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1、学科名称兽医学河南省高校青年骨干教师考核报告项目名称：伪狂犬病毒（PRV）全基因组敲除文库构建 及功能验证起止时间：2017年1月 至 2019年12月培养对象姓名：褚贝贝专业技术职务:教授学 校：河南农业大学填表日期： 2020-11 -26河南省教育厅制2、代表性著作、论文(请注明著作以论文名称、出版单位或发表刊物名称、期号、出版或发表时间、所有著、作者姓 名以及作者排序等)Lei Zeng, Meng-Di Wang, Sheng-Li Ming, Guo-Li Li, Peng-Wei Yu, Yan-Li Qia, Da-Wei Jiang, Guo-Yu Yang*, Jiang
2、Wang*, Bei-Bei Chu*. An effective inactivant based on singlet oxygen-mediated lipid oxidation implicates a new paradigm for broad-spectrum antivirals. 2020, Redox Biology; 8;36:1016011. Jiang Wang, Chun-Feng Wang, Sheng-Li Ming, Guo-Li Li, Lei Zeng, Meng-Di Wang, Bing-Qian Su, Guoyu Yang*, Bei-Bei C
3、hu*.Porcine IFITM1 is a host restriction factor that inhibits pseudorabies virus infection. 2019, International Journal of Biological Macromolecules. 2019, International Journal of Biological Macromolecules; 151:1181-1193.2. Jiang Wang, Jiao-Yang Liu, Ke-Yu Shao, Ying-Qian Han, Guo-Li Li, Sheng-Li M
4、ing, Bing-Qian Su, Yong-Kun Du, Zhong-Hu Liu, Gai-Ping Zhang, Guo-Yu Yang*, Bei-Bei Chu*. PRRSV activates lipophagy to facilitate viral replication through down-regulation of NDRG1 expression. 2019, Journal of Virology, 13;93(17)Ying-Qian Han, Sheng-Li Ming, Hong-Tao Wu, Lei Zeng, Gen Ba, Jian Li, W
5、ei-Fei Lu, Jie Han, Qia-Jun Du, Miao-Miao Sun, Guo-Yu Yang*, Jiang Wane*, Bei-Bei Chu*. Myostatin Knockout Induces Apoptosis in Human Cervical Cancer cells via Elevated Reactive Oxygen Species Generation.2018, Redox Biology, 19:412-423. Jiang Wang, Shao-Fang Lu, Bo Wan, Sheng-Li Ming, Guo-Li Li, Bin
6、g-Qian Su, Jiao-Yang Liu, Yu-Shuang Wei, Guo-Yu Yang , Bei-Bei Chu . Maintenance of Cyclic GMP-AMP Homeostasis by ENPP1 is Involved in Pseudorabies Virus Infection. 2018, Molecular Immunology, 31(95): 56-63Shao-Fang Lu, Ying-Qian Han, Zhen-Zhen Guo, Shuang-Shuang Fan, Li-Qiang Han, Bo Wan, BeiBei Ch
7、u, Guo-Yu Yang, Jiang Wang*. Knockdown of PKM2 reduces lipid synthesis in bovine mammary-gland epithelial MAC-T cells. 2018, Biotechnology Letters, Apr;40(4)4. Jiang Wang, Lei Zeng, Li Zhang, Zhen-Zhen Guo, Shao-Fang Lu, Sheng-Li Ming, Guo-Li Li, Bo Wan, Ke-Gong Tian, Guo-Yu Yang*, Bei-Bei Chu*. Cho
