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1、生物检测技术生物检测技术韶关学院生命科学学院韶关学院生命科学学院易道生易道生OfficeOffice：英东楼：英东楼B-301B-301MpMp：EmailEmail：内容内容主要由六个模块构成：生物化学检测技术免疫学检测技术细胞学检测技术分子生物学检测技术微生物学检测技术生物检测仪器第一章第一章 生物化学检测技术生物化学检测技术内容第一节电泳技术第一节电泳技术第二节光谱分析技术第二节光谱分析技术第三节生物大分子含量测定第三节生物大分子含量测定第四节色谱分析技术第四节色谱分析技术第五节干化学分析技术第五节干化学分析技术目标掌握琼脂糖电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和操作要点。掌握可见光和
2、紫外光的分光光度技术的原理和方法。理解各种蛋白质含量测定技术的原理和优缺点。理解各种核酸含量测定技术的原理和优缺点。第一节第一节 电泳检测技术电泳检测技术电泳：电泳：带电质点在电场中移动的现象。带电质点在电场中移动的现象。带电质点在电场中移动的现象。带电质点在电场中移动的现象。18091809年由俄国人发现。年由俄国人发现。年由俄国人发现。年由俄国人发现。1937年年瑞瑞典典科科学学家家Tiselius建建立立了了“移移界界电电泳泳法法”，成成功功地地分分离离血血清清蛋白质各成分。蛋白质各成分。50年年代代，改改进进电电泳泳仪仪，寻寻找找合合适适的的电电泳泳支支持持介介质质，先先后后找找到到滤
3、滤纸纸、醋醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。60年年代代，找找到到聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶作作为为电电泳泳支支持持物物，在在此此基基础础上上发发展展了了SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳、等等电电聚聚焦焦电电泳泳、双双向向电电泳泳和和印印迹迹转转移移电电泳泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。目目前前，电电泳泳技技术术已已成成为为生生物物化化学学与与分分子子生生物物学学以以及及与与其其密密切切相相关关学学科科分析中必不可少的手段。分析中必不可少的手段。电泳槽和大分子
4、分离结果电泳槽和大分子分离结果电泳技术分类从实际和实用出发的分类根据分离样品样品的数量和目的分制备和分析电泳根据结合配套的技术分免疫、层析、等电聚焦、转移、双向、脉冲梯度电场、垂直交替凝胶电泳等根据使用电压分常压（500）和高压电泳。根据电泳系统pH连续与否分连续和不连续pH电泳根据介质使用与否分自由和区带电泳（滤纸、薄层、凝胶电泳）根根据据电电泳泳槽槽的的形形式式分分有有 垂垂直直的的、水水平平的的、柱柱状状的的、板板状状的、毛细管的、湿小室及幕状的。的、毛细管的、湿小室及幕状的。毛细管电泳是20世纪80年代研制出的一种新型的区带电泳方法，具有分辨率好、灵敏度高、检测快捷等特点。自由电泳 可
5、可分分为为：显显微微电电泳泳（也也称称细细胞胞电电泳泳），是是在在显显微微镜镜下下观观察察细细胞胞或或细细菌菌的的电电泳泳行行为为；移移界界电电泳泳；柱电泳；柱电泳；自由流动幕电泳；自由流动幕电泳；等速电泳等。等速电泳等。支持物电泳 根据支持物的特点又可分为：根据支持物的特点又可分为：纸电泳薄层电泳醋酸纤维素薄膜电泳非凝胶性支持物区带电泳(支持物有：淀 粉、纤维素粉、玻璃粉、硅胶等)凝胶区带电泳：淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰 胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳。12/2/2022南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院1112/2/2022南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院12电泳
6、基本原理电电泳泳是是不不同同的的物物质质颗颗粒粒在在一一定定的的电电场场强强度度下下，由由于于所所带带电电荷荷及及颗颗粒粒大大小小形形状状等等不不同同，因因此此向向相相反反电电极极泳泳动动速速度度不同进而达到分离目的一种方法。不同进而达到分离目的一种方法。在在一一定定pH条条件件下下，每每一一种种分分子子都都具具有有特特定定的的电电荷荷（种种类类和和数数量量）、大大小小和和形形状状，在在一一定定时时间间内内它它们们在在相相同同电电场场中中泳泳动动速速度度不不同同，各各自自集集中中到到特特定定的的位位置置上上而而形形成成紧紧密密的的泳泳动动带带。这这就就是是带带电电粒粒子子可可以以用用电电泳泳技
