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1、实验一一培养基的制备与灭菌第1页，本讲稿共39页实验要求实验要求课前充分预习，上课不无故缺席，实验报告要及时上交。课前充分预习，上课不无故缺席，实验报告要及时上交。实验期间不得大声喧哗、服从老师的安排、注意安全。实验期间不得大声喧哗、服从老师的安排、注意安全。实验器材专人专用，对仪器要爱护，损坏实行赔偿制度。实验器材专人专用，对仪器要爱护，损坏实行赔偿制度。实验菌种和物品未经许可，不得携出室外，用后的菌种按实验菌种和物品未经许可，不得携出室外，用后的菌种按老师要求妥善处理。老师要求妥善处理。维护好实验室的环境卫生，实行值日生制度。维护好实验室的环境卫生，实行值日生制度。第2页，本讲稿共39页实
2、验报告要求实验报告要求统一用统一用A4纸纸手写手写实验报告实验报告封面格式封面格式 1、实验课程名称、实验课程名称 2、实验项目名称、实验项目名称 3、学生所在的专业、班级、姓名、学号、学生所在的专业、班级、姓名、学号 4、实验日期、实验日期 5、同组者姓名、同组者姓名第3页，本讲稿共39页实验报告格式实验报告格式 1、实验目的、实验目的 2、实验原理、实验原理 3、实验仪器、溶液试剂、实验仪器、溶液试剂 4、实验步骤、实验步骤 5、实验结果（如绘图、列表等）、实验结果（如绘图、列表等）6、思考题、思考题第4页，本讲稿共39页实验成绩的组成实验成绩的组成 平常成绩平常成绩30（实验操作表现、实
3、验报告）（实验操作表现、实验报告）操作考试操作考试30 笔试成绩笔试成绩40第5页，本讲稿共39页实实验验内内容容土壤中微生物的分离纯化与活菌计数土壤中微生物的分离纯化与活菌计数显微镜的使用及酵母菌、放线菌的形态观察显微镜的使用及酵母菌、放线菌的形态观察霉菌的形态观察霉菌的形态观察油镜的使用、细菌的单染色和革兰氏染色油镜的使用、细菌的单染色和革兰氏染色微生物大小测定、显微镜直接计数法微生物大小测定、显微镜直接计数法微生物生理生化反应微生物生理生化反应水中细菌总数和总大肠菌群的测定水中细菌总数和总大肠菌群的测定微生物的紫外诱变微生物的紫外诱变第6页，本讲稿共39页（一）培养基的制备与灭菌（一）培
4、养基的制备与灭菌实验一、土壤中微生物的分离纯化与活菌计数第7页，本讲稿共39页一、培养基的制备一、培养基的制备目的要求目的要求明确培养基的配制原理明确培养基的配制原理通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤般方法和步骤第8页，本讲稿共39页按培养基的用途分按培养基的用途分基础培养基基础培养基鉴别培养基鉴别培养基选择培养基选择培养基按培养基的物理状态分按培养基的物理状态分固体培养基固体培养基半固体培养基半固体培养基液体培养基液体培养基按成分不同分按成分不同分天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基半合成培养基半合成培养基基本原理基本原理第9
5、页，本讲稿共39页培养基的配方培养基的配方牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨琼脂培养胨琼脂培养基（一种天基（一种天然培养基，然培养基，用于分离和用于分离和培养细菌）培养细菌）配方：配方：牛肉膏牛肉膏 3g蛋白胨蛋白胨 10g氯化钠氯化钠 5g琼脂琼脂 20g水水 1000mlpH 7.2-7.4灭菌灭菌 121 20min 第10页，本讲稿共39页高氏高氏号号培培养基（一种养基（一种合成培养基，合成培养基，可用于培养可用于培养放线菌）放线菌）配方：配方：可溶性淀粉可溶性淀粉 20gKNO3 1gNaCl 0.5gK2HPO4 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g琼脂琼脂 20g水水 1000
6、mlpH 7.27.4灭菌灭菌 121 20min 第11页，本讲稿共39页固体淀粉培养基固体淀粉培养基（一种鉴别培养（一种鉴别培养基，用于大分子基，用于大分子物质水解的生理物质水解的生理生化鉴定）生化鉴定）配方：配方：蛋白胨蛋白胨 10g 氯化钠氯化钠 5g 牛肉膏牛肉膏 5g 可溶性淀粉可溶性淀粉 2g 蒸馏水蒸馏水 1000ml 琼脂琼脂 1520g 灭菌灭菌 121 20min第12页，本讲稿共39页 器材器材溶液或试剂溶液或试剂 4mol/L NaOH，1mol/L HCl，各类培养基的配方药品。，各类培养基的配方药品。仪器或其他用具仪器或其他用具 试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，
7、药匙，电磁炉，高试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉，高压蒸气灭菌锅，压蒸气灭菌锅，pH试纸试纸(pH5.59.0)，硅胶塞，棉花，硅胶塞，棉花，报纸，记号笔等。报纸，记号笔等。第13页，本讲稿共39页 操作步骤（一）操作步骤（一）1 1 计算：根据配方按照用量计算。2.2.称量：3 3溶解：如有琼脂，要不断搅拌避免糊底。4 4、调节pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节，以pH试纸或pH计测定。5 5过滤：趁热用四层纱布过滤。第14页，本讲稿共39页操作步骤（二）操作步骤（二）6.分装 试管：固体不超过试管高度的 1/5；液体、半固体不超过试管高度的1/4或1/3
