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1、LOGO血清血清-球蛋白的分离、球蛋白的分离、纯化及鉴定纯化及鉴定 实验十一实验十一 扬州大学医学院生化教研室扬州大学医学院生化教研室 傅傅 奕奕Contents实验目的与要求实验目的与要求实验原理实验原理操作步骤操作步骤结果分析结果分析Company LogoCompany Logo血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定一、实验目的与要求一、实验目的与要求u了解分离纯化蛋白质的基本原理；了解分离纯化蛋白质的基本原理；u掌握柱层析技术。掌握柱层析技术。Company LogoCompany Logo二、实验原理二、实验原理 本实验为一综合性大实验，目的是要从血清中获得本实验
2、为一综合性大实验，目的是要从血清中获得纯化的纯化的-球蛋白。球蛋白。血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定血清中的蛋白质有两大类：血清中的蛋白质有两大类：清蛋白清蛋白和和球蛋白（球蛋白（、）。（一）如何分离得到球蛋白？（一）如何分离得到球蛋白？盐析：盐析：清蛋白在水中的溶解度大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵清蛋白在水中的溶解度大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀球蛋白可被完全沉淀，而，而绝大部分清蛋白保持绝大部分清蛋白保持溶解状态溶解状态，依此可将球蛋白和清蛋白分离，依此可将球蛋白和清蛋白分离(离心）离心）。得到球蛋白得到球蛋白Compan
3、y LogoCompany Logo二、实验原理二、实验原理 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定（二）如何去除球蛋白中的无机盐（二）如何去除球蛋白中的无机盐（硫酸铵）？（硫酸铵）？凝胶层析（凝胶过滤）脱盐脱盐凝胶层析又称凝胶过滤，凝胶层析又称凝胶过滤，是选用孔隙大小一定的凝胶，是选用孔隙大小一定的凝胶，将混合液中的小分子和将混合液中的小分子和大分子物质大分子物质“筛筛”开来的开来的一种分离方法。一种分离方法。葡聚糖葡聚糖 G-25G-25纯化的球蛋白纯化的球蛋白Company LogoCompany Logo二、实验原理二、实验原理 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球
4、蛋白的分离、纯化及鉴定（三）如何（三）如何分离分离得到纯化的得到纯化的-球蛋白球蛋白？在乙酸铵溶液在乙酸铵溶液（pH6.5pH6.5）中中 、-球蛋白带负电荷球蛋白带负电荷而而-球蛋白带正电荷球蛋白带正电荷Company LogoCompany Logo二、实验原理二、实验原理 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定（三）如何（三）如何分离分离得到纯化的得到纯化的-球蛋白球蛋白？如何将如何将带有不同性质电荷的蛋白质分离呢？带有不同性质电荷的蛋白质分离呢？离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。离子交换是指溶
5、液中的离子和交换剂上的离子进行可逆 的交换过程；带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带 负电荷的交换剂称阳离子交换剂。本实验采用的DEAEDEAE纤维素纤维素是一种阴离子交换剂，其分子带电 形式为：纤维素-OC2H4N+H(C2H5)2，溶液中带负电荷的离子可 与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达 到分离纯化的目的。Company LogoCompany Logo血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定+Company LogoCompany Logo二、实验原理二、实验原理 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定（三）如何（三）如何分离得到纯
6、化的分离得到纯化的-球蛋白球蛋白？因因、球蛋白球蛋白带带负电荷负电荷而与而与DEAEDEAE纤维素进行交换纤维素进行交换结合结合。而而-球蛋白球蛋白带带正电荷正电荷而不与而不与DEAEDEAE纤维素进行交换结合纤维素进行交换结合，直接从层析柱流出直接从层析柱流出。故经故经DEAEDEAE纤维素阴离子交换层析流出的纤维素阴离子交换层析流出的第一部分第一部分 蛋白质即蛋白质即为纯化的为纯化的-球蛋白球蛋白。纯化前后的纯化前后的-球蛋白可用球蛋白可用电泳法电泳法进行进行比较鉴定比较鉴定。（四）如何鉴定（四）如何鉴定-球蛋白及纯度球蛋白及纯度？Company LogoCompany Logo二、实验原
7、理二、实验原理 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定1.1.盐析：分离球蛋白与清蛋白。盐析：分离球蛋白与清蛋白。2.2.凝胶层析凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐：去除球蛋白中的无机盐（脱盐脱盐）。3.3.离子交换层析：将离子交换层析：将-球蛋白与球蛋白与、-球蛋白分离。球蛋白分离。4.4.电泳：鉴定电泳：鉴定-球蛋白及纯度。球蛋白及纯度。Company LogoCompany Logo三、操作步骤三、操作步骤 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定1.1.盐析：分离球蛋白与清蛋白盐析：分离球蛋白与清蛋白 取血清取血清0.75 ml0.75 ml，缓慢滴入
8、饱和，缓慢滴入饱和(NH4)(NH4)2 2SO4SO4溶液溶液 0.75 ml0.75 ml，边加边摇，混匀后于室温中放置边加边摇，混匀后于室温中放置1010分钟，然后分钟，然后10000rpm10000rpm离心离心1010分钟，并小心分钟，并小心倾去上清液倾去上清液。沉淀加蒸馏水沉淀加蒸馏水0.4 ml0.4 ml，使之溶解，即为使之溶解，即为粗提的球蛋白溶液粗提的球蛋白溶液。Company LogoCompany Logo三、操作步骤三、操作步骤 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定2.2.凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐（脱盐）（脱盐
