《《核酶抗体酶》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《核酶抗体酶》PPT课件.ppt（45页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、Company Logo核 酶（Ribozyme)u一、概述u二、剪接型核酶u三、剪切型核酶u四、核酶的应用u五、核酶技术面临的问题u六、脱氧核酶（deoxyribozyme)Company Logo1、对酶及生物催化剂的认识的发展对酶及生物催化剂的认识的发展一、概 述生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶极端酶 extremozyme 抗体酶抗体酶 abzyme 生物工程酶生物工程酶其它：模拟酶其它：模拟酶核酸类核酸类:克隆酶克隆酶遗传修饰酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozymeComp
2、any Logo2、长期以来，人们认为只有某些蛋白质才有生物催化功能。但近些年研究发现，某些RNA分子也具有生物催化功能，被称为Ribozyme。1982年Cech等发现四膜虫细胞大核期间26SrRNA前体具有自我剪接功能，并于1986年证明其内含子L-19IVS具有多种催化功能。1984年Altman等发现RNaseP的核酸组分M1RNA具有该酶的活性，而该酶的蛋白质部分C5蛋白并无酶活性。Cech和Altman因发现Ribozyme而获得1989年度诺贝尔化学奖。Company Logou3、核酶作用的特点u 化学本质 RNAu 底物 RNA 肽键 -葡聚糖分支酶u 反应特异性(专一性）碱
3、基u 催化效率 低u 产物Company Logo剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP4.核酶的分类Company Logo二、剪接型核酶u剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方式除去内含子（Intron).u剪接型核酶分类u1、I类内含子 2、II类内含子Company Logo1.I类内含子的自我剪接(Self-splicing)u剪接机制uL-19IVS在体外的多种酶活性u核酶是一种金属依赖酶u结构与功能的关系u 引导序列：IVS中的6个嘌呤核苷酸序列u 5CUCUCU3u 3GGGAGG5u G结合位点:IVS 中的
4、P7茎区u 空间结构Company Logo核酶是一种金属依赖酶u金属离子的作用：u1、特异的结构作用，或参与活性部位的 化学过程u2、促进RNA的总体折叠u3、二价金属离子（如Mg 2+）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形成Company Logo2、类内含子的自我剪接u剪接机制u结构与功能的关系Company Logo三、剪切型核酶u1、自身催化剪切型RNAu 1、1 剪切机制u 1、2 结构与功能的关系u 锤头结构(Hammerhead)u 发夹结构(Hairpin)u 斧头结构(Axehead)u 假结样结构(Pseudoknot-like)u 1、3 影响核酶活性的因
5、素Company Logol2、异体催化剪切型RNAl 核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端。l RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。l体外：M1RNA具催化作用l 蛋白质作为辅助因子 l体内：M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的。l 2、1剪切机制 Mg 2+l 2、2结构与功能的关系 M1RNA 5端完整结构对维持催化活性是必需的。l胰腺癌护理 胰腺癌康复 胰腺癌饮食：Company Logo RNaseP可剪切可剪切前体前体5端端41nt,5端端成熟。不同成熟。不同tRNA的的
6、5 端没有顺序共端没有顺序共同性，剪切的准确同性，剪切的准确性与剪切部位周围性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，的核苷酸顺序无关，表明在表明在RNaseP的组的组分内没有引导序列，分内没有引导序列，RNaseP所识别的是所识别的是底物的底物的高级结构高级结构。RNaseP底物的二级结构底物的二级结构剪切位点剪切位点Company LogoCompany Logo1、转核苷酸作用转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC2、水解作用水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC+pC3、转磷酸作用转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC
7、+UpCpUp4、去磷酸作用去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC+Pi5、限制性内切酶作用限制性内切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN Company Logo核酶在医学上的应用1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。2、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV-)核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-基因表达，并率先进入临床期。3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识
8、别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。Company Logo 五、核酶技术面临的问题五、核酶技术面临的问题1、核酶催化切割反应的可 逆性问题2、提高催化效率3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞4、使核酶在细胞内有调控地高效表达5、增强核酶在细胞内的稳定性6、对宿主的损伤问题有待进一步考察Company Logo六、脱氧核酶的研究1、体外选择技术筛选脱氧核酶分子脱氧核酶分子的体外选择是通过优先扩增事先固定在固相载体上的具有自我裂解功能的活性分子来实现的。通过这一技术已有两种具有RNA裂解活性的脱氧核酶被筛选出来。8-17，10-23。2、脱氧核酶催化特征
