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1、消毒灭菌方法第1页，本讲稿共16页灭菌的方法基本上分为二大类：物理方法（干热灭菌、湿热灭菌、射线灭菌、滤过灭菌）和化学方法（气体灭菌、药液灭菌）。下面将分别介绍几种常用的灭菌方法。灭菌涉及到厂房、设备、容器、洁具、工作服装、原辅材料、成品、包装材料、仪器等等的灭菌。无菌药品特别是注射液、供角膜创伤或手术用滴眼剂等无菌制剂是直接进入人体血液循环系统而产生疗效的药品，所以对其质量有特殊要求，它必须符合药典无菌检查的要求，为此，在生产过程中，要努力消除微生物的污染，杀灭药品中的微生物，这就是灭菌要达到的目的。第2页，本讲稿共16页第一节干热灭菌法及其设备1.干热灭菌干热可用于能耐受较高温度，却不宜被
2、蒸汽穿透，或者易被湿热破坏的物品的灭菌。同时干热也是制药工业中用于除热原的方法之一。由于在相同的温度下，干热对微生物的杀灭效果远低于饱和蒸汽，故干热灭菌需要较高的温度或较长的灭菌时间。评价干热法灭菌的相对能力时，一般可采用相似于F0值的致死率单位和生物指示剂2.干热灭菌的主要设备3.干热灭菌的主要设备有干热灭菌柜、隧道灭菌系统。干热灭菌设备一般由下列几个重要部分组成：加热器它是干热灭菌设备的主要组成部分，对灭菌效果的好坏影响极大。加热器故障是造成干热灭菌设备灭菌效果下降的主要原因之一，其主要表现为升温速度下降；影响热分布；产生尘埃物质。而造成加热器故障的原因，主要是加热器的长期使用或通过加热器
3、的空气质量较差所致。所以一般应在灭菌器的加热系统配置电流监测器，以及时发现其故障。第3页，本讲稿共16页高效过滤器在干热灭菌设备中，进风应通过高效过滤器；除去内部空气循环系统中产生的尘埃物质需要高效过滤器；防止排风倒流的污染也可装高效过滤器。所以高效过滤器必须满足干热灭菌工艺用风量的要求，并能承受相应的风压。缓冲板、风阀、气流调节器或空气档板缓冲板或空气档板用于控制干热灭菌器的空气流量，多安装于进风或排风风管或加热器附近，用于正压控制的气流调节器可以安装排风系统中的防止倒流风污染的高效过滤器附近，通过控制排风量控制正压，也可以用气流调节器控制进风和排风风量以保持正压。一般情况下，干热灭菌器腔室
4、内的压力略高于其相临的非无菌区而略低于其相临的无菌区。风机对干热灭菌器中的气流循环影响很大，风机的风量应该可以测量，并可调整，必要时可以要求供应商将此项要求增加到其设备标准中，因为风机风量的测量指示值，可以为设备使用过程中检查风机状态提供依据。第4页，本讲稿共16页传送带（仅适用于连续法）传送带的速度，在连续传送干热灭菌系统中是十分重要的灭菌效果影响因素。目前大多数干热连续法灭菌系统中已设有传送带速度控制器，但较少有速度记录装置。由于传送带速度决定了物料经过灭菌器时所接受的热量，所以其速度记录是证明灭菌器在控制状态下运行的基本资料之一，生产工艺中亦有必要保存每次灭菌过程的传送速度的记录。同时干
5、热灭菌器的SOP，也应明确规定各种灭菌过程传送带的运行速度范围，此运行速度范围应是经过验证确定的。运行连锁控制系统干热灭菌器中连锁控制系统设有：门连锁控制系统；压力传感器；温度传感、控制、停止传送带运行的连锁控制装置等，以保证在任何情况下出现温度低于设计要求时防止灭菌物品在低于灭菌温度的情况下通过灭菌器。温度控制器及记录仪在干热灭菌系统中，温度探测、传感、控制、记录系统是整个灭菌过程控制的基础，其控制系统必须能保证灭菌器腔室内灭菌温度可以保持在设定的灭菌温度范围内，其记录系统必须将温度探测、传感系统的温度读数准确无误地记录清楚。第5页，本讲稿共16页第二节湿热灭菌法及其设备一、湿热灭菌法是在饱