8、。三角烧瓶：总体积的一半为限。管口或瓶口不得沾有培养基第15页，本讲稿共39页操作步骤（三）操作步骤（三）7.加塞1.正确；正确；2.管内部分太短，外部太松；管内部分太短，外部太松；3.外部过小外部过小第16页，本讲稿共39页操作步骤（三）操作步骤（三）8.包扎：注明培养基的名称。9.灭菌：按各自培养基灭菌的温度、时间灭菌。10.搁置斜面 (1/3l/2，不能超过，不能超过1/2)。11.无菌检查第17页，本讲稿共39页实验无菌器皿的准备实验无菌器皿的准备无菌水：在试管或三角瓶内量取实验所需的自来水，无菌水：在试管或三角瓶内量取实验所需的自来水，经经 121 20min灭菌。灭菌。无菌无菌移液
9、吸管移液吸管、培养皿培养皿：报纸包扎后，经：报纸包扎后，经121 20min灭菌。灭菌。第18页，本讲稿共39页第19页，本讲稿共39页 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。法的原理及其使用方法。目的要求目的要求二、消毒与灭菌第20页，本讲稿共39页 灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射的方法很
10、多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。和使用化学药品等方法。基本原理基本原理第21页，本讲稿共39页干热灭菌干热灭菌火焰灼烧法火焰灼烧法干热灭菌法干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法）（烘箱内热空气灭菌法）湿热灭菌法湿热灭菌法加压蒸汽灭菌法加压蒸汽灭菌法紫外线灭菌法紫外线灭菌法微孔滤膜过滤除菌微孔滤膜过滤除菌第22页，本讲稿共39页火焰灼烧法火焰灼烧法直接在火焰上灼烧灭菌直接在火焰上灼烧灭菌主要用于实验室接种针主要用于实验室接种针(环环)、试管口、三角瓶口和金属小、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。工具等的灭菌。第23页，本讲稿共39页干热灭菌法干热灭菌法设备：电热烘箱设备：电热烘
11、箱适用于耐高温器皿，适用于耐高温器皿，160-170，维持，维持2小时小时注意事项：注意事项：1.温度不可超过温度不可超过180，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。2.灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。3.灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。4.电烘箱内温度电烘箱内温度70时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。第24页，本讲稿共39页2.湿热灭菌(一）l高压蒸汽灭菌法：
12、是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内0.1MPa0.1MPa，121121保持保持151530min30min进行灭菌，从而导致菌体进行灭菌，从而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长短可根据蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。第25页，本讲稿共39页在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。在同一温度下，湿热的
13、杀菌效力比干热大。原原因因一一：湿湿热热中中细细菌菌菌菌体体吸吸收收水水分分，蛋蛋白白质质较较易易凝凝固固，因因蛋蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。白质含水量增加，所需凝固温度降低。卵白蛋白含水量卵白蛋白含水量/%/%3030分钟内凝固所需温度分钟内凝固所需温度/505625748018809061450160170蛋白质含水量与凝固所需温度的关系蛋白质含水量与凝固所需温度的关系第26页，本讲稿共39页原因二：湿热的穿透力比干热大。原因二：湿热的穿透力比干热大。原因三：湿热的蒸气有潜热存在。原因三：湿热的蒸气有潜热存在。温度温度/时间时间/h透过布层的温度透过布层的温度/灭菌灭菌干热干热13