7、技术术进进行行分分离离、分析和鉴定的基本原理。分析和鉴定的基本原理。带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度。带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度。电泳时，带电颗粒（球形）在介质中受力平衡匀速运动，则电泳时，带电颗粒（球形）在介质中受力平衡匀速运动，则有：有：v=F阻/f =FE/f =Eq/f =Eq/(6r)v 泳动度泳动度F阻阻 颗粒所受阻力颗粒所受阻力FE 颗粒所受电场力颗粒所受电场力f 摩擦系数摩擦系数由上式可见：由上式可见：泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷以及电场强度有关。电荷以及电场强度有关。非球形分子（如线状非球形分子
8、（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，）在电泳过程中受到更大的阻力，即即粒子的泳动度与粒子形状有关粒子的泳动度与粒子形状有关。nE 电场强度电场强度nq 颗粒所带电荷颗粒所带电荷nr 颗粒半径颗粒半径n 介质黏度介质黏度相对迁移率（Rf）：分离区带的泳动速度可用相对迁移率来表示。分离区带的泳动速度可用相对迁移率来表示。测测定定迁迁移移率率时时，在在电电泳泳结结束束后后要要先先在在指指示示剂剂移移动动的的位位置置（前前沿沿）作作一一标标记记（通通常常是是插插一一根根短短铜铜丝丝），染染色色后后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。Rf谱带迁移距离/前
9、沿指示剂迁移距离测量迁移率时，应以谱带的中部位置为准，值得注意的是，交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响迁移率。另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移速度。为了使试验重复性好，这些因子都应尽可能保持恒定。一、琼脂糖凝胶电泳1、原理：琼脂糖琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。DNA分子在碱性缓
10、冲液中带负电荷分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效电荷效应与分子筛效应应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。以以对对于于分分子子量量大大的的样样品品，如如大大分分子子核核酸酸，病病毒毒等等，一一般般采采用用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶的特点：天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖是直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列织成。2
11、、操作方法试剂与设备上样上样buffer 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液以上溶液4保存备用。制胶：称干粉，融化，倒胶，插梳子，凝固，装电泳槽。3、步骤1g琼脂糖加入100ml1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60，加入100l的0.5mg/ml EB，并摇匀。）用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。用移液器吸取总DNA或质粒样品
12、4l于封口膜上，再加入2l的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。目目前前多多用用琼琼脂脂糖糖为为电电泳泳支支持持物物进进行行平平板板电电泳泳，琼琼脂脂糖糖是经过挑选，以质地较纯的琼脂作为原料而制成的。是经过挑选，以质地较纯的琼脂作为原料而制成的。优点如下：琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。琼脂糖凝胶结构均匀，含
13、水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。目目前前，常常用用琼琼脂脂糖糖作作为为电电泳泳支支持持物物，分分离离蛋蛋白白质质和和同同工工酶酶。将将琼琼脂脂糖糖电电泳泳与与免免疫疫化化学学相相结结合合，发发展展成成免免疫疫电电泳泳技技术术，能能鉴鉴别别其其他他方方法法不不能能鉴鉴别别的的复复杂杂体体系，由于建立了超微量技术，系，由于建立了超微量技术，0.1g蛋白质就可检出。蛋白质就可检出。琼