6、和蒸汽或沸水或流通蒸汽中进行灭菌的方法。由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以灭菌效率比干热灭菌法高。这是注射剂生产中应用最广泛的一种灭菌方法，它具有灭菌可靠，操作方便，易于控制和经济等优点。影响湿热灭菌的因素有：1.细菌的种类与数量：不同细菌，同一细菌的不同发育阶段对热的抵抗力有所不同。细菌数越少，灭菌时间越短。2.药物性质与灭菌时间：一般来说，灭菌温度越高灭菌时间越短。但考虑到药物的稳定性，应在达到有效灭菌的前题下可适当降低灭菌温度或缩短灭菌时间。3.蒸汽的性质：蒸汽有饱和蒸汽，湿饱和蒸汽和过热蒸汽。饱和蒸汽热含量较高，热穿透力较大，因此灭菌效力高。湿饱和蒸汽带有水分，热含
7、量较低，穿透力差，灭菌效力较低。过热蒸汽温度高于饱和蒸汽，但穿透力差，灭菌效率低。4.介质的性质：制剂中含有营养物质，如糖类、蛋白质等，增强细菌的抗热性。细菌的生存能力也受介质PH值的影响。一般中性环境耐热性最大，碱性次之，酸性不利于细菌发育。第6页，本讲稿共16页湿热灭菌法的主要设备湿热灭菌法的主要设备是灭菌釜，灭菌釜种类很多，性能差异也很大，但其基本结构大同小异，所用的材质为坚固的合金。现在国内很多企业使用的方型高压灭菌釜，能密闭耐压，有排气口、安全阀、压力和温度指示装置。带有夹套的灭菌柜备有带轨道的格车，分为若干格。灭菌柜顶部装有压力表二只，一只指示蒸汽夹套内的压力，另一只指示柜室内的压
8、力，两压力表中间为温度计。灭菌柜的上方还应安装排气阀，以便开始通入加热蒸汽时排除不凝性气体。近年来，一些制药企业已经开始采用具有抽真空能力及F0控制的蒸汽灭菌釜，目前国内使用的进口灭菌釜主要有二种：一种以蒸汽为灭菌介质的旋转式灭菌釜，如奥地利的HDRR00920IS，另一种以过热水作介质的喷淋式灭菌釜，如意大利FEDEGARI公司的FOW5500。进口灭菌釜的主要优点是批次量较大，温度控制系统准确度及精密较好，产品灭菌过程中受热比较均匀。第7页，本讲稿共16页国产快速冷却灭菌釜工作原理如下：灭菌釜的基本灭菌程序为：第8页，本讲稿共16页第三节其他灭菌方法及消毒方法一、辐射灭菌法以放射性同位素，
9、（60CO或137CS）放射的g射线杀菌的方法。射线可使有机化合物的分子直接发生电离，产生破坏正常代射的自由基，导致微生物体内的大分子化合物分解。辐射灭菌的特点是不升高灭产品的温度，穿透性强，适合于不耐热药物的灭菌，医疗器械、高分子材料、包装材料等的灭菌。灭菌剂量一般用2.5104GY（弋瑞）。此法已为英国药典（1998），日本药局方十三版所收载。我国有些企业亦用60CO对某些中药和医疗器械进行灭菌。辐射灭菌，设备费用高，对某此药品可能产生药效降低，产生毒性物质或发热物质，使用辐射灭菌还应注意安全防护措施。第9页，本讲稿共16页二、紫外线灭菌法是指用紫外线照射杀灭微生物方法。一般用于灭菌的紫外
