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1、学科名称食品科学与工程河南省高校青年骨干教师培养计划培养对象考核报告项目名称：基于差异蛋白质差学的冷冻亚致死金黄色葡萄球菌损伤修复关键蛋白研究起止时间：2016年1月 至 2018年12月培养对象姓名：索标专业技术职务:副教授学 校：河南农业大学填表日期： 2018年11月4日河南省教育厅制河南农业大学高等教育教学改革研究项目，0.5万元，2015.1-2017.12,项目完成人: 索标，汪月霞，艾志录，范会平，谢新华。项目完成人排序：第lo2、代表性著作、论文1请注明著作,论文名称、出版单位或发表刊物名称、期号、出版或发表时间、所有著、作者 姓名以及作者排序等)Biao Suo*, Hua
2、Yang, Yuexia Wang, Haipeng Lv, Zhen Li, Chao Xu, Zhilu Ai*. Comparative proteomic and morphological change analyses of Staphylococcus aureus during resuscitation from prolonged freezing. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 866.第 1.Biao Suo, Huarong Li, Yuexia Wang, Zhen Li, Zhili Pan, Zhilu Ai*. Eff
3、ects of ZnO-nanoparticle-coated packaging film on pork meat quality during cold storage. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2017, 97(7): 2023-2029.第 I.Biao Suo, Yangliu Lu, Yuexia Wang, Xinhua Xie, Chao Xu, Zhilu Ai*. Thermal inactivation kinetics of Salmonella spp. in ground pork suppl
4、emented with cinnamaldehyde. Journal of Food Safety, 2017, 37(3): el 2322.第 1.四、资助项目决算表项目金额2. 4万元列出经费使用方向，包括购实实验仪器设备、耗材、图书资料、学术交流等费用。本项目所资助的2. 4万元经费全部用于支付试验所需试剂及耗材的费用。五、考核结论主要内容包括：项目完成情况，在教学水平、科研能力、团队建设、社会服务等方面完成培 养计划情况，今后发展意见建议和努力方向。考核等次意见。考核专家组长：年 月 日六、鉴定专家名单姓名职称学科专业领域单位签字七、学校意见校长签名:一、基本情况姓名索标性别男民
5、族汉出生日期1982.07所在单位河南农业大学行政职务无专业职务副教授研究专长食品微生物与食品安全学历研究生学位博士电子信箱电话研 究 项 目项目名称基于差异蛋白质组学的冷冻亚致死金黄色葡萄球菌损伤修复关键蛋白研究一级学科食品科学与工程学科门类工学研究类别1、基础42、应用3、教学类资助金额 2.4万元学校配套金额2.4万元成果形式A.著作B.论文q C.教材结项种类A.正常4 B.提前 C.延期获奖情况无要参加人姓名单位职称承担任务艾志录河南农业大学教授项目指导汪月霞河南农业大学副教授生物信息学分析赵雅健河南农业大学硕士研究生细胞形态生理分析卢杨柳河南农业大学硕士研究生蛋白质组分析二、总结报
6、告主要内容：项目预期计划执行情况；成果内容、特色及创新点，主要学术价值和应用价值； 在教学水平、科研能力、团队建设、社会服务等方面的完成情况；不足之处及努力方向。一、项目预期计划执行情况本项目严格按照拟定研究计划进行，未作调整或变动，以经过冷冻处理后 处于亚致死状态的金黄色葡萄球菌为研究对象，采用LC-MS/MS分析技术研究 其损伤修复启动过程中的差异蛋白质组，发掘出冷冻亚致死细胞损伤修复启动 相关的关键蛋白，并探讨其表达调节与细胞生物大分子修复及细胞活性回复之 间的关系，从蛋白表达调控的角度阐明冷冻亚致死金黄色葡萄球菌损伤修复启 动机制，从而为冷冻食品产业建立致病菌高效安全检测及控制技术提供
