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1、抗体酶第七章第七章 抗体酶抗体酶Chapter 7 Abzymeo一一 概述概述o二二 机制机制o三三 制备制备o四四 应用应用第七章第七章 抗体酶抗体酶 19461946年年,诺贝尔奖二次得主诺贝尔奖二次得主美国化学家美国化学家Linus Pauling Linus Pauling 提出提出酶催化反应的过渡态理论酶催化反应的过渡态理论。一、抗体酶的发现与研究思路一、抗体酶的发现与研究思路 酶的催化机理是降低活化能。酶的催化机理是降低活化能。S在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡状态，的实际上是底物形成的过渡状态，S酶与过
2、渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力。亲和力。能与过渡态结合的抗体也具有酶的性质能与过渡态结合的抗体也具有酶的性质 根据根据PaulingPauling理论理论 ，William JenckWilliam Jencks s于于19691969年预言：年预言：若能找到对应某反应过渡态的抗体，将其加入该反应体系若能找到对应某反应过渡态的抗体，将其加入该反应体系中，就可观测到这个抗体对该反应的催化效应。中，就可观测到这个抗体对该反应的催化效应。这就意味着这就意味着 ，抗体一旦能与过渡态相结合，抗体一旦能与过渡态相结合 ，它就具，它就具有酶的性质有酶的性
3、质 。寻找过渡态类似物作为半抗原产生的抗体寻找过渡态类似物作为半抗原产生的抗体可能具有酶活性可能具有酶活性 以稳定的过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补以稳定的过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构像的抗体，这样产生的抗体就能识别反应过程的真正过构像的抗体，这样产生的抗体就能识别反应过程的真正过渡态，该抗体即有酶催化反应的基本特征，可能成为一种渡态，该抗体即有酶催化反应的基本特征，可能成为一种具有酶活性的抗体。具有酶活性的抗体。半抗原半抗原：能与对应抗体结合出现抗原：能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原能单独激发人或动物体产生抗
4、体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称性，不具免疫原性，又称不完全抗原不完全抗原。一般是蛋白质使结合物具有抗原性，而一般是蛋白质使结合物具有抗原性，而半抗原则决定半抗原则决定结合物的抗原特异性结合物的抗原特异性。在在19861986年，加利福尼亚实验室的年，加利福尼亚实验室的LernerLerner和和Schultz Schultz 同同时报道了成功制备具有催化能力的单克隆抗体时报道了成功制备具有催化能力的单克隆抗体-催化抗体。催化抗体。Peter Schultz 如愿以偿如愿以偿 证实了证实了抗体和酶一抗体和酶一样，能专一催化化学反样，能专一催化化学反应的事实应的事实。此后，抗体。此后
5、，抗体酶才从理论变为了现实。酶才从理论变为了现实。A question:抗体酶是酶还是抗体抗体酶是酶还是抗体？二、抗体酶的结构与机制二、抗体酶的结构与机制 什么是酶什么是酶(enzyme)(enzyme)？酶酶活细胞产生，起生物化学反应催化剂作用的活细胞产生，起生物化学反应催化剂作用的蛋蛋白质。白质。什么是抗体（什么是抗体（antibodyantibody，AbAb）？）？抗体抗体是是B B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种生的一种蛋白质，蛋白质，主要存在于血清等体液中主要存在于血清等体液中,能与相应抗能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能原特异性地结
6、合，具有免疫功能。其本质是一类免疫球其本质是一类免疫球蛋白。蛋白。抗体结构抗体结构 抗体分子是由两条轻抗体分子是由两条轻链链(light chain,L(light chain,L链链)和和两条重链两条重链(heavy chain,(heavy chain,H H链链)通过链间二硫键连接通过链间二硫键连接而成的四肽键结构。而成的四肽键结构。抗体抗体S抗体的最显著的特征是抗体的最显著的特征是u多样性和专一性多样性和专一性 抗原结合片段抗原结合片段(antigen binding(antigen binding fragment,Fab)fragment,Fab)和可结晶片段和可结晶片段(crys
7、tallizabefragement,Fc)(crystallizabefragement,Fc)位于位于H H和和L L链的链的N-N-端的可变区端的可变区是抗原的结合位点是抗原的结合位点,由约由约110110个个氨基酸构成氨基酸构成(variable(variable region,V)region,V)。抗体酶抗体酶AbzymeAbzyme 本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋（IgIg），在，在其可变区赋予了酶的属性。其可变区赋予了酶的属性。所以，所以，其实抗体酶是一种特殊的抗体，它有着催其实抗体酶是一种特殊的抗体，它有着催化特性，可谓是酶和抗体性质的兼
8、得。所以又被称为化特性，可谓是酶和抗体性质的兼得。所以又被称为催化抗体。催化抗体。（Catalytic antibodyCatalytic antibody）抗体酶的作用机制抗体酶的作用机制 酶和抗体的本质差别在于：酶和抗体的本质差别在于：酶是能和反应酶是能和反应过渡态过渡态 (激发态分子激发态分子)选择结合的催化物质。而抗体是和选择结合的催化物质。而抗体是和基态基态分子分子选择结合的催化物质选择结合的催化物质,它们识别底物的机理是相它们识别底物的机理是相同的。同的。所以，所以，设计和制备稳定的过渡态类似物作为半抗设计和制备稳定的过渡态类似物作为半抗原诱导产生抗体原诱导产生抗体 ，这样产生的抗
