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1、 生生 物物 工工 艺艺 学学（下）（下）第第 一一 章章绪绪 论论教材：教材：l新编生物工艺学下册新编生物工艺学下册 俞俊棠俞俊棠参考教材参考教材 生物工业下游技术生物工业下游技术 毛宗贵毛宗贵 生物工程下游技术（第二版）生物工程下游技术（第二版）刘国诠刘国诠l现代生物分离工程现代生物分离工程 曹学君曹学君l生化分离工程生化分离工程 严希康严希康l生物分离工程生物分离工程 孙彦孙彦l生物分离技术生物分离技术 谭天伟谭天伟本课程主要内容本课程主要内容n 生物下游加工过程生物下游加工过程概论、概论、发酵液的发酵液的预处理预处理和固液分和固液分离方法、细胞离方法、细胞破碎、沉淀破碎、沉淀法、法、膜
2、膜分离分离技术、技术、溶剂萃取溶剂萃取法、法、双水相双水相萃取、萃取、吸吸附附法、法、离子交换离子交换法、液相色谱法、亲和分法、液相色谱法、亲和分离技术、结晶法、基因工程药物生产实例离技术、结晶法、基因工程药物生产实例等等 成绩成绩平时成绩占平时成绩占30%30%，包括平时作业、课堂，包括平时作业、课堂(实验实验报告，提问报告，提问,点名点名)等。等。期末考试占期末考试占70%70%，闭卷考试方法总成绩，闭卷考试方法总成绩:平时平时(30%)+(30%)+期末期末(70%)(70%)。一、一、下游加工过程在生物技术中的地位下游加工过程在生物技术中的地位n下游技术（工程）下游技术（工程）（dow
3、nstreamprocessing）：n对于由生物界自然产生的或由微生物菌体对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物等各种生物工业生产过程获得的生物原料原料，经经提取分离、加工并精制目的成分提取分离、加工并精制目的成分，最终，最终使其成为产品的技术。使其成为产品的技术。一、下游加工过程在生物技术中的地位一、下游加工过程在生物技术中的地位v下游技术下游技术（工程）（工程）（downstream processing）：对于由对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组生物界自然产生的或
4、由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。品的技术。v 1、下游加工过程的重要性。（组成、费用和关注程度）、下游加工过程的重要性。（组成、费用和关注程度）组成组成：下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应：下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应液需要经过下游加工过程才能成为成品；液需要经过下游加工过程才能成为成品；费用费用：传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的：传
5、统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的，而对重组生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费，而对重组生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的；用可占整个生产费用的；关注程度关注程度：从第一个基因工程药物，人胰岛素在从第一个基因工程药物，人胰岛素在19821982年投产后，年投产后，人们逐渐认识到下游加工过程的落后有可能会阻碍生物技术的发展。人们逐渐认识到下游加工过程的落后有可能会阻碍生物技术的发展。英国英国政府工业部，于政府工业部，于19831983年发起生物分离计划年发起生物分离计划(BIOSEP)(BIOSEP)，专门研，专门研究下游加工过程，有究下游加工过程，有7
6、7个国家、个国家、5050家公司参加。家公司参加。19871987年英国化学工业年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议。会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议。美国美国从从19811981年开始连续召开了生物产品回收的会议。年开始连续召开了生物产品回收的会议。我国我国也于也于19891989年在济南召开了一次专门会议。人们逐渐取得了共年在济南召开了一次专门会议。人们逐渐取得了共识；现代生物技术的发展是和下游技术的进步紧密相关的。识；现代生物技术的发展是和下游技术的进步紧密相关的。二二 传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较1.1.生化产品
7、的类型生化产品的类型n按按用途用途分类分类 食品类。食品类。保健品类。保健品类。医用类产品（医用类产品（19981998年，年，719719种）。抗生素种）。抗生素112112种种 农业用产品（农业用产品（19981998年，年，3636种）。种）。生物试剂类（生物试剂类（19981998年，年，975975种）。种）。n按按分子量分子量大小分类大小分类 Mass 1000D Mass 1000D Mass 1000D：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类n按发酵时目的按发酵时目的产物所在的位置产物所在的位置分类分类 cell cell内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、