8、lesterol 25-Hydroxylase Acts as a Host Restriction Factor on Pseudorabies Virus Replication. 2017, Journal of General Virology, 98(6): 1467-1476郭珍珍，鲁绍芳，樊爽爽，李国利，韩立强，鲁维飞，王江，陈丽颖，杨国宇七褚贝贝*, 猴源rab基因shRNA文库及其稳定细胞株的构建，中国兽医学报，2018, (03)： 469-475.5. 魏宇双，刘姣扬，韩莹倩，郭珍珍，刘晓贺，巴根，韩立强，王江，褚贝贝*,杨国宇*,猴 源cathepsin基因shRNA文
9、库及其稳定敲减细胞系的构建，畜牧兽医学报，2018, (06)： 1282-1290.四、资助项目决算表项目金额3万元列出经费使用方向，包括购实实验仪器设备、耗材、图书资料、学术交流等费用。1 .购买DNA胶回收试剂盒等实验试剂9160元；2 .购买细胞培养皿等实验耗材8050元；3 .购买荧光定量试剂盒等实验试剂8600元；4 .购买离心管、移液器枪头等实验耗材4150元。项目总计30,000元，支出29,960元，余额40元。五、考核结论主要内容包括：项目完成情况，在教学水平、科研能力、团队建设、社会服务等方面完成培养计 划情况，今后发展意见建议和努力方向。考核等次意见。褚贝贝在河南省高校
10、青年骨干教师培养期间，利用双sgRNA引导的CRISPR/Cas9技术对伪 狂犬病毒(PRV)的流行毒株PRV-1201进行改造，与传统技术相比，其基因敲除效率更高，更 易实现PRV基因大片段的缺失及外源基因的插入。完成了项目规定的工作目标及任务。在教学方面她承担了本科分子生物学和研究生生物化学与分子生物学进展等核心课 程讲授任务，年度教学考评均为良好。被评为2018年度河南农业大学“优秀教师”和2019年度 河南农业大学“最美教师二在科研方面，共发表论文9篇，其中SCI论文7篇，主持国家自然科学基金青年项目1项, 霍英东教育基金会第十五届高等院校青年教师基金基础性研究课题1项；参与国家自然科
11、学基金 重大项目1项，国家自然科学基金重点专项1项。入选国家第三批万人计划“青年拔尖人才”。在团队建设方面，积极参与国家动物免疫学国际联合研究中心申报工作，还参与制定畜牧兽 医学科十四五发展规划。根据实验室的在研项目，梳理团队成员力量，建立了一支家畜病毒感染 机理及防治创新研究团队。在人才培养方面，带领团队青年教师申报国家自然科学基金，1人已 获得国家自然科学基金青年项目资助。指导硕士研究生6人，博士研究生2人，并协助指导团队 博士生4名，硕士研究生17名。希望褚贝贝老师今后加强社会服务意识，在动物病毒与宿主相互作用领域取得更好的成就。考核专家组长：六、鉴定专家名单姓名职称学科专业领域单位签字
12、七、学校意见校长签名:公 章一、基本情况姓名褚贝贝 性别 女民族汉出生日期1984.12所在单位河南农业大学行政职务专业职务教授研究专长病毒与宿主的相互作用学历研究 生学位博士电子信箱电话研究项目项目名称伪狂犬病毒(PRV)全基因组敲除文库构建及功能验证一级学科兽医学学科门类基础兽医学研究类别41、基础2、应用3、教学类资助金额3万元学校配套金额万元成果形式A.著作B.论文0c.教材结项种类A.正常 B.提前C.延期O获奖情况国家第三批“万人计划”青年拔尖人才主 要 参 加 人姓名单位职称承担任务朱河水河南农业大学副教授效率检测王江河南农业大学副教授载体构建郭珍珍河南农业大学研究生细胞培养曾磊
13、河南农业大学研究生文库构建二、总结报告主要内容：项目预期计划执行情况；成果内容、特色及创新点，主要学术价值和应用价值; 在教学水平、科研能力、团队建设、社会服务等方面的完成情况；不足之处及努力方向。1 .项目预期计划执行情况伪狂犬病(Pseudorabies, PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起的猪、牛 等多种动物感染的病毒性传染病。自2011年以来，在大多数免疫过Bartha-K61的养猪场中 相继分离鉴定出PRV的流行毒株，比较目前PRV流行毒株的基因组序列与之前的PRV基 因组序列，发现了大量的突变，主要包括氨基酸的替换、插入和缺失，说明目前PRV
14、流行 毒株已经发生了较大变异。对我国养猪业造成了巨大的威胁。因此，对PRV变异毒株的研 究已迫在眉睫。图1 rPRV 1201EGFPLuc构建示意图PRV基因组较大，长约150 kb, GC含量高，反向遗传操作困难。所以本研究预期采用 双sgRNA引导的CRISPR/Cas9技术对流行毒株PRV-1201进行改造，通过共转染PRV1201 基因组DNA,双sgRNA CRISPR/Cas9质粒和含PRV同源臂的供体质粒至PK-15细胞，缺 失母源株PRV1201 gl和gE基因的同时，在基因缺失位置插入EGFP和Luciferase双表达系 统(图1),进一步通过细胞荧光噬斑病毒纯化法构建出
15、同时表达EGFP和Luciferase的双报 告病毒rPRV1201-GFP-LuCo预期通过本研究搭建出CRISPR-Cas9技术高效编辑PRV基因组的平台，为后期PRV动物体内示踪研究及抗病毒药物的快速筛选提供有效的技术支持。2 .已取得成果内容2.1 表达EGFP和Luciferase双报告基因重组PRV的构建通过共转染PRV1201基因组DNA,双sgRNACRISPR/Cas9质粒和含PRV同源臂的供体质粒至PK-15细胞，成功缺失了母源株PRV1201的gl和gE基因，并在基因缺失位置插入EGFP和Luciferase双表达系统，获得了表达EGFP和Luciferase双报告基因重