14、琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳也也常常用用于于分分离离、鉴鉴定定核核酸酸，如如DNA鉴鉴定定，DNA限限制制性性内内切切酶酶图图谱谱制制作作等等。由由于于这这种种方方法法操操作作方方便便，设设备备简简单单，需需样样品品量量少少，分分辨辨能能力力高高，已成为基因工程研究中常用实验已成为基因工程研究中常用实验 方法之一。方法之一。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的大小(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.232.00.1212/2/2022韶关大学生命科学学院韶关大学生命科学学院25PCR产物的琼脂糖电泳12/2/2022261002003001,6501
15、,0005008506504005,000bp2,000DNAladderDNAladderPCR产物产物12345678胶孔胶孔+-+-+-引物二聚体引物二聚体12/2/2022南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院274、影响因素1）琼脂糖来源，纯度。酸根取代导致Agarose带电。对对支支持持物物的的一一般般要要求求是是均均匀匀，吸吸附附力力和和电电渗渗小小，机机械械性性能能好好，便便于于染染色色或或紫紫外外光光下下检检测测，故故最最好好透透明明，无无紫紫外外吸吸收收。常常用用的的支支持持物物有有滤滤纸纸，醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜，淀淀粉粉凝凝胶胶，聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝
16、凝胶胶，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶等等。支支持持物物性性质质不不同同也也会会影影响响泳泳动动速速率率，如如琼琼脂脂于于聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶都都有有大大小小不不同同的的筛筛孔孔，在在筛筛孔孔大大的的凝凝胶胶中中溶溶质质颗粒的泳动速率快，反之则慢。颗粒的泳动速率快，反之则慢。2）胶浓度3）电场强度：电电场场强强度度是是指指每每厘厘米米的的电电位位降降，也也称称电电位位梯梯度度(电电势势梯梯度度)。电电场场强强度度越越高高，则则带带电电颗颗粒粒泳泳动动越越快快。根根据据电电场场强度的不同，电泳可分为：强度的不同，电泳可分为：常常压压(100-500V)电电泳泳。其其电电场场强强度度为为2-10V/
17、cm。分分离离时时间间较较长长，从从数数小小时时到到数数十十小小时时，适适合合于于分分离离蛋蛋白白质质等等大大分子物质。分子物质。高高压压(2000-10000V)电电泳泳。其其电电场场强强度度为为50-200V/cm，电电泳泳时时间间很很短短，有有时时只只需需几几分分钟钟。多多用用于于分分离离氨氨基基酸酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。4）溶液pH为为使使电电泳泳时时pH值值恒恒定定，必必须须采采用用缓缓冲冲液液作作为为电电极极液液，溶溶液液的的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。对对蛋
18、蛋白白质质而而言言，溶溶液液pH值值离离等等电电点点越越远远，则则颗颗粒粒所所带带的的净净电电荷荷越越多多，泳泳动动速速度度也也越越快快；反反之之，则则越越慢慢。因因此此分分离离某某种种蛋蛋白白质质混混合合液液时时，应应选选择择合合适适的的pH使使欲欲分分离离的的各各种种蛋蛋白白质质所所带带的电荷数量有较大的差异。的电荷数量有较大的差异。12/2/2022南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院315）溶液的离子强度缓缓冲冲液液离离子子强强度度越越高高，则则颗颗粒粒的的电电动动电电势势越越小小，泳泳动动度度也也越越小小。一一般般最最适适合合的的离离子子强强度度在在之之间间。溶溶液液离
19、离子子强强度度(ionic strength)的计算公式如下：的计算公式如下：I=1/2cz2 式中，I为离子强度，c为离子的摩尔浓度(mol/L)，z为离子价数，价数越高，则离子强度越大。6）电渗电电泳泳缓缓冲冲液液相相对对于于固固体体支支持持物物的的移移动动称称电渗。如如纸纸电电泳泳时时，滤滤纸纸吸吸附附OH-离离子子带带负负电电荷荷，与与纸纸接接触触的的缓缓冲冲液液带带正正电电荷荷向向负负极极移移动动，会会对对颗颗粒粒的的移移动动造造成成不不良良影影 响响，故故电电泳泳时时，电渗电渗 小些为好。小些为好。7）温度电电泳泳时时会会产产生生焦焦耳耳热热，使使介介质质粘粘度度下下降降，分分子子