8、重组蛋白质内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 cell cell外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（-淀粉酶）淀粉酶）2 2、传统生化产品和基因工程产品在提取传统生化产品和基因工程产品在提取和精制上的差异和精制上的差异 传统生化产品都为传统生化产品都为小分子小分子(工业用酶除外，工业用酶除外，但它们对纯度要求不高、提取方法较简单但它们对纯度要求不高、提取方法较简单)其理化性能数据都为已知，因此放大比其理化性能数据都为已知，因此放大比较有根据；较有根据；基因工程产品大多为基因工程产品大多为大分子大分子，必要数据，必要数据缺乏，放大多凭经验。缺乏，放
9、大多凭经验。由于第一代由于第一代基因工程产品基因工程产品都以都以E.coliE.coli作作为宿主，表达产品处于胞内，提取前需将为宿主，表达产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细胞破碎，细胞内细胞内物质释放出来，给提取物质释放出来，给提取增加了很多困难；增加了很多困难；而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且一般大分子较小分子不稳定多，且一般大分子较小分子不稳定(易失活，易失活，如对剪切力如对剪切力)，故提取较困难。，故提取较困难。大分子大分子(蛋白质蛋白质)的分离主要困难在于杂蛋的分离主要困难在于杂蛋白的分离，由于蛋白质都由氨基酸所构成，白的分离，由于蛋白质都
10、由氨基酸所构成，所以性质相似，分离主要依靠高分辨力的所以性质相似，分离主要依靠高分辨力的精制方法，如色谱分离等。精制方法，如色谱分离等。三、生物技术下游加工过程的特点三、生物技术下游加工过程的特点n含水多，产物含量低；含水多，产物含量低；n含菌体蛋白；含菌体蛋白；n溶有原来培养基成分；溶有原来培养基成分；n相当多的副产物、杂蛋白、毒素和色素；相当多的副产物、杂蛋白、毒素和色素；n易被杂菌污染或使产物进一步分解；易被杂菌污染或使产物进一步分解；n易起泡，粘性物质多。易起泡，粘性物质多。1.发酵液的特点发酵液的特点2.整个下游加工过程应遵循下列四个原则整个下游加工过程应遵循下列四个原则1)1)时间
11、短；时间短；2)2)温度低；温度低；3)3)pHpH适中（选择在生物物质的温度范围内）；适中（选择在生物物质的温度范围内）；4)4)严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角），严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角），这和传统产品抗生素的生产是一致的。这和传统产品抗生素的生产是一致的。对基因工程产品还应注意生物安全（对基因工程产品还应注意生物安全（biosafetybiosafety）问题，）问题，要防止菌体扩散，一般要求在密封的环境下操作。要防止菌体扩散，一般要求在密封的环境下操作。3 3 加工过程的特点加工过程的特点1)1)应用面广应用面广。医药卫生、环保、动植物生长医药卫生、环
12、保、动植物生长调节、食品和试剂等调节、食品和试剂等2)2)种类繁多种类繁多。结构功能复杂，生物活性各异。结构功能复杂，生物活性各异。3)3)目的产物在初始物料中的含量低目的产物在初始物料中的含量低。青霉素青霉素（4.2%4.2%）、庆大霉素（）、庆大霉素（0.2%0.2%）、干扰素）、干扰素（50ug/ml50ug/ml）。）。4)产品价格与产物浓度呈反比产品价格与产物浓度呈反比原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分离过程成本越大。5)5)初始物料成分复杂初始物料成分复杂,常需多个步骤常需多个步骤,产品总收率低。产品总收率低。除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代除少量产物外，还有大量的
13、细胞及碎片、其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。6)6)生物活性物质的稳定性低。易变质、易失生物活性物质的稳定性低。易变质、易失活、易变性，对温度、活、易变性，对温度、pHpH值、重金属离子、值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。7)7)产品的质量要求高，尤其是药品等。成品产品的质量要求高，尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原青霉素对其强致敏原-青霉噻唑蛋白必青霉噻唑蛋白必须控制须控制RIARIA值（放射免疫测定）小于值（放射免疫测定）小于100100（1.5*10-61.5*10-6）
14、，蛋白类药物（杂质），蛋白类药物（杂质 2%2%）、重组胰岛素中杂蛋白小于）、重组胰岛素中杂蛋白小于0.01%0.01%。四、生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作四、生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作 20世纪世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了很多年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了很多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类：新概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类：（1）固液分离技术）固液分离技术 （2）细胞破碎技术）细胞破碎技术 （3）初步分离纯化技术）初步分离纯化技术 （4）高度分离纯化技术）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术