16、组病毒rPRV1201-GFP-Luc （图 2）。英光常光图2已纯化重组病魔2.2 重组病毒EGFP、Luciferase表达和毒价相关性本研究所构建的重组病毒株rPRV1201-GFP-Luc具有EGFP和Luciferase双报告系统， 理论上可以通过荧光蛋白表达、萤火虫荧光素酶活性或毒价中的任一指标对该重组病毒增 殖情况进行标定，为了进一步确定该特性，我们将重组病毒分别以MOI为0.001、0.0k 0.1 和1接种PK-15细胞，接毒后18h,分别记录细胞荧光表达情况（拍照并流式检测），检测 萤火虫荧光素酶活性和此时各接种量细胞病毒毒价。结果显示（图3）,该重组病毒荧光蛋 白表达、萤
17、火虫荧光素酶活性以及毒价均呈正相关，可以用于后期对病毒增殖进行研究。PK-15 18hPK-15 18hMOI荧光流式- 00806040200 1()S1ZJ jo “=so Vesicular stomatitis virus、Porcine reproductive and respiratoiy syndrome virus、Newcastle disease virus 和 influenza virus 多种囊膜病毒的感染。此外，与传 统的福尔马林灭活方法相比，LJ002灭活的伪狂犬病毒在小鼠中能够产生更高的中和抗体水 平，且小鼠能够更强地抵抗伪狂犬病毒的感染。该研究提示102可作
18、为灭活疫苗生产中的新 型灭活剂，这部分工作发表在Redox Biology杂志上。在科研项目方面，主持国家自然科学基金青年项目1项，主持霍英东基金1项；参与 国家自然科学基金项目3项：1项重大项目，1项重点专项，1项青年项目。其中，作为主 要成员参与了张改平院士主持的国家自然科学基金重大项目猪繁殖与呼吸综合征病毒入 侵和持续感染的分子机制。入选国家第三批“万人计划”青年拔尖人才人。5.2 人才培养指导专硕2名，已经毕业，在畜牧兽医学报发表文章；指导学硕1名，2019年毕 业，在Journal of Virology上发表SCI论文，指导学生获得河南省优秀硕士论文，本人获 得河南省优秀硕士论文指
19、导教师；指导2017级学硕1名，专硕1名；2018级学硕1名，专 硕1名；2019级学硕1名，专硕1名；指导博士生2名；协助指导本实验室的博士生4名， 硕士生17名。5.3 团队建设以本人上海生化所博士期间和武汉大学国内访学的研究工作为基础，结合畜牧兽医学 科研究的发展方向，积极参与制定畜牧兽医学科十四五发展规划，着重凝聚了科研方向。 根据实验室的在研项目，梳理团队成员力量，明确任务分工，搭建研究平台，积极参与实 验室的仪器购置和布局规划。目前已经形成一支家畜病毒感染机理及防治研究团队，实现 了人才队伍的汇聚。6 .不足之处和努力方向目前，该项目进展顺利，取得了一定成绩，但后期仍需要投入大量的
20、人力和物力， 如何把该技术平台更好的应用于PRV致病机制研究，乃至从根本上扑灭该病原，是我们今 后的努力方向。培养对象签字:年 月日三、培养期成果一览1、承担主要教学科研项目及获奖、获得专利情况（请注明项目名称、项目来源、项目经费、项目起讫时间、所有项目完成人姓名以及项目完成人 排序等。如成果获得相应科技奖励，请注明授奖单位、奖励名称、级别及日期；如成果获得专利, 请注明获准专利国别、类别及专利号）.项目名称：胞内运输系统在猪繁殖与呼吸综合征病毒生活周期中的功能及分子机制项目来源：国家自然科学基金青年项目项目经费：25.2万元项目起讫时间：所有项目完成人姓名：褚贝贝、张超、汪新建、杜丽丽、韩莹
21、倩本人排序：主持.项目名称：猪繁殖与呼吸综合症病毒生活周期依赖宿主细胞内运输系统的分子机制项目来源：霍英东教育基金会第十五届高等院校青年教师基金基础性研究课题项目经费：14.4万元项目起讫时间：所有项目完成人姓名：褚贝贝、杨国宇、李宏基、王江、张超、郭珍珍本人排序：主持.项目名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵与持续感染的分子机制项目来源：国家自然科学基金重大项目项目经费：600万元项目起讫时间：所有项目完成人姓名：张改平、田克恭、夏平安、梁振普、万博、褚贝贝、赵孟孟、宋亚鹏、 马红芳、侯婕本人排序：第六.项目名称：CRISPR-Cas新型基因敲除载体的构建及功能项目来源：河南农业大学杰出人才项目项目经费：500万元项目起讫时间：所有项目完成人姓名：褚贝贝本人排序：主持.项目名称：国家万人计划青年拔尖人才项目来源：国家万人计划青年拔尖人才项目项目经费：200万元项目起讫时间：2016-2021所有项目完成人姓名：褚贝贝本人排序：主持.项目名称：非洲猪瘟病毒主要免疫原的识别与疫苗靶点发现研究项目来源：国家自然科学基金重点专项项目经费：300万元项目起讫时间:所有项目完成人姓名：张改平、张守涛、褚贝贝、庄国庆、刘燕凯、吴亚楠、蒋大伟、黄庆 瑞、刘红亮、梁超本人排序：第三