20、运运动动加加快快，迁迁移移率率增增加加，同同时时温温度度过过高高会会使使样样品品中中的的生生物物大大分分子子变变性性失失活活，因因此此电电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。8）支持物现现代代电电泳泳多多在在固固体体支支持持物物上上进进行行，使使样样品品中中的的不不同同组组分分形形成成不不同同的的区区带带，称称区区带带电电泳泳。电电泳泳结结束束后后，支支持持物物可可以以方方便便地地进进行行染染色色等后续处理。等后续处理。印迹转移电泳：生生物物化化学学与与分分子子生生物物学学的的研研究究工工作作经经常常需需要要对对电电泳泳分分离离后后的的D
21、NA进进行行分分子子杂杂交交，但但琼琼脂脂糖糖不不适适合合于于进进行行杂杂交交操操作作1975年年，Southern创创造造了了将将经经琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳后后的的DNA区区带带原原位位转转移移到到硝硝酸酸基基纤纤维维素素膜膜(NC膜膜)上上，再再进进行行杂交的方法，被称为杂交的方法，被称为Southern印迹法。印迹法。随随后后出出现现RNA印印迹迹（被被戏戏称称为为Northern印印迹迹），蛋蛋白白质印记（质印记（Western印迹）等。印迹）等。交变脉冲电场凝胶电泳一一般般琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳只只能能分分离离小小于于20kb的的DNA。这这是是因因为为在在琼琼脂脂糖糖凝
22、凝胶胶中中，DNA分分子子的的有有效效直直径径超超过过凝凝胶胶孔孔径径时时，在在电电场场作作用用下下，迫迫使使DNA变变形形挤挤过过筛筛孔孔，而而沿沿着着泳泳动动方方向向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大。伸直，因而分子大小对迁移率影响不大。如如此此时时改改变变电电场场方方向向，则则DNA分分子子必必须须改改变变其其构构象象，沿沿新新的的泳泳动动方方向向伸伸直直，而而转转向向时时间间与与DNA分分子子大大小小关关系系极极为为密密切。切。1983年年，Schwartz等等人人根根据据DNA分分子子弹弹性性弛弛豫豫时时间间（外外推推为为零零的的滞滞留留时时间间）与与DNA分分子子大大小小有有关关的
23、的特特性性，设设计计了了脉脉冲冲电电场场梯梯度度凝凝胶胶。Carle等等改改进进了了电电泳泳技技术术，并并发发现现周周期期性的反转换电场亦能使大分子性的反转换电场亦能使大分子 DNA 通过电泳分开。通过电泳分开。该该电电泳泳系系统统是是由由一一个个水水平平式式电电泳泳槽槽和和两两组组独独立立，彼彼此此垂垂直直的的电电极极组组成成，一一组组电电极极负负极极为为N，正正极极为为S；另另一一组组负负极极为为W，正正极极为为E。一一块块正正方方形形琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶板板呈呈45置置于于中央，电场在中央，电场在N-S和和W-E之间交替建立。之间交替建立。电电场场交交替替改改变变的的时时间间长长短短与与
24、欲欲分分离离的的DNA分分子子大大小小有有关关。电电泳泳时时，DNA分分子子处处在在连连续续间间隔隔交交替替的的电电场场中中。首首先先向向S极极移移动动，然然后后改改向向E极极。在在每每次次电电场场方方向向改改变变时时，DNA分分子子就就要要有有一一定定的的时时间间松松弛弛，改改变变形形状状和和迁迁移移方方向向。只只有有当当DNA分分子子达达到到一一定定构构型型后后，才才能能继继续续前前进进。DNA分分子子净净移移动动方方向向与与加加样样线线垂垂直直，使使样样品品中中各各组组分分沿沿同同一一泳泳道道形形成成各各自自的的区区带带。交交变变脉脉冲冲电电泳泳可可有有效效分分离离数数百百万万bp的的大
25、分子大分子DNA。4.4.交变脉冲电场凝胶电泳免疫电泳：免免疫疫电电泳泳是是以以琼琼脂脂（糖糖）为为支支持持物物，在在免免疫疫的的基基础础上上，将将琼琼脂脂（糖糖）区区带带电电泳泳与与免免疫疫扩扩散散相相结结合合产产生生特特异异性性的的沉淀线、弧或峰。沉淀线、弧或峰。此技术的特点：此技术的特点：样品用量极少，免疫识别具有专一性，分辨率高。在在琼琼脂脂糖糖免免疫疫双双扩扩散散的的基基础础上上发发展展了了多多种种免免疫疫电电泳泳，如如微微量量免免疫疫电电泳泳、对对流流免免疫疫电电泳泳、单单向向定定量量免免疫疫电电泳泳（火火箭电泳）、放射免疫电泳及双向定量免疫电泳等。箭电泳）、放射免疫电泳及双向定量
