表现出有效抑制，有作为防治党参灰霉病生物农药的潜力。关键词：党参；芽孢杆菌；脂肽Surfactin；灰霉菌；抑制作用Inhibitory effect of Bacillus extract-lipopeptide on codonopsis pilosula gray moldAbstract:As more and more environmental problems are caused by chemical agents to the control of plant diseases, and the environmental problems
4、 become more and more significant, biological control has gradually become the focus of biological disease control because of its harmless and pollution-free advantages. In this study, lipopeptide surfactin was obtained from bacillus SPP.The results showed that the Lipopeptide surfactin isolated fro
5、m crude extracts of Bacillus pumilus could inhibit the growth of Botrytis cinerea, the germination rate of Botrytis cinerea spores was 14.41% , the control was 90.10% after treated with high concentration (50 m) Lipopeptide surfactin for 24 h, the incidence of Botrytis cinerea was 23.34% and the con
6、trol was 83.34% after treated with high concentration (50 m) Lipopeptide surfactin for 24 h. The lipopeptide surfactin can effectively inhibit the spore germination and in vitro infection of codonopsis Pilosula, which has the potential to be used as a biological pesticide against codonopsis pilosula
7、.Key words:Codonopsis:Bacillus；Lipopeptide Surfactin；inhibition1前言党参是我国常见的药用植物，为桔梗科多年生缠绕或直立草本植物，通常以根入药，性平，味甘，具有补中益气、养血生津之功效，主要用于治疗脾肺虚弱、气血两亏、体倦无力等症1。我国的党参资源十分丰富,由于党参适宜复杂多样的生态环境，在山地、林缘、灌丛等环境中均可生长，在我国东北、华北及西北等各省都有分布，近年来随着党参市场需求量的逐年增大，造成野生党参资源逐渐匮乏，所以现在党参市场多为人工种植。随着种植面积的逐渐增大，党参病害发生日益严重,其中灰霉病已成为危害我国党参的主要病
8、害 2。1.1灰霉病及其防治方法灰霉菌，又称为灰葡萄孢菌，主要危害植物的叶片、茎蔓、残花和花托等部位。该病菌的适应能力和生存能力极强，既可以从活体的植物组织中摄取营养，也可以在死亡的残体中生存，属于半活体营养型病菌。该病害首先危害靠近地面的隐蔽叶片、茎蔓，茎叶受害后出现大片软腐，产生灰褐色及褐色绒状霉层。灰霉病病菌的致病能力极强，一旦侵入植物器官就会迅速表现症状，快速产生新的分生孢子，传染速度快且具有广寄生性，若防治不及时，容易对作物产生严重危害。目前党参灰霉病的防治主要以化学防治为主。有研究者研究表明：宁南霉素1000、2000 mg/kg效果最好，防效分别为90.32%和92.51%；其后
9、为40%苯醚甲硫可湿性粉剂500、1000 mg/kg，30%戊唑咪鲜胺可湿性粉剂500、1000 mg/kg，速克灵500、1000 mg/kg，防治效果均在85%以上3。但是随着化学剂长时间的大量使用，灰霉病菌对很多药剂都产生了不同程度的抗性，防治效果开始大幅降低，同时，化学杀菌剂的长期大量使用对环境造成严重的污染，危害人畜健康 4-5。美国的4株枯草芽孢杆菌GBO3、MB1600、QST713和FZB24获得环保局（EPA）商品化或有限商品化生产应用许可，GBO3、MB1600分别由美国Gustafson公司和Rhizoctonia公司用来防治灰葡萄菌引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害