15、）其他新型分离技术近近20年来，将在污水处理、化学工程和选矿工程上广泛使用年来，将在污水处理、化学工程和选矿工程上广泛使用的絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬的絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵液的分离性能，加之纤维素助滤浮物絮凝技术，改善了发酵液的分离性能，加之纤维素助滤剂的开发，大大提高了发酵液的固液分离效率。在固液分离剂的开发，大大提高了发酵液的固液分离效率。在固液分离机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机、连续半连续板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜机、连续半
16、连续板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜可高效分离细微的悬浮粒子。可高效分离细微的悬浮粒子。（1）固液分离技术）固液分离技术 （2）细胞破碎技术）细胞破碎技术 （3）初步分离纯化技术）初步分离纯化技术 （4）高度分离纯化技术）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术）其他新型分离技术已开发出球磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学已开发出球磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术。该技术的成熟使得胞内生物物质的大规模工业化破碎等技术。该技术的成熟使得胞内生物物质的大规模工业化生产成为可能。生产成为可能。（1）固液分离技术）固液分离技术 （2）细胞破碎技术）细胞破碎技术 （3
17、）初步分离纯化技术）初步分离纯化技术 （4）高度分离纯化技术）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术）其他新型分离技术主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离，为进一步纯术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离，为进一步纯化精制创造了前提；超滤技术解决了生物大分子对化精制创造了前提；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓有机溶剂、金属离
18、子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。（1）固液分离技术）固液分离技术 （2）细胞破碎技术）细胞破碎技术 （3）初步分离纯化技术）初步分离纯化技术 （4）高度分离纯化技术）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术）其他新型分离技术小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。20世纪世纪70年代以来，逐渐开发出各种色谱（层析）技术，如年代以来，逐渐开发出各种色谱（层析）技
19、术，如亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱、离子交换色谱和凝胶色谱亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等，后两种技术已开始用于批量生产。等，后两种技术已开始用于批量生产。（1）固液分离技术）固液分离技术 （2）细胞破碎技术）细胞破碎技术 （3）初步分离纯化技术）初步分离纯化技术 （4）高度分离纯化技术）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术）其他新型分离技术超临界超临界CO2萃取技术在获得天然生物物质方面有着独特的萃取技术在获得天然生物物质方面有着独特的优势。优势。20世纪世纪80年代以来，已经在许多领域中迅速实现了工年代以来，已经在许多领域中迅速实现了工业化。如啤酒花中有效成分和咖啡
20、豆中咖啡因的萃取分离。业化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取分离。介于反渗透和超滤之间的纳米滤（介于反渗透和超滤之间的纳米滤（Nanofiltration）技术，）技术，由于其能使水和大部分无机盐通过而截留分子量由于其能使水和大部分无机盐通过而截留分子量300-1000u的小分子有机物，且操作压力低，在生物工业和水处理中具的小分子有机物，且操作压力低，在生物工业和水处理中具有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技术及反胶团技术有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技术及反胶团技术的研究和应用开发等也相继取得了很大的进展。的研究和应用开发等也相继取得了很大的进展。五、生物技术下游加工过程的五
21、、生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作一般流程和单元操作1)培养液（发酵液）的预处理和固液分离；培养液（发酵液）的预处理和固液分离；2)初步纯化（提取）；初步纯化（提取）；3)高度纯化（精制）；高度纯化（精制）；4)成品加工。成品加工。1.一般下游加工过程可分为一般下游加工过程可分为4个阶段个阶段2.下下游游加加工工过过程程的的一一般般流流程程（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液发酵液初步纯化初步纯化细胞碎片分离细胞碎片分离细胞破碎细胞破碎细胞分离细胞分离高度纯化高度纯化成品加工成品加工预处理预处理胞胞外外产产物物（加热、调（加热、调pH、絮凝）、絮凝）（
22、过滤、离心分离、膜分离（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（匀浆、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）胞胞外外产产物物提取提取精制精制产产品品的的收收得得率率和和质质量量控控制制。下游工艺过程决定于产品的性质和要求达到的纯度下游工艺过程决定于产品的性质和要求达到的纯度n如产品为菌体本身，则工艺比较简单，只需经过滤、得到菌如产品为菌体本身，则工艺比较简单，只需经过滤、得到菌体，再经干燥就可，如单细胞蛋白的生产。体