26、免疫电泳等。上上述述各各种种电电泳泳有有其其共共性性，但但又又有有不不同同的的操操作作方方法法及及原原理理，详见后续章节。详见后续章节。二、RNA电泳检测1、原理与过程 RNA电泳基本同电泳基本同DNA电泳一样。电泳一样。但但应应明明确确一一点点的的是是，因因为为RNA分分子子对对RNA酶酶的的作作用用非非常常敏敏感感，因因此此必必须须用用对对RNA酶酶有有抑抑制制作作用用DEPC水水来来配配置置所所有有溶溶液液，所所有有与与RNA接接触触的的仪仪器器和和装装置置都要严格处理以尽量减少都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解。酶对样品的降解。另另外外，因因为为RNA分分子子有有二二、三三级级
27、结结构构可可以以影影响响其其电电泳泳结结果果，因因此此电电泳泳时时应应在在变变性性剂剂存存在在下下进进行行，常常用用的变性剂为甲醛和戊二醛。的变性剂为甲醛和戊二醛。2、试剂设备试剂试剂:A.5 X MOPS电泳缓冲液电泳缓冲液：20.9g MOPS(0.1mol/L),pH7.0;8.3ml 3mol/L NaAC(40mmol/L);10.0ml 0.5mol/L EDTA(5mmol/L)pH8.0,用水定容至1L.以上药品和水均需用DEPC处理。B.10 x甲醛上样缓冲液甲醛上样缓冲液：1mmol/L EDTA,pH8.0;0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯蓝，50%甘油).C.37%甲
28、醛甲醛（pH 大于4.0，12.3mol/L）;D.甲酰胺甲酰胺;E.10mg/ml溴化乙锭溴化乙锭.F.以上药品和水均需用DEPC处理。3、步骤A.胶的制备：1.5g琼脂糖加115ml水，加热融化。冷却至60时加30ml的5XMOPS电泳缓冲液(终浓度为1X);加5ml甲醛（琼脂糖终浓度为1%）。制胶。B.样品制备：C.RNA(最多30ug)5.5ulD.5XMOPS电泳缓冲液2.0ulE.甲醛3.5ulF.甲酰胺10ulG.在65下处理15min,然后置冰上。C.加样品前，先用5v/cm电压电泳5分钟。D.制备好的样品短暂离心后加10X上样缓冲液2ul，混匀。E.上样。F.在1 X MOP
29、S电泳缓冲液中电泳2-3小时。在电泳1-2小时后，可混合正负极缓冲液，再继续电泳。G.染色：将电泳好的胶板转移至含0.5ug/L溴化乙锭的0.1mmol/L NH4AC溶液中染色30-40min.（溴化乙锭也可以在电泳前加于样品中）4、影响因素1）Agarose来源，纯度。2）胶浓度3）以乙二醛DSMO做变性系统时，制胶时不加EB，电泳后浸胶入EB溶液。并需要buffer循环系统，避免形成过高的pH梯度。4）避免RNA因RNase污染而降解。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶是是由由单单体体丙丙烯烯酰酰胺胺（简简称称Acr）和和交交联联剂剂N，N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺（
30、简简称称Bis）在在加加速速剂剂和和催催化化剂剂的的作作用用下下聚聚合合并并联联成成三三维维网网状状结结构构的的凝凝胶胶，以以此此凝凝胶胶为为支支持持物物的的电电泳泳称称为为聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳（简简称称PAGE）。）。聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。对对pH和温度变化较稳定。和温度变化较稳定。几几乎乎无无电电渗渗作作用用，只只要要Acr纯纯度度高高，操操作作条条件件一一致致，则则样品分离重复
31、性好。样品分离重复性好。样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。分分辨辨率率高高，尤尤其其在在不不连连续续凝凝胶胶电电泳泳中中，集集浓浓缩缩、分分子子筛筛和和电电荷荷效效应应为为一一体体，因因而而较较醋醋酸酸 纤纤维维薄薄膜膜电电泳泳、琼琼脂糖电泳等有更高的分辨率。脂糖电泳等有更高的分辨率。聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：分离范围不同分离范围不同琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大
32、的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。凝胶配置程序不同凝胶配置程序不同琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶在在配配置置时时还还要要加加多多种种成成分分，并并且且对对聚聚合合温温度度也也有有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。凝胶的厚度不同凝胶的厚度不同琼脂糖凝胶最薄只能达到；琼脂糖凝胶最薄只能达到；聚丙烯酰胺凝胶可以制成聚丙烯酰胺凝胶可以制成.，分辨率高。，分辨率高。