10、6。在稳定性与化学农药的相容性方面，芽孢杆菌剂明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌剂7。鉴于化学防治的不足，迫使人们寻求党参灰霉病新的防治措施。因此，研制具有环境友好、安全等特性的生物防治药剂已成为国内外灰霉病防治研究的新趋势。1.2芽孢杆菌芽孢杆菌，为革兰氏阳性菌，呈直杆状，常以成对或链状排列，具圆端或方端。芽孢杆菌属微生物都能形成带有芽孢的生物膜，这种特性使得他们能够抵抗各种极端环境，对各种杀菌剂都具有抵抗力，因此，他们在自然环境中分布极其广泛，代谢产物都能产生环肽、抗生素、酸（多聚谷氨酸、聚天冬氨酸）和聚多糖等物质。它可以防治棉花枯萎病8、小麦全蚀病、稻瘟病9、叶枯病、黄瓜苗期猝倒病10、马铃
11、薯疮痂病、蔬菜苗期立枯丝核菌11、小麦根腐病12、苹果轮纹病13等多种植物病害。对于水稻纹枯病等病害，唐文华等14和西南农大分别通过研究B.subtilis B908、B. cereus R2发现，二者具有防治作用；刘颖等15分离的B.subtilis TG-26、林福呈等16提取的Bacillus spp. Xh222、B.subtilis B034以及辛玉成17研究发现的B. subtilis BL03等分别对于不同病原菌有强烈的抑制作用。辛玉成等18从苹果树上分离得到的一株拮抗枯草芽孢杆菌，对Slternaria alternata、Colltotrichum gossypi、Trich
12、othecium roseun、Fusarium spp.等的抑制效果为100%。林东等19研究发现枯草芽孢杆菌S-0113对予Xanthomonas oryzaepvoryzae 有强烈的抑制作用。芽孢杆菌在自然界分布广泛且多样性丰富，可通过抗生作用、竞争作用、诱导植物获得系统抗性和促进植物生长等多种作用机理防治植物病害，芽孢杆菌不会对作物产生影响20-21，所以在植物病害防治方面具有极大的应用潜力。1.3研究目的及意义目前，用于防治植物病害的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、侧孢芽孢杆菌（B. laterosporus）、蜡样芽孢杆菌（B. cereus）、
13、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）、多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、短小芽孢杆菌（B. pumilus）等22-23。有关芽孢杆菌对植物病害防治的研究已有报道。江苏农科院植保所开发的B. subtilis B916已进行农药登记,对水稻纹枯病田间防效持续10年稳定在50%-80%:南京农业大学分离的B. subtilis B3,商品名为麦丰宁”,对小麦纹枯病田间防效达50%-80%24。中国农业大学研制的蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等植物有益芽孢杆菌增产菌系列产品，能使水稻、小麦、蔬菜
14、和经济作物增产20%，并且有良好的防病效果25。但是有关芽孢杆菌提取物对党参灰霉病的防治报道较少，故本试验以党参灰霉菌为研究材料，探究芽孢杆菌提取物中脂肽类物质对党参灰霉菌的抑制作用，为党参灰霉病的生物防治提供一定的理论依据。2材料与方法2.1 供试材料芽孢杆菌与灰霉菌均由西北师范大学生命科学学院植物生态学实验室提供。2.2 方法2.2.1芽孢杆菌发酵及制备粗提物配置100 mlLB培养基，将其加入到250ml平底烧瓶中，每瓶30ml。高温灭菌后，取芽孢杆菌菌饼接种到烧瓶中摇瓶发酵24h,制得发酵液。用离心机（10000,10min）离心发酵液制得上清液，再用ph为5N的盐酸调至2.0左右，放
15、入冰箱冷藏沉淀至少12h,次天取出后将上清液倒掉，留下沉淀物继续离心（10000,10min），然后用100%甲醇提取离心后沉淀物中的有机物质，在旋转蒸发仪上蒸发至得到黄褐色粉末。2.2.2粗提物的分离与纯化将制备得到的粗提物分别用55%，80%，100%的甲醇溶解，制成流动相，利用高效液相色谱仪（Essentia LC-15C，日本岛津）对不同浓度甲醇溶解的粗提物进行分离纯化27。2.2.3芽孢杆菌粗提物对灰霉菌分生孢子萌发影响将纯化后的化合物溶于DMSO中配置浓度为50 g/ml的原液。本实验通过对灰葡萄孢菌的孢子萌发情况进行记录分析作为该纯化化合物的体外评测标准。实验中采用1 m，10