7、理论依 据。项目按照原计划实施，经费按照规定完成支出，目前已经取得一定的研究 成果，圆满完成了拟定指标，具体如下：拟达到的技术指标和提交成果的 方式实际完成情况完成冷冻亚致死金黄色葡萄球菌 修复过程中的蛋白质组分析研究已完成阐明相关蛋白表达调节与冷冻致 亚致死金黄色葡萄球菌损伤修复 之间的关系已完成在国内外权威核心期刊发表论文 不少于2篇，其中SCI收录论文1 篇已完成，发表SCI 收录论文3篇二、成果内容本项目组采用HPLC-MS蛋白质组分析技术，研究了冷冻致亚致死损伤的金 黄色葡萄球菌在适宜温度下的修复机制，具体成果内容如下：（1）冷冻致亚致死金黄色葡萄球菌损伤修复规律冷冻致亚致死细胞对高
8、盐胁迫（添加10% NaCl的TSAYE培养基）抗性能 力的恢复是细胞回复为正常状态的重要表现（图1A）。（2）冷冻致亚致死金黄色葡萄球菌损伤修复过程中基因转录调节规律实时荧光定量PCR研究结果表明，冷冻致亚致死损伤的细胞修复启动过程 中rnsrR和力“C基因表达量显著下调，而cytB基因表达量显著上调（图1B）。图1.冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复过程中高盐耐受性（A）以及加 力”。和c/4基因转录表达水平的变化（B）。Figure 1. The changes of high salt resistance （A） and msrR,fhuC, and cytB genes tran
9、scriptional expressions （B） of frozen sublethal Staphylococcus aureus cells during resuscitation.represents the total viable cell number determined on TSAYE plate; “represents the non-injured viable cell number determined on TSAYE plate plus 10% NaCl.（3）冷冻致亚致死金黄色葡萄球菌损伤修复过程中的细胞形态及超微结构 分析本项目组前期采用扫描电子显
10、微镜和透射电子显微镜技术，分别研究了 -18处理90 d处于亚致死状态和后培养阶段的金黄色葡萄球菌细胞形态和超 微结构的变化（图2）,研究结果表明，冷冻致亚致死细胞在修复过程中，细胞 膜表面超微结构从光滑透明变得致密结实，核糖体变得浓密，含量增大；胞内 的核酸、蛋白质等物质流出，而细胞膜完整性得以恢复。图2.金黄色葡萄球菌冷冻致亚致死细胞修复培养过程中形态的变化Figure 2. Morphological changes of sublethally damaged S. aureus during resuscitationfrom prolonged freezing. The scan
11、ning electron microscopic images A, D, and G were observedat an instrumental magnification of 10,000x. The transmission electron microscopic images B,E, and H were observed at an instrumental magnification of 30,000x, while C, F, and I wereobserved at an instrumental magnification of 100,000x. (A, B
12、, and C), the exponential-phasecells; (D, E, and F), cells (hal have been stored at -I8 for 90 d; (G H, and I), resuscitated cellscultured in TSBYE at 37 for 2 h.(4)低温致亚致死金黄色葡萄球菌细胞对纳米氧化锌的抗性降低37条件下，纳米氧化锌对金黄色葡萄球菌的生长均表现出良好的抑制作 用，并且随着浓度的增大，抑菌效果增大。同时，本项目首次研究了纳米氧化 锌在4c和-18c条件下的抑菌效果，得到纳米氧化锌与低温对食源性致病菌具 有协同抑