33、成本不同。成本不同。琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高安全性不同。安全性不同。琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性PAGE应应用用范范围围广广，可可用用于于蛋蛋白白质质、酶酶、核核酸酸等等生生物物分分子子的的分分离离、定定性性、定定量量及及少少量量的的制制备备，还还可测定相对分子质量、等电点等。可测定相对分子质量、等电点等。聚丙烯酰胺凝胶电泳又有以下几种：聚丙烯酰胺凝胶电泳又有以下几种：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳连续密度梯度电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳1、凝胶聚合的原理及有
34、关特性1.1.聚合反应聚合反应聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺是是由由丙丙烯烯酰酰胺胺（Acr）和和甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺（Bis）在催化剂作用下合成的。）在催化剂作用下合成的。催化系统常用有两种：催化系统常用有两种：过硫酸氨过硫酸氨TEMED化学催化聚合系统化学催化聚合系统此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。核黄素核黄素TEMED光聚合催化系统光聚合催化系统此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量
35、氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。12/2/2022南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院491.2.凝胶孔径的可调性及其有关性质凝胶孔径的可调性及其有关性质A.凝胶性能与总浓度及交联度的关系：凝凝胶胶的的孔孔径径、机机械械性性能能、弹弹性性、透透明明度度、粘粘度度和和聚聚合合程程度度取取决决于于凝凝胶胶总浓度和总浓度和Acr与与Bis之比。之比。T Acr和Bis总浓度C 交联剂百分比V 缓冲液体积(mL)a/b(W/W)与与凝凝胶胶的的机机械械性性能能密密切切相相关关。当当a/b10时时，凝凝胶胶脆脆而而易易碎
36、碎，坚坚硬硬呈呈乳乳白白色色；a/b100时时，即即使使5%的的凝凝胶胶也也呈呈糊糊状状，易易于于断断裂裂。欲欲制制备备完完全全透透明明而而又又有有弹性的凝胶，应控制弹性的凝胶，应控制a/b=30左右。左右。na Acr克数nb Bis克数不不同同浓浓度度的的单单体体对对凝凝胶胶性性能能影影响响很很大大。Davis的的实实验验发发现现Acr2%，Bis0.5%，凝凝胶胶就就不不能能聚聚合合。当当增增加加Acr浓浓度时要适当降低度时要适当降低Bis的浓度。的浓度。通通常常，T为为2%-5%时时，a/b=20左左右右；T为为5%-10%时时，a/b=40左左右右；T为为15%-20%时时，a/b=
37、125-200左左右右，为为此此Richard等等(1965)提出一个选择提出一个选择c和和T的经验公式；的经验公式；C=6.50.3T此此公公式式适适用用于于T为为5-20%范范围围内内的的c值值，其其值值可可有有1%的的变变化。化。在在研研究究大大分分子子核核酸酸时时，常常用用T=2.4%的的大大孔孔凝凝胶胶，此此时时凝凝胶胶太太软软，不不易易操操作作，可可加加入入0.5%琼琼脂脂糖糖。在在T=3%时时，也也可可加加入入20%蔗蔗糖糖以以增增加加机机械械性性能能，此此时时，并并不不影影响响凝凝胶孔径的大小。胶孔径的大小。凝胶浓度与孔径的关系：T与C不仅与凝胶的机械性能有关，还与凝胶的孔径关
38、系极为密切。一般讲，T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。此外，孔径还同Acr与Bis的比例有关，Bis占Acr总浓度5%时，孔径最小。B.凝胶浓度与被分离物相对分子量质的关系：由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的相对分子质量也不同。在操作时，可根据被分离物相对分子质量大小选择所需凝胶的浓度范围。也可先选用7.5%凝胶(标准胶)，因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得较满意的结果。如分析未知样品时也可用4%-10%的梯度胶测试，根据分离情况选择适宜的浓度以取得理想的分离效果。12/2/2022韶关大学韶关大学 生命科学学院生命科学学院531.3.影响凝胶聚合的因素A.