9、体就能识别反应过程，这样产生的抗体就能识别反应过程的真正过渡态，该抗体具有酶催化反应的基本特征的真正过渡态，该抗体具有酶催化反应的基本特征，成为一种具有酶活性的抗体。这就是我们所称的抗体成为一种具有酶活性的抗体。这就是我们所称的抗体酶。酶。半抗原半抗原特异蛋白特异蛋白抗原抗体抗原抗体抗体酶抗体酶抗原抗体抗原抗体 抗体酶模型抗体酶模型抗体酶的特性抗体酶的特性S1、能催化一些天然酶不能催化的反应、能催化一些天然酶不能催化的反应u有许多化学反应还没有已知酶催化进行有许多化学反应还没有已知酶催化进行u抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性u抗体酶可以根据需
10、要人工裁制抗体酶可以根据需要人工裁制S一种对酶促反应过渡态特异的抗体一种对酶促反应过渡态特异的抗体u结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。S2、有更强的专一性和稳定性、有更强的专一性和稳定性u抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子分子u抗体酶催化反应的介质效应抗体酶催化反应的介质效应E酯解反应中介质效应酯解反应中介质效应：抗体酶在有机溶剂中具稳定性。抗体酶在有机溶剂中具稳定性。E脱羧反应中介质效应：有
11、机溶剂引起脱羧反应速率增加。脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。E酰基转移反应中介质效应酰基转移反应中介质效应：在疏水溶剂中，活性较高。：在疏水溶剂中，活性较高。抗体与酶的异同：抗体与酶的异同：相同点：相同点：都是蛋白质，都有特异性。都是蛋白质，都有特异性。不同点：不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。抗体是和基态紧密结合的物质。3）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有
12、在抗原存在时才产生，种类无限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。A question:如何让抗体具有酶活性如何让抗体具有酶活性？抗体酶制备的基本原理抗体酶制备的基本原理 如果能适当地改变抗体中与抗原结合部位的微如果能适当地改变抗体中与抗原结合部位的微环境，并在适当部位引入相应的催化基团，那就有环境，并在适当部位引入相应的催化基团，那就有可能使抗体转变为具有催化性能的抗体酶。可能使抗体转变为具有催化性能的抗体酶。三、抗体酶的制备三、抗体酶的制备制备方法制备方法诱导法诱导法基因工程法基因工程法拷贝法拷贝法导入法导入法修饰法修饰法一、抗体的一些基本概念一、抗体的一些基本概念单克隆抗体单克隆抗体
13、(Monoclonal Antibody,McAb)单个单个B B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。淋巴细胞克隆所分泌的抗体。多克隆抗体多克隆抗体 (Polyclonal Antibody)多个多个B B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。淋巴细胞克隆所分泌的抗体。抗原（抗原（antigen，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇（表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）Ag1234Ag 单克隆抗体单克隆抗体 B1B2B3B4B3B3B3B32 多克隆抗体多克隆抗体341单抗与多单抗与多抗的区别：抗的区别：制备单克隆抗体的基本原理：制备单克隆抗体的基本原理：致敏的致敏的B淋巴细胞淋巴细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤
14、细胞（myeloma）（能够分泌特异性的抗体，（不能分泌特异性的抗体，不能在体外长期生存 ）但能在体外长期生存）阳性杂交瘤细胞阳性杂交瘤细胞 (hybridoma)（既能分泌特异性抗体，又能够在体外长期生存）克隆化培养克隆化培养 （产生单克隆的阳性杂交瘤细胞）生产单克隆抗体生产单克隆抗体 1222212 （1）诱导法诱导法 采用过渡态的底物类似物诱导采用过渡态的底物类似物诱导 (transition state analogue)(transition state analogue)此法的关键是要设计和获得适当的过渡态底物类似物此法的关键是要设计和获得适当的过渡态底物类似物作为半抗原。作为半抗
15、原。“制备制备”抗原：抗原：设计过渡态类似物设计过渡态类似物合成半抗原合成半抗原半抗原载体半抗原载体杂交瘤细胞制备：杂交瘤细胞制备：免疫小鼠免疫小鼠与骨髓瘤细胞结合与骨髓瘤细胞结合限制性稀释限制性稀释筛选与半抗原具有筛选与半抗原具有高亲和力的克隆高亲和力的克隆制备单克隆抗体制备单克隆抗体：将细胞培养于腹水液或将细胞培养于腹水液或培养介质中生产单抗培养介质中生产单抗纯化单抗纯化单抗筛选抗体酶：筛选抗体酶：筛选具有催化筛选具有催化性能的单抗性能的单抗利用过渡肽类似物制备抗体示意图 简言之简言之 诱导法是选择适当的化学模型物与载体蛋白连接诱导法是选择适当的化学模型物与载体蛋白连接后给动物免疫，通过杂