14、01404867270.5不完全不完全湿热湿热105.33101101101完全完全第27页，本讲稿共39页在同一压力下，含有空气的蒸汽所达到的温度低于饱和蒸汽的温度，在同一压力下，含有空气的蒸汽所达到的温度低于饱和蒸汽的温度，所以所以排气排气是否完全很重要。是否完全很重要。第28页，本讲稿共39页l间歇灭菌法：应用于不易于高压蒸汽灭菌的培养应用于不易于高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。此基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，每天加热法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，每天加热10030min10030min、连续三天，可彻底
15、灭菌。、连续三天，可彻底灭菌。l煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般煮沸消毒时间为一般煮沸消毒时间为101015min15min。l超高温杀菌：此法指在温度和时间标准分别为此法指在温度和时间标准分别为135135150150和和2 28s8s的条件下对牛乳或其他液态食品进行处的条件下对牛乳或其他液态食品进行处理的一种工艺。理的一种工艺。2.湿热灭菌(二）第29页，本讲稿共39页高压蒸汽灭菌法操作步骤（三）第30页，本讲稿共39页手提式高压蒸汽灭菌锅手提式高压蒸汽灭菌锅第31页，本讲稿共39页全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅
16、第32页，本讲稿共39页操操作作步步骤骤（三三）（以以手手提提式式高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌锅锅为为例例）1.1.装锅先先向向外外层层锅锅内内加加入入适适量量的的水水，放放入入内内锅锅，装装入入待待灭灭菌菌物物品。品。2.2.加盖 将将盖盖上上的的排排气气软软管管插插入入内内层层灭灭菌菌锅锅的的排排气气槽槽内内。再再以以两两两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。3.3.灭菌 加加热热，并并同同时时打打开开排排气气阀阀，待待冷冷空空气气完完全全排排尽尽后后，关关上上排排气气阀，升温至阀，升温至l21l21时维持时维持1520min1520min
17、。4.4.降温取物 灭灭菌菌结结束束后后，切切断断电电源源，当当压压力力表表的的压压力力降降至至0 0时时，打开排气阀，开盖取物。打开排气阀，开盖取物。第33页，本讲稿共39页加压蒸汽灭菌法加压蒸汽灭菌法0.1MPa，121，20min灭菌灭菌注意事项：注意事项：1.切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2.锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。3.压力一定要降到压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。时，才能打开排气阀，开盖取物
18、。4.灭菌全程必须有人看守。灭菌全程必须有人看守。第34页，本讲稿共39页紫外线灭菌法紫外线灭菌法适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。菌。紫外线灯距照射物以不超过紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。为宜。若紫外线照射与若紫外线照射与3%5%的石炭酸溶液或的石炭酸溶液或2%3%的的来苏尔来苏尔等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。注意事项：注意事项：紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能
19、在紫外线灯光下工作。紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。第35页，本讲稿共39页过滤除菌法过滤除菌法适用于不耐热的液体物质（如维生素、血清、酶等热敏性适用于不耐热的液体物质（如维生素、血清、酶等热敏性物质）。物质）。滤膜孔径：滤膜孔径：0.22m缺点：无法去除培养液中的病毒和噬菌体。缺点：无法去除培养液中的病毒和噬菌体。第36页，本讲稿共39页思考题思考题培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？培养基是无菌的？在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题,为什么？为什么？P27（1）为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？请设为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较方案。计干热灭菌和湿热灭菌效果比较方案。P27（2）在高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？在高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，时才能打开排气阀，开盖取物？开盖取物？P27（3）第37页，本讲稿共39页第38页，本讲稿共39页第39页，本讲稿共39页