9、10-23裂解位点为嘌呤、嘧啶连接 双链稳定性越高，酶活性越高 结合臂的长度影响酶催化转换性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定性差。对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 组氨酸，精氨酸促进催化活性 极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）Company Logo10-23型脱氧核酶作用机理型脱氧核酶作用机理RY RRNA substrate切割点切割点R=A or GY=C or Udeoxyribozyme 5 3 Company Logo手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理茎茎II(催化部位催化部位)茎茎I(结合部位结合部位)5
10、3 3 C A切割点切割点102030 40Company Logop 3 HO-Gp3 pP-GOHp P-G3HO 类内含子的剪接机制Mg 2+或Mn 2+GMP,GDP,GTP外显子外显子 内含子或居间序列内含子或居间序列（Intervening sequence,IVS)5Company Logop 2 HO-Ap p-A p3OHpP-AHO 3类内含子的剪接机制Mg 2+套环的形成套环的形成53外显子连接外显子连接Company LogoBAA5BBABAPCRPCR555StreptavidinColumnNaOHcofactor体外选择技术筛选具有自我裂解功能的DNA分子N50
11、(DNA分子库）Company Logo 类内含子二级结构通式类内含子二级结构通式保守序列保守序列G结合位点结合位点剪接部位剪接部位引导序列引导序列Company Logo类内含子有一个保类内含子有一个保守的二级结构：守的二级结构：结构域结构域：两个保守：两个保守内含子结构序列内含子结构序列EBS1,EBS2与两个外与两个外显子结构序列显子结构序列IBS1,IBS2互相配对。互相配对。结构域结构域：高度保守，：高度保守，催化活性必需。催化活性必需。结构域结构域：A 提供提供2-OH 类内含子二级结构模式类内含子二级结构模式5 3Company Logo5个环和4个螺旋形成两个结构域剪切反应发生
12、在底物识别序列GUC的5端两个内部环中的碱基及在螺旋区的G11和底物中的G+1都是酶发挥作用所必需的。53 发夹二级结构模型剪切位点Company LogoHDV RNA斧头结构模式 三个碱基对的茎三个碱基对的茎需要二价阳离子，需要二价阳离子，产生产生5-OH和和 2,3-环磷酸环磷酸剪切部位剪切部位剪切部位剪切部位Company Logo 这类这类RNA进行自进行自身催化的反应是只切身催化的反应是只切不接。不接。特点特点：在：在 Mg 2+或其或其他二价金属离子存在他二价金属离子存在下，在特定的位点，下，在特定的位点，自我剪切，产生自我剪切，产生5-OH 和和2，3-环磷酸环磷酸二酯末端二酯
13、末端。剪剪 切切 机机 制制核酶自身剪切反应核酶自身剪切反应Company Logo mRNA剪接过程剪接过程 mRNA剪接反应是剪接反应是在剪接体在剪接体（splicesome)上进行上进行的的.5种种snRNA 剪接体剪接体 50多蛋白质多蛋白质Company Logo锤头结构的锤头结构的 五种类型五种类型R示酶，示酶，S示底物，箭头示剪切位点示底物，箭头示剪切位点Company Logo 建议的建议的L19 RNA催化机理催化机理Company Logo锤头型核酶对切割位点的识别锤头型核酶对切割位点的识别位点遵守位点遵守NHH规则（规则（N代表任代表任意核苷酸，意核苷酸，H代表代表A,U
14、或或C）。）。催化过程需要二价金属离子参催化过程需要二价金属离子参与。与。单金属离子催化单金属离子催化双金属离子催化双金属离子催化 Company LogoCompany Logo锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图三个双螺旋区13个核苷酸残基保守序列剪切反应在右上方GUX序列的3端自动发生Company LogoUCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU A AAGUAAUCUoH35GAAAGUAAUCUUAA5GAAAGOH 3 G-IVSL-19IVS19nt53rRNA535pGOH353四膜虫rRNA前体自我剪接反应Company LogoCCCUCUOP+HOG 3O
15、AoooCCCUCUOPOAoO GCCCUCUOH+P-oGoAoo 过渡态Company LogoCCCUCUOPOAoO GoCCCUCUOPOAoO GMg 2+Mg 2+o过渡态 金属离子催化Company LogoCompany Logo锤头（Hammerhead)结构u二级结构模型u锤头二级结构编号u锤头结构的类型u锤头核酶的催化反应机制Company Logo17位（位（X）的核苷酸残的核苷酸残基多数是基多数是C,不能是不能是U,G.7位核苷酸残基的置换位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大不会对酶活性产生很大影响影响锤头二级结构编号锤头二级结构编号7位核苷酸位核苷酸17位核苷
16、酸Company Logo发夹（hairpin）结构u 发夹核酶发现于三种不同植物RNA病毒，即烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星RNA的负链，英文缩写分别是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链RNA。u 发夹核酶结构模型u 发夹核酶催化机制 金属离子在催化反应 中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高。Company LogoGUACGGCCGGUGCCGGCUGGGGCAUUCCGAGGGGAC CAAGUAAUGGCUCCCCUGcCGGGUCCAGCCU U C C G C C UCAGGUAAGCG35剪切位点 HDV 核
17、酶假结样结构L3L4J1/2 J1/4J2/4四个螺旋区，三个连接区，两个环活性中心区：J1/4,J2/4,L3剪切位点：688/689Company Logo影响核酶活性的因素u1、pH值对活性的影响 pH70 -7 5 时核酶活性最高。u2、二价金属阳离子对活性的影响 Mg 2+Mn 2+u3、抗生素对活性的影响 大多数为抑制效应u4、变形剂对活性的影响u5、温度对活性的影响 在65范围内随温度升高而增加，37 时均有适宜的活性。Company LogoCompany Logo四、核酶的应用一、在医学领域中的应用：2.免疫源性低，很少引起免疫反应。3.针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。1.通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。二、在其他领域的应用防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等Company Logo