10、线波长是200300nm，灭菌力最强的波长是253.7nm。紫外线作用于核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水。因此本法适用于照射物体表面之灭菌、无菌室的空气及水的灭菌；不适用于药液的灭菌、固体物质深部的灭菌；普通玻璃可吸收紫外线，因此装于玻璃容器中的药物不能用此法灭菌。紫外线对人体照射过久，会发生结膜炎，红斑及皮肤烧灼等现象，故一般在人入室前开启紫外线灯12小时，关闭后人才进入洁净室，如果必须在人进去后仍要开紫外线灭菌，则人的皮肤及眼睛应有有效的防护措施。用紫外线照射灭时要注
11、意下列问题：1紫外线的杀菌力，随使用时间增加而减退，一般使用时间达到额定时间70时应更换紫外线灯管，以保证杀菌效果。国产紫外线灯平均寿命一般为2000h。2紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同，杀霉菌的照射量要比杀杆菌大4050倍。3紫外线照射通常按相对湿度为60的基础设计，室内湿度增加时，照射量应相应增加。4紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关，这需要通过验证来确定照射时间。紫外照射灯的安装形式及高度，应根据实际情况，参考使用说明决定。第10页，本讲稿共16页三、环氧乙烷灭菌法环氧乙烷灭菌法是利用环氧乙烷气体进行杀菌的方法。它是一种传统的灭菌方法，可应用于工衣灭菌、不耐加热灭菌的药品、医用器具、设
12、施、设备等灭菌。环氧乙烷灭菌系统，主要有下列四项互相制约的重要因素影响灭菌效果：1.湿度；2.温度；3.气体浓度；4.灭菌时间。因为环氧乙烷是易燃易爆物质，明火可以引起燃烧，同时由于气体分解不可能引起爆炸，环氧乙烷灭菌中应十分注意安全问题。环氧乙烷具有非常强的渗透和扩散能力，其灭菌的机理主要是强氧化，因此具有杀菌谱广，灭菌能力强的特点，对微生物的繁殖体、芽孢有较强的杀灭效果。虽然环氧乙烷在高浓度时有刺激性臭味和毒性，但属中度毒性，一般可以很快挥发，不会在系统内表面残留余毒。用环氧乙烷气体灭菌的程序,大致为将灭菌物品置于灭菌器内，减压排除空气，预热，环氧乙烷气体采用混合气（一般环氧乙烷气体含10
13、20，二氧化碳含8090），在减压下输入混合气体，保持一定浓度、温度和湿度，经过一定时间后，抽真空排除环氧乙烷气体，然后送入无菌空气置换环氧乙烷气体，直至排净。第11页，本讲稿共16页四、过滤灭菌法过滤灭菌法是用滤过方法除去活的或死的微生物的方法，是一种机械除菌方法，这种机械叫除菌过滤器。主要用于对热不稳定的药物溶液、气体、水的灭菌。供灭菌用的滤器，要求能有效地从溶液中除净微生物，溶液顺畅地由滤器通过，滤液中不落入任何不需要的物质，滤器容易清洗，操作简便。繁殖型细菌很少小于1mm的，芽胞大小为0.5mm或更小些。所以，对于以过筛作用滤过的滤器，例如纤维素酯膜滤器，其孔径大小必须小到足以阻止细菌
14、和芽孢进入滤孔之内，孔径约为0.2mm。靠阻留于孔道内或静电作用的滤器，孔径可稍大于所要滤除的颗粒，但压力过大或波动，颗粒就有被挤过的可能。最常用测定孔径的方法，是用大小为0.7mm左右的灵菌（Bprodigilsus）混悬液滤过，滤液通过培养实验，观察有无灵菌生长。常用除菌滤器有微孔薄膜器，摺叠式纤维素滤棒，一般选用孔径0.22mm。滤过法应配合无菌操作技术，并必须对成品进行无菌检查，以保证其除菌质量。第12页，本讲稿共16页五、臭氧消毒法臭氧（O3）的消毒原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧（O2）和单个氧原子（O），后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用,臭氧氧