39、Acr及Bis的纯度：应应选选用用分分析析纯纯的的Acr及及Bis，两两者者均均为为白白色色结结晶晶物物质质，280无无吸吸收收。如如试试剂剂不不纯纯，含含有有杂杂质质或或丙丙烯烯酸酸时时，则则凝凝胶胶聚聚合合不不均均一一，或或聚聚合合时时间间延延长长甚至不聚合，甚至不聚合，因而需进一步纯化。因而需进一步纯化。Acr及Bis固体应避光，贮存在棕色瓶中，因自然光、超声波及射线均可引起Acr自身聚合或形成亚胺桥而交联，造成试剂失效。Acr和Bis贮液的pH值为，当pH值的改变大于0.4pH单位则不能使用，因在偏酸或偏碱的环境中，它们可不断水解放出丙烯酸和NH4+而引起pH值改变，从而影响凝胶聚合。
40、因此，配制的Acr和Bis贮液应置棕色瓶中，4贮存，存放期一般不超过1-2个月为宜。AP、核黄素、TEMED：是是凝凝胶胶聚聚合合不不可可缺缺少少的的试试剂剂，AP应应在在干干燥燥、避避光光的的条条件件下下保保存存，其其水水溶溶液液应应置置棕棕色色瓶瓶中中，4冰冰箱箱贮贮存存，一一般般仅仅能能存存放放一一周周。TEMED（液液状状）应应密密闭闭贮贮于于4冰冰箱箱中中。增增加加AP和和TEMED可可加加快快聚聚合合速速率率，但但过过量量的的AP和和TEMED会会引引起起电电泳泳时时烧烧胶胶和和谱谱带带变变形形。应应选选择合适的配方使聚合在择合适的配方使聚合在40-60min内完成。内完成。B.p
41、H：碱碱性性条条件件下下聚聚合合快快，但但碱碱性性过过强强时时胶胶硬硬而而脆脆，需需高高pH时时应应减减少少AP和和TEMED用用量量，制制酸酸性性胶胶可可加加AgNO3等等促进聚合。促进聚合。C.温度：温温度度高高聚聚合合快快，但但高高浓浓度度凝凝胶胶聚聚合合时时易易产产生生小小气气泡泡，低低温温(5)聚聚合合凝凝胶胶会会变变得得脆脆 而而混混浊浊，一一般般25-35聚聚合合较较好。好。D.氧分子：氧氧分分子子阻阻碍碍凝凝胶胶聚聚合合，故故不不含含SDS的的凝凝胶胶最最好好先先抽真空脱气，再加引发剂。抽真空脱气，再加引发剂。2、PAGE原理（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）PAGE电泳据电泳装置不
42、同分为垂直的圆盘及板电泳据电泳装置不同分为垂直的圆盘及板状两种。状两种。前者凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状，因而称为圆盘电泳；后者凝胶是在两块间隔几毫米的平行玻璃板中聚合，故称为垂直板状电泳。两者电泳原理完全相同。蛋白质进行蛋白质进行PAGE时，常用垂直板电泳。时，常用垂直板电泳。垂直板电泳的优越性有：垂直板电泳的优越性有：表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。在同一块胶板上可同时进行10个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电泳及放射自显影。胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，还可用于制备。胶板薄而透明，电泳染
43、色后可制成干板，便于长期保存与扫描。可进行双向电泳。PAGE据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为连连续续系系统统与与不不连连续系统两大类。续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。根根据据缓缓冲冲
44、液液的的PH值值的的高高低低，可可分分为为碱碱性性系系统统、酸酸性性系系统统和和中性系统。中性系统。不不连连续续体体系系由由电电极极缓缓冲冲液液、样样品品胶胶、浓浓缩缩胶胶及及分分离离胶胶组组成成，排排列列顺顺序序依依次次为为上上层层样样品品胶胶、中中间间浓浓缩缩胶胶、下下层层分分离胶。离胶。样品胶的作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲溶稀释。目前一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40%蔗糖，同样具有防止对流及样品被稀释的作用。n浓浓缩缩胶胶是是样样品品胶胶的的延延续续，凝凝胶胶浓浓度度及及pH值值与与样样品品胶胶完完全全相相同同，其其作作用用是是使使样样品品进进入入分分离离胶胶前