13、制作用，4和-18条件下纳米氧化锌可在120h时完全抑制金黄色葡萄 球菌的生长。本试验采用扫描电镜观察纳米氧化锌处理对金黄色葡萄球菌菌体 形态及内部结构的变化，结果表明，经纳米纳米氧化锌处理后，金黄色葡萄球 菌菌体表面粗糙，细胞壁和细胞膜变模糊，内部结构紊乱，菌体呈透明破裂状。 本研究结果表明，在低温条件下纳米氧化锌可更容易对亚致死金黄色葡萄球菌 细胞的形态和细胞膜产生破损作用，从而抑制细胞的修复(图3)。图3.不同低温条件下纳米ZnO对金黄色葡萄球菌细胞形态的扫描电镜分析结果Figure 3. Scanning electron micrographs of S. aureus follow
14、ing treatments with and without ZnO nanoparticles at different temperatures. Bacterial cells were incubated for 24 h in TSB at 37 (10,000x) (A); TSB plus 2gL of ZnO nanoparticles at 37 (10,00()x) (B); TSB at 4 (lO.OOOx) (C); and TSB plus 2 g L _* of ZnO nanoparticles at 4 (10,000x) (D).(5)冷冻致亚致死金黄色葡
15、萄球菌修复过程中的差异蛋白质组学分析本项目组前期采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术比较分析了冷 冻致亚致死金黄色葡萄球菌细胞在修复过程中的差异蛋白质组表达谱，并在 Uniprot数据库中进行搜索比对，鉴定出了 118个差异表达显著蛋白，其中表达 上调45个，下调73个。差异蛋白的GeneOntology （GO）分析结果表明，冷冻 致SCVs细胞的生长与细胞膜脂肪酸及膜蛋白合成相关蛋白、细胞膜物质转运活 性蛋白、群体感应相关蛋白、氧化还原活性蛋白、核糖体功能调控相关蛋白等 有关（图4）o图4.金黄色葡萄球菌低温致亚致死细胞修复培养过程中比较蛋白质组学分析A. GO分析；B. KE
16、GG代谢通路分析；C. Prolein-Protein互作调控网络分析Figure 4. Comparative proteomic analysis of DEPs between resuscitating and freezingsurvived cells of S. aureus.A. GO enrichment analysis； B. KEGG pathway analysis； C. Protein-Protein interaction networkanalysis.三、特色及创新点（1）采用扫描电镜及透射电镜分析技术，研究了冷冻致亚致死金黄色葡萄 球菌损伤修复过程中细胞形
17、态及超微结构的变化规律，明确了细胞膜的修复是 冷冻致亚致死损伤修复的关键步骤。（2）采用HPLC-MS联用技术比较分析了冷冻致亚致死金黄色葡萄球菌修 复启动过程中的差异蛋白质组，从而通过分析得出了与冷冻致亚致死金黄色葡 萄球菌损伤修复启动相关的关键蛋白。四、主要学术价值和应用价值食品加工及保藏环境中的冷冻胁迫因子虽然能够在冰晶的作用下造成致病 菌失活，但在长期的进化过程中，致病菌能够通过对相关蛋白的表达调控，在 环境胁迫下以亚致死状态存活，待条件适宜后，再通过对关键部位进行修复和 增殖，为食品安全带来严重隐患，这为食品安全控制技术带来新的要求。然而， 目前人们对冷冻致亚致死致病菌的修复机制并不
18、了解，也无法针对性的设计检测与控制技术。本项目以金黄色葡萄球菌为供试菌株，采用蛋白质学技术比较分析得出与冷 冻致亚致死细胞修复相关的基因，并与细胞形态及生理指标相结合，进一步分 析其表达调控与冷冻致亚致死损伤修复之间的关系。研究结果不仅可以从理论 上初步探明冷冻致亚致死金黄色葡萄球菌的损伤修复分子机制，丰富食源性致 病菌“亚致死理论，也可以为冷冻食品产业针对性地设计高效栅栏控制因子提供 新的思路，即通过外加其它针对亚致死致病菌的控制方法，与冷冻胁迫相结合， 抑制亚致死细胞修复或直接使其失活，在尽可能不影响食品品质与风味的前提 下，更温和有效地消除食品中的致病菌。五、在教学水平、科研能力、团队建