16、交瘤技术筛选和分离单克隆抗后给动物免疫，通过杂交瘤技术筛选和分离单克隆抗体体（所得抗体催化效果的好坏很大程度上取决于化学（所得抗体催化效果的好坏很大程度上取决于化学模型物的设计）。模型物的设计）。对于已经获得的单抗，分析其氨基酸序列和相应基对于已经获得的单抗，分析其氨基酸序列和相应基因的碱基序列，将抗原结合部位的基因换上编码有催化因的碱基序列，将抗原结合部位的基因换上编码有催化作用的氨基酸的基因，作用的氨基酸的基因，这就是基因工程法制备抗体酶的这就是基因工程法制备抗体酶的主要内容。主要内容。（2 2）基因工程法基因工程法 基因工程的技术使得建立基因工程的技术使得建立抗体基本的组合文库，抗体基本
17、的组合文库，并并根据需要构建适当序列的基因片段已成为可能。利用抗体根据需要构建适当序列的基因片段已成为可能。利用抗体库技术，在将来也许有可能绕开免疫，产生完全由基因工库技术，在将来也许有可能绕开免疫，产生完全由基因工程构建的全新抗体酶。程构建的全新抗体酶。（3 3）拷贝法拷贝法 用已知酶作为抗原免疫动物，通过单克隆技术，制用已知酶作为抗原免疫动物，通过单克隆技术，制得抗该种酶的抗体。再以此种抗体免疫动物，再次采用得抗该种酶的抗体。再以此种抗体免疫动物，再次采用单克隆技术，经筛选与纯化，就可获得具有原来酶活性单克隆技术，经筛选与纯化，就可获得具有原来酶活性的抗体酶的抗体酶(因为抗原与该抗产生的抗
18、体具有互补性，经过因为抗原与该抗产生的抗体具有互补性，经过上述两次拷贝，就把酶的活性部位的信息翻录到抗体酶上述两次拷贝，就把酶的活性部位的信息翻录到抗体酶上，使该抗体酶能高选择性地催化原酶所催化的反应上，使该抗体酶能高选择性地催化原酶所催化的反应)。拷贝法示意拷贝法示意o优点：这种方法对自然界来源稀少的紧缺酶，不失为一种有优点：这种方法对自然界来源稀少的紧缺酶，不失为一种有价值的有潜力的方法。价值的有潜力的方法。o缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。在现有的抗体基础上，借助化学修饰或蛋白质工在现有的抗体基础上，借助化学修饰或蛋白质
19、工程的办法将催化基团引入到已有底物结合能力的抗体的程的办法将催化基团引入到已有底物结合能力的抗体的抗原结合部位上。抗原结合部位上。（4 4）导入法导入法引入法举例 可以采用选择性化学修饰的方法将人工合成的或天可以采用选择性化学修饰的方法将人工合成的或天然存在的催化基团引入到抗原结合部位；也可采用寡核然存在的催化基团引入到抗原结合部位；也可采用寡核苷酸定点诱变技术将特定的氨基酸残基引入抗原结合部苷酸定点诱变技术将特定的氨基酸残基引入抗原结合部位，使其获得催化功能。位，使其获得催化功能。（5 5）化学修饰法化学修饰法 抗体酶和酶一样也可以用化学修饰的方法加以改造。抗体酶和酶一样也可以用化学修饰的方
20、法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法，对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法，在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。游离巯基就是适合的基团之一游离巯基就是适合的基团之一,它具有高亲核性它具有高亲核性,易于氧化易于氧化,及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。应而选择性修饰的特点。抗体酶的应用前景抗体酶的应用前景S1 1、抗体酶在帮助戒毒方面的应用抗体酶在帮助戒毒方面的应用 uLandryLandry等用可卡因水解的等用可卡因水解的过渡态类似物过渡态类似物-磷酸磷
21、酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。去可卡因刺激功能。u因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的卡因上瘾，达到戒毒目的 。抗体酶用于肿瘤治疗抗体酶用于肿瘤治疗S目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（ADEPTADEPT）技术，即将能水解前药释放出肿瘤细胞）技术，即将能水解前药释
22、放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。u前药前药(prodrug)(prodrug)是指由具有生物活性的药物是指由具有生物活性的药物经化学修饰后转变为体外无活性的化合物。这经化学修饰后转变为体外无活性的化合物。这种化合物在体内经酶或非酶作用，脱去保护基，种化合物在体内经酶或非酶作用，脱去保护基，释放出母体药物而发挥治疗作用。释放出母体药物而发挥治疗作用。S静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会将前药
23、迅速水解释放出抗肿瘤药近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。S当然前药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水当然前药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解，抗原还要尽量减少免疫原性解，抗原还要尽量减少免疫原性 。S抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去设抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去设计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计制作计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计制作酶。它是酶工程的一个全新领域。酶。它是酶工程的一个全新领域。S构建有别于天然功能酶的新酶类，是酶工程研究构建有别于天然功能酶的新酶类，是酶工程研究的又一前沿领地。的又一前沿领地。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