16、m，50 m浓度的纯化复合物，对照组中加入对应等量的DMSO。将灰葡萄菌接种到PDA培养基上，待灰葡萄菌生长成熟后制备分生孢子悬液。将分生孢子悬液用不同浓度的纯化复合物处理后，各取10 l滴于洁净载玻片上，将载玻片上的孢子悬液在恒温箱（28 ，黑暗）中萌发12 h 、24 h。萌发过程结束后，用普通光学显微镜观察分生孢子萌发情况，至少以50个孢子处理计算灰霉菌分生孢子的萌发率，每个浓度三组重复计算，结果表示为均值（SD）。2.2.4芽孢杆菌粗提物对离体叶片发病率影响选用饱满无霉变的党参种子，用1%次氯酸钠消毒1 min，用无菌水冲洗去除种子表面残余物质，然后将种子放到一个干净的培养皿中，加入适
17、量40-45 的无菌水浸泡，边搅拌边放种子，待水温降至不烫手为止时再浸泡5 min；另取一个干净的培养皿（直径=9 cm），培养皿中铺两层灭菌滤纸，用无菌水清洗种子数次后用灭菌镊子放到滤纸表面，上方覆盖两层灭菌滤纸，置于20 恒温培养箱（HPY-9052MBE）中催芽培养，每天早晚用40 水洗一次，保持湿润，45 d后种子萌发时，在干净餐盒中放置300 g灭菌过的土壤，向餐盒中喷洒适量蒸馏水增加土壤水分，以每盒10株的规格将已萌发的党参种子移栽到餐盒浅层土壤中，将餐盒放置在光照培养箱中恒温培养培养（25 ，光周期为12 h黑暗/12 h光照），在培养过程中注意保持土壤水分充足。待党参真叶长到适
18、宜大小后进行感染实验，实验中纯化复合物浓度为1 m，10 m，50 m，对照组加入等量DMSO。在洁净的一次性培养皿内铺一层滤纸，加入2 ml无菌水润湿，将剪下的党参叶片正面朝上放在湿润的滤纸上，叶柄处用干净的纸巾固定，向培养皿内加3 ml无菌水使叶片周围保持湿润。用湿润滤纸包被叶柄切口处，叶片正面保持干燥用于感染实验。将分生孢子悬液用不同浓度的纯化复合物处理后，各取10 l滴在叶片正中央，每个浓度至少6个重复，黑暗环境下生长24 h后转到室温中正常培养，培养过程中注意向培养皿中添加无菌水，保持叶片周围环境湿润，待感染12 h、24h后观察菌斑的扩散情况，统计叶片感染情况进行分析。实验重复三次
19、，结果表示均值（SD）。2.3数据统计与分析数据采用Excel 2007软件进行数据统计和作图分析。3结果与分析3.1 芽孢杆菌提取物种类分离与鉴定 实验中从短小芽孢杆菌发酵液中制备得到粗提物，将其分别用55%，80%，100%的甲醇溶解，制成流动相，利用高效液相色谱仪（Essentia LC-15C，日本岛津）对不同浓度甲醇溶解的粗提物进行分离纯化，从80甲醇溶液中分离得到一种化合物，通过保留时间和峰形判断为脂肽surfactin。3.2芽孢杆菌粗提物对灰霉菌分生孢子萌发影响观察体外实验中灰葡萄孢菌分生孢子的萌发情况，可计算出灰葡萄孢菌分生孢子在脂肽surfactin50 m浓度下处理12
20、h和24 h后，萌发率分别为14.73、14.41，能够有效抑制其分生孢子的萌发。由图可观察到灰葡萄孢菌分生孢子在不同浓度的surfactin处理下，经过不同时长之后的孢子的萌发情况（图1），control及低浓度（1 m和10 m）处理12 h后的孢子萌发率分别为87.83%、86.58%、76.20%，与高浓度（50 m）处理后的分生孢子萌发率差值分别73.10%、71.58%及61.47%，处理24 h后的孢子萌发率分别为90.10%、78.19%、69.24%，与高浓度（50 m）处理后的分生孢子萌发率差值分别75.69%、63.78%及54.83%。通过分析灰葡萄孢菌的孢子萌发率可以
21、发现：control及低浓度（1 m和10 m）对分生孢子的萌发抑制力较低，高浓度（50 m）能有效抑制分生孢子的萌发(表1）。图1 不同浓度surfactin作用12 h、24 h后灰葡萄孢菌分生孢子的萌发率Fig.1 germination rate of the conidia of botrytis cinerea after treating with surfactin at different concentrations for 12 h and 24 h表.1 不同浓度surfactin处理12 h、24 h后灰葡萄孢菌分生孢子的萌发率对比表Table.1 compariso
22、n of germination rates of botrytis cinerea conidia treated with surfactin at different concentrations for 12 h and 24 h 浓度Concentration时长Length of time12 h24 hCK87.8390.101m86.5878.1910m76.2069.2450m14.7314.413.3芽孢杆菌粗提物对离体叶片发病率影响通过对离体材料感染试验的实验结果分析可以发现：离体党参叶片在进行离体感染12 h和24 h后，在高浓度（50 m）下感染率分别为16.67%和