9、）（1 1）装柱：）装柱：（a a）固定层析柱固定层析柱，保持垂直。，保持垂直。（b b）排气，排气，并检查是否通畅。柱内留下约并检查是否通畅。柱内留下约5ml5ml乙酸铵。乙酸铵。（c c）灌胶灌胶：用滴管沿管壁用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25SephadexG-25悬液，打悬液，打 开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入 SephadexG-25 SephadexG-25，至凝胶层积集至约，至凝胶层积集至约15cm15cm高度即可，高度即可，床面上保持有少床面上保持有少 许溶液
10、许溶液。关闭出口。关闭出口。避免气泡、纹路，凝胶面始终低于液面。避免气泡、纹路，凝胶面始终低于液面。如凝胶表面不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉如凝胶表面不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉 降，使表层平整。降，使表层平整。Company LogoCompany Logo三、操作步骤三、操作步骤 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定（2 2）上样与洗脱：）上样与洗脱：凝胶面始终低于液面凝胶面始终低于液面使柱上使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面缓冲液面刚好下降到凝胶床表面 用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢地加到凝胶床表面上用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢地加到凝胶床表
11、面上 然后打开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出口然后打开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出口 小心加入少量小心加入少量乙酸铵乙酸铵（约（约1ml1ml）洗层析柱内壁上的样品，）洗层析柱内壁上的样品，打开出口，使溶液进入凝胶打开出口，使溶液进入凝胶 加入适量加入适量乙酸铵乙酸铵溶液开始洗脱并收集洗脱液，每分钟收集溶液开始洗脱并收集洗脱液，每分钟收集1515滴滴 淡黄色淡黄色仔细清洗试管仔细清洗试管Company LogoCompany Logo三、操作步骤三、操作步骤 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定（3 3）洗脱液中蛋白质的检测洗脱液中蛋白质的检测：按洗脱液的管号顺
12、序分别取按洗脱液的管号顺序分别取1 1滴液体滴液体，滴于，滴于玻片上玻片上，滴加，滴加 20 20磺基水杨酸磺基水杨酸1 1滴滴，出现，出现白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，即有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。合并蛋白含量高的各管合并蛋白含量高的各管，此即已脱盐的球蛋白溶液此即已脱盐的球蛋白溶液，除除留少量作电泳留少量作电泳鉴定用外，其余用于鉴定用外，其余用于DEAE-DEAE-纤维素阴离子纤维素阴离子 交换柱。交换柱。最多合并三管即可最多合并三管即可Company LogoCompany Logo三、操作步骤三、操作步
13、骤 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定3.3.离子交换层析：将离子交换层析：将-球蛋白与球蛋白与、-球蛋白分离。球蛋白分离。（1）装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测）装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测 装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测等操作步骤及有装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测等操作步骤及有 关注意事项同前述。关注意事项同前述。上样前上样前DEAE-纤维素柱的平衡：纤维素柱的平衡：装柱后用装柱后用0.02 M乙酸铵乙酸铵 （pH6.5）冲洗）冲洗2遍。遍。将将脱盐后含球蛋白的溶液脱盐后含球蛋白的溶液加于加于DEAE-纤维素阴离子交换柱纤维素阴离子交换柱 上，用上，
14、用乙酸铵乙酸铵洗脱，洗脱，样品进入柱床后立即开始收集样品进入柱床后立即开始收集洗脱液，洗脱液，检查各管的蛋白质分布情况，合并含量高的各管。检查各管的蛋白质分布情况，合并含量高的各管。留少量做电泳留少量做电泳此次收集的即为纯化的此次收集的即为纯化的-球蛋白溶液球蛋白溶液，留待浓缩及鉴定。，留待浓缩及鉴定。Company LogoCompany Logo三、操作步骤三、操作步骤 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定（2 2）浓缩）浓缩将纯化的将纯化的-球蛋白溶液球蛋白溶液量体积量体积，每毫升加葡聚糖凝胶，每毫升加葡聚糖凝胶G-25G-25干胶干胶0.25g0.25g，摇动，摇
15、动2-32-3分钟，分钟，离心离心5 5分钟分钟（10000r/min10000r/min），），上清即为浓缩的上清即为浓缩的-球蛋白溶液球蛋白溶液，留待电泳鉴定。，留待电泳鉴定。Company LogoCompany Logo三、操作步骤三、操作步骤 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定4.4.电泳：鉴定电泳：鉴定-球蛋白及纯度球蛋白及纯度 （比较纯化前后的蛋白质）（比较纯化前后的蛋白质）每组取醋酸纤维素薄膜3张，按如下操作：样品：(1)血清；(2)凝胶层析脱盐后的脱盐后的球蛋白溶液；(3)DEAE-纤维素阴离子交换柱纯化后的-球蛋白液 电泳及染色：方法同醋酸纤维素薄膜
16、电泳分离血清蛋白实验。（点样面朝下、点样端靠近负极，氨基黑（点样面朝下、点样端靠近负极，氨基黑10B10B染色）染色）不可重复点样不可重复点样须重复点样须重复点样须重复点样，须重复点样，约约1515次左右次左右Company LogoCompany Logo血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定葡聚糖葡聚糖G-25 G-25 和和DEAEDEAE纤维素：纤维素：实验结束实验结束后，用乙酸铵冲洗后，用乙酸铵冲洗3 3遍后，回收至原烧遍后，回收至原烧杯。杯。u注意：注意：Company LogoCompany Logo四、结果分析四、结果分析 血清血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定球蛋白的分离、纯化及鉴定比较电泳结果，然后作出分析。比较电泳结果，然后作出分析。Company LogoCompany LCompany LogoCompany Logo