45、前，被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。n分分离离胶胶的的T=7.0%-7.5%，C=2.5%，缓缓冲冲液液为为pH8.9的的Tris-HCl，大大部部分分蛋蛋白白质质在在此此pH条条件件下下带负电荷。此胶主要起分子筛作用。带负电荷。此胶主要起分子筛作用。2.1.样品浓缩效应凝胶孔径的不连续性：凝胶孔径的不连续性：上述3层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。电位梯度的不连续性：电位梯度的不连续
46、性：电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：值的不连续性：在三层凝胶中均有Tris及HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子。HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子快离子。电极缓冲液中，除有Tris 外还有甘氨酸，其pI=6.0，在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1%-1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子慢离子。血清中大多数蛋白质pI在5.0
47、左右，在pH6.7或8.3时均带负电荷向正极移动，迁移率介于快离子与慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此Cl及甘氨酸根沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，逐渐分成多个区带。2.2.分子筛效应大大小小和和形形状状不不同同的的蛋蛋白白质质通通过过一一定定孔孔径径分分离离胶胶时时，受受阻阻滞滞的的程度不同而表现出不同的迁移率程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。，这就是分子筛效应。当当被被浓浓缩缩的的蛋蛋白白质质样样品品从从浓浓缩缩胶胶进进入入分分离离胶
48、胶时时，pH值值和和凝凝胶胶孔孔径径突突然然改改变变，分分离离胶胶的的pH值值8.9接接近近甘甘氨氨酸酸的的Pka值值（9.79.8），这这样样慢慢离离子子的的解解离离度度增增大大，因因而而它它的的有有效效泳泳动动率率也也增增加加。此此时时慢慢离离子子的的有有效效泳泳动动率率超超过过了了所所有有蛋蛋白白质质的的有有效效泳泳动动率率。这这样样，高高电电势势梯梯度度不不存存在在了了，各各种种蛋蛋白白质质仅仅会会由由于于其其分分子子量量或或构构型型的的不不同同，在在一一个个均均一一的的电电势势梯梯度度和和pH条条件件下下通通过过一一定定孔孔径径的的分分离离胶胶时时所所受受阻阻滞滞的的程程度度不不同同
49、，表表现现的的泳泳动动率率的不同而被分开。的不同而被分开。这这种种分分子子筛筛效效应应不不同同于于柱柱层层析析中中的的分分子子筛筛效效应应，后后者者是是大大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。2.3.电荷效应蛋蛋白白质质样样品品在在界界面面处处被被浓浓缩缩成成一一狭狭窄窄的的高高浓浓度度蛋蛋白白质质区区，但但由由于于每每种种蛋蛋白白质质分分子子所所带带有有效效电电荷荷不不同同，因因而而泳泳动动率率也也不不同同，因因此此各各种种蛋蛋白白质质就就按按泳泳动动率率快快慢慢顺顺序序排排列列成成一一个个一一个个区带。在进入分离胶时，电荷效应仍起作用。区
50、带。在进入分离胶时，电荷效应仍起作用。目目前前，PAGE连连续续体体系系应应用用也也很很广广，虽虽然然电电泳泳过过程程中中无无浓浓缩缩效效应应，但但利利用用分分子子筛筛及及电电荷荷效效应应也也可可使使样样品品得得到到较较好好的的分分离离，加加之之在在温温和和的的pH条条件件下下，不不致致使使蛋蛋白白质质、酶酶、核核酸酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性。等活性物质变性失活，也显示了它的优越性。变性PAGE原理聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓非非变变性性凝凝胶胶，即在凝胶中不加变性剂，这种凝胶中，蛋白质的迁移率受它的静电荷与分子大小