23、，再经干燥就可，如单细胞蛋白的生产。n如可以从发酵液直接提取，则可省去固液分离步骤。如可以从发酵液直接提取，则可省去固液分离步骤。n如为胞外产物则可省去细胞破碎步骤。如为胞外产物则可省去细胞破碎步骤。六、六、纯化方法选择的基本原则纯化方法选择的基本原则1)1)尽可能简单、低耗、高效、快速。尽可能简单、低耗、高效、快速。2)2)分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高。A)A)分离步骤越多，回收率越低；分离步骤越多，回收率越低；如如Y Y1010=0.95=0.951010=0.63=0.63，Y Y5 5=0.95=0.955 5=0.77=0.77B)B)分分离离
24、步步骤骤多多，设设备备投投入入大大，人人员员物物资资消消耗耗大大，生产周期长生产周期长 九、九、目标蛋白质的表征和分析方法目标蛋白质的表征和分析方法n 蛋白质在分离、纯化过程个易发生变化，因此得到的产蛋白质在分离、纯化过程个易发生变化，因此得到的产品应与已知标准品对照，证明为同一物质并检查其纯度。品应与已知标准品对照，证明为同一物质并检查其纯度。为达此目的，常需用几种方法。为达此目的，常需用几种方法。1 1、HPLC HPLC选用基于个同原理的两种层析系统选用基于个同原理的两种层析系统(如反相层析和如反相层析和离子交换层析离子交换层析)，如只得到单个对称峰则表明纯度较高；，如只得到单个对称峰则
25、表明纯度较高；1 1）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳(PALE)(PALE)和等电聚焦；和等电聚焦；2 2）顺序分列）顺序分列NN端和端和C C端顺序分析可用来表征蛋白质：端顺序分析可用来表征蛋白质：3 3）其他分析，如氨基酸分析、肽图、免疫化学分析等可进）其他分析，如氨基酸分析、肽图、免疫化学分析等可进一步提供产品纯度达到均质一步提供产品纯度达到均质(homogeneity)(homogeneity)和标准品一致和标准品一致的证明。的证明。适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后，适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后，适应面更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。适
26、应面更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世，结晶理各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世，结晶理论和离子交换技术的新进展，提高了产品的收率、质量论和离子交换技术的新进展，提高了产品的收率、质量和生产效率。和生产效率。十、生物工业下游技术的发展动态十、生物工业下游技术的发展动态成本成本、质量质量、环保环保将是该技术发展方向和动力将是该技术发展方向和动力1.传统分离技术的提高和完善传统分离技术的提高和完善1）新型分离介质的研究开发）新型分离介质的研究开发 2）子代分离技术）子代分离技术3）其他新兴下游技术）其他新兴下游技术 2.新技术的研究开发新技术的研究
27、开发膜（膜材料和膜制造工艺）、树脂（离子交换树脂和大网格树脂）和凝胶膜（膜材料和膜制造工艺）、树脂（离子交换树脂和大网格树脂）和凝胶（琼脂糖凝胶为基质，与各种配基结合后制成各种色谱分离介质）是目前（琼脂糖凝胶为基质，与各种配基结合后制成各种色谱分离介质）是目前主要的新型分离介质。主要的新型分离介质。各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成子代分离技术。如膜技术和各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成子代分离技术。如膜技术和萃取、蒸馏、蒸发技术相结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏及渗透蒸发技术；萃取、蒸馏、蒸发技术相结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏及渗透蒸发技术；色谱技术与离子交换技术等结合形成了离
28、子交换色谱、等电聚焦色谱等。色谱技术与离子交换技术等结合形成了离子交换色谱、等电聚焦色谱等。由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业分离技术，如双水相萃取、超临界由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业分离技术，如双水相萃取、超临界COCO2 2萃取、反胶团萃取（细胞碎片去除、细胞胞内物质、酶及蛋白质、天然生物萃取、反胶团萃取（细胞碎片去除、细胞胞内物质、酶及蛋白质、天然生物物质的提取分离）；菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济物质的提取分离）；菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济地分离菌体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。地分离菌体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。本章要求本章要求n熟悉下游加工过程的重要性和特点熟悉下游加工过程的重要性和特点n了解下游加工技术的发展过程了解下游加工技术的发展过程n掌握下游加工过程的主要步骤和主要单元掌握下游加工过程的主要步骤和主要单元操作操作