15、化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普遍氧分子（O2），不存在任何有毒残留物，故称为无污染消毒剂。它不但对各种细菌（包括肝炎病毒、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等）有极强的杀来灭能力，而且对霉菌也很有效。生产臭氧的原料主要是电能和空气，一般通过高频臭氧发生器（电子消毒器）来获得，消毒时,直接将臭氧发生器直于房间中间即可。臭氧消毒效果的验证中需确谇和校正的臭氧发生器技术指标有：臭氧产量、臭氧浓度和时间定时器，并通过验证检查细菌数来确定消毒时间。第13页，本讲稿共16页六、甲醛消毒方法计算房间体积，按10g/m3的比例秤出甲醛。将甲醛倒甲醛发
16、生器或加热盘或烧杯中，并放好加湿用水，必要时还可加入高锰酸钾（2-3g/m3）,然后加热（甲醛发生器用蒸汽加热，加热盘或烧杯可用热水盛入其中加热）使其蒸发成气体。灭菌流程：空调器停止运转启动甲醛气体发生器或在加热盘中热甲醛让甲醛气体扩散约30分钟启动空调器让甲醛气体循环约30分钟停止空调器，房间熏蒸消毒，时间不少于8小时房间排气，用新鲜空气置换约2小时恢复正常运行。当相对温度在65以上，温度在2440时，甲醛气体的消毒效果最好。甲醛消毒灭菌的气体发生量、熏蒸时间，换气时间等应以验证结果来最后确定。第14页，本讲稿共16页第四节消毒剂消毒洁净室的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、车、桌
17、、椅等表面以及人体双手（手套）在环境验证及日常生产时，应定期清洁并用消毒剂喷洒。常见的消毒剂有异丙醇（75）、乙醇（75）、新洁而灭（0.10.2）等。亦可用0.53%石碳酸或25的甲苯酚。无菌室用的消毒剂必须在层流工作台中，用0.22m的滤膜过滤后方能使用。六、灭菌管理要点一)、选用滤过器材和处理方法应符合工艺要求，微孔滤膜使用前后应作完整性试验，以保证其灭菌效果。二)、药液从配制到灭菌开始，其间隔不得超过工艺规定的时间。三)、灭菌应有温度、压力及升温时间、恒温时间、数量及全过程的温度压力曲线图或温度曲线图。四)、按批号进行灭菌，不得混批。灭菌前后的中间产品应有可靠的防混措施。五)、灭菌设备
18、使用前都必须进行验证，工艺改变或大修后，要进行再验证，以确保灭菌效果。六)、灭菌釜宜选择双扉式的灭菌釜，使用前应进行温度均匀性和灭菌效果的验证，并有记录，F0值应控制在8.0以上。七)、直接接触药品的包装材料、设备和其他物品的从灭菌到使用时间间隔应有规定。1.当一个批号产品使用多个灭菌柜灭菌时，应加亚批号。2.使用消毒剂消毒时，应有二个以上消毒剂轮换使用，以防止产生耐药菌株。第15页，本讲稿共16页第五节蒸汽灭菌釜验证蒸汽灭菌验证，一般的验证步骤如下：1.验证方案的制订；2.验证方案的批准；3.仪表及文件的准备；4.预确认；5.安装确认电气安装、蒸汽安装、冷却水安装；6.运行确认单机或系统试车；7.性能确认热分布测试、热穿透性试验、生物指示剂验证试验、微生物孢子的挑战性试验；8.验证报告数据分析、验证结果、评价和建议；9.批准结论。蒸汽灭菌釜验证如何进行，原国家医药管理局推行GMP、GSP委员会编的药品生产验证指南（1996年4月出版）P263附录四“灭菌釜验证示例”可作参考。第16页，本讲稿共16页