23、23.34%，在低浓度（1 m和10 m）下感染率分别为73.34%、76.67%和53.34%、63.34%，在control中感染率分别为76.77%和83.34%，可以发现脂肽surfactin在高浓度（50 m）下表现出对灰葡萄孢菌分生孢子较强的抑制力，在低浓度（1 m和10 m）下抑制力较低。灰葡萄孢菌分生孢子受不同浓度脂肽surfactin处理后，对叶片的感染情况各不相同，在感染24 h后可观察发现党参离体叶片上的感染扩散情况表现出明显差异（图2）。对实验结果统计后得到脂肽surfactin对离体党参叶片感染情况的影响（表2）。从图表中可了解到，脂肽surfactin能有效抑制灰葡
24、萄孢菌对离体叶片的感染能力。Control1 m10 m50 m感染24 h 图.2 经脂肽surfactin处理的分生孢子对党参叶片感染24 h后，高浓度（50 m）表现出明显的抑制效果（党参叶片感染未出现明显扩散）Fig.2 High concentration of conidia treated with lipopeptide surfactin for 24 h showed significant inhibitory effect on codonopsis codonopsis leaf infection (50 m) (codonopsis codonopsis leaf
25、 infection did not spread significantly)表.2 不同浓度surfactin作用12 h、24 h后离体叶片的发病率Table.2 The incidence of different concentration of surfactin on detached leaves after 12 h and 24 h treatment 浓度Concentration时长Length of time12 h24 hCK76.7783.341 m73.3476.6710 m53.3463.3450 m16.6723.344 结论与讨论生物防治以其高效安全、环保
26、友好的特性逐渐成为病害防治的主流，应用芽孢杆菌防治病害是生物防治的一项主要研究，大多数芽孢杆菌对人畜无毒害作用，在工业上常用来生产蛋白酶和果聚糖、蔗糖酶等。芽孢杆菌抑菌作用机制中会产生多种抗真菌和细菌的物质，而这些抗菌物质大多数是非蛋白类小分子抗生素，不会危害人类健康安全。芽孢杆菌所产生的分生孢子有较高的稳定性，易于配置和储存，所以芽孢杆菌属在生物防治中颇受欢迎。相较于化学防治，生物防治有着许多优越的特点，致使人们逐渐将病害防治的目光转移到生物防治，市场的需求量也不断扩大。本实验提取到的脂肽surfactin属于表面活性剂类物质，可以和微生物的生物膜相互作用，进而对灰霉菌产生一定的抑制作用28
27、。Surfactin是芽孢杆菌属菌株代谢产生的一种脂肽，通过研究表明，Surfactin不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌等多种细菌或真菌具有抗菌作用，而且对病毒、支原体和原虫等也具有显著的抑制效果。在病害防治方面，Surfactin对豆科作物灰霉病、水稻细菌性条斑病、黄瓜枯萎病和生菜霜霉病等具有显著的防治效果。Surfactin还可替代化学表面活性剂,作为分散剂、农药助剂提高化肥和农药的使用效力。作为一种优良的新型抗菌物质，Surfactin 具有广谱高效的抗菌活性，作为抗菌药物研究与开发极具潜力。我们从植株根系土壤中分离出的短小芽孢杆菌，其无机盐培养基发酵所产生的细菌上清液有抑制灰葡萄
28、孢菌分生孢子萌发的效果。在观察到这一现象后，我们从短小芽孢杆菌菌株无机盐发酵培养物中提取出1种纯净化合物脂肽surfactin，分别进行离体感染实验和体外防治实验，通过对比对体外孢子萌发的抑制力可以发现，灰葡萄孢菌在高浓度（50 m）surfactin下处理24 h后孢子萌发率为14.41%，灰葡萄孢菌的孢子萌发受到明显抑制，党参叶片在高浓度（50 m）surfactin下进行离体感染24 h后感染率为23.34%，灰葡萄孢菌对离体叶片的感染能力下降。实验结果表明：高浓度（50 m）surfactin对灰葡萄孢菌有较强抑制力。目前，本试验仅限于芽孢杆菌粗提物对灰霉菌抑制作用研究，但是有关利用芽
29、孢杆菌对党参灰霉病大田防治等研究，仍需有待进一步研究。参考文献 1 傅俊范.中草药病害防治系列J.新农业,2000,10：42-43.2 王艳,陈秀蓉,王引权,等.甘肃省党参病害种类调查及病原鉴定J.山西农业科学,2011,39(8):866-868.3 刘晓芬.不同化学药剂对葡萄灰霉菌的防治效果J.现代农业科技,2018,16(3).4Cozma P , Apostol L C , Hlihor R M , et al. Overview of human health hazards posed by pesticides in plant productsJ. 2017 E-Health
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