19、设、社会服务等方面的完成情况（1）教学水平。本人在项目执行期间，承担本科生食品安全控制、生理学基础以及 Progress in Food Science and Engineering双语课程，以及国内外食品安全 案例辨析等研究生课程的教学工作，年均工作量超过600个。在教学工作中， 注重多种教学方法的灵活运用与创新，获得学生的一致好评。同时，本人也注 重通过教学研究进一步提升个人的教学水平，在项目执行期间，完成河南农业 大学高等教育教学改革研究项目1项（Progress in Food Science and Engineering 双语教学与大学本科生的学习表现，并顺利通过验收。发表教研论
20、文1篇，作 为副主编出版普通高等教育“十三五”规划教材1部食品发酵与酿造。（2）科研能力。本人在项目执行期间，通过对本项目的顺利开展，逐渐积累了丰富的项目申 报与执行经验。在项目执行期内，主持申报成功国家自然科学基金项目1项， 河南省重点研发与推广专项1项以及河南省高等学校重点科研项目1项。同时， 本人也作为重要科研人员参与申报成功了国家重点研发计划项目1项，河南省 重大科技专项1项以及郑州市重大科技专项1项。在这些项目的支持下，本人 也取得了一定的科研成果。近5年来，本人发表论30余篇，其中SCI收录论文 12篇，EI收录论文11篇，其中本项目标注的SCI收录论文3篇。这些均大大 提高了本人
21、的科研能力。（3）团队建设。通过本项目的实施，本人加强了团队意识并提升了团队协作能力。在项目执 行期间，本人作为骨干成员协助团队成功申报了河南省冷链食品工程技术研究 中心（2015年）、农业部大宗粮食加工重点实验室（2016年）2个省部级平台。 目前本团队已具有13名专业技术人员，其中11人具有博士学位，13人具有高 级职称，其中2人具有正高级职称。足以满足大宗粮食加工行业共性关键技术、 新产品开发、设计、中试生产、工程化、服务的需求。（4）社会服务。本人在项目实施期间，积极参与各项社会服务工作，为河南省畜牧局主办的 全国培训班进行食品安全相关培训2次（每次15（）人左右），为可口可乐（郑州、
22、 漂河）进行微生物与食品安全知识培训4次（每次60人左右）。此外，本人也 与三全食品股份有限公司、郑州思念食品有限公司以及郑州多福多食品有限公 司等企业建立了良好的合作关系，并长期为企业提供科研攻关和社会服务工作。六、不足之处及努力方向本人在项目执行期间虽然也取得了一定的科研结果，但这些结果目前仍停 留在实验室研发阶段，如果利用本项目所得出的食源性致病菌冷冻致亚致死修 复机制结果，在食品工业生产中采取合理的措施，抑制致病菌修复或直接使其 失活，即将本项目的研究成果更好地为食品工业健康发展服务，将是本人在今 后阶段的努力方向。培养对象签字:三、培养期成果一览I、承担主要教学科研项目及获奖、获得专
23、利情况（请注明项目名称、项目来源、项目经费、项目起讫时间、所有项目完成人姓名以及项目完成 人排序等。如成果获得相应科技奖励，请注明授奖单位、奖励名称、级别及日期；如成果获得 专利，请注明获准专利国别、类别及专利号）（1） luxS基因在冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复启动中的作用及其调控 机制，国家自然科学基金青年科学基金，21万元，2017.01-2019.12,项目完成人： 索标，李真，徐超，赵雅健，李森，聂文静。项目完成人排序：第1。（2）生鲜面臭氧杀菌及冷链安全控制关键技术研究，河南省重点研发与推广专项， 10万元，2018.01-2019.12,项目完成人：索标，艾志录，黄忠民，汪月霞，李森， 杨华，刘玉莲。项目完成人排序：第1。（3）基于差异蛋白质组学的冷冻致亚致死金黄色葡萄球菌损伤修复启动机制研究， 河南省高等学校重点科研项目，5万元，2017.01-2018.12,项目完成人：索标，艾 志录，李真，李森，聂文静。项目完成人排序：第1。（4）Progress in Food Science and Engineering双语教学与大学本科生的学习表现,