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1、?黑素细胞刺激素在不同动物表皮中的表达 目的初步探讨?黑素细胞刺激素（?melanocyte?stimulatinghormone，?MSH）在不同试验动物表皮中的表达并阐明其意义，为色素障碍性皮肤病动物试验供应新的理论依据。方法对4组不同正常试验动物的表皮标本进行组织切片，应用免疫组织化学技术，视察?MSH在4组不同试验动物表皮中的表达。结果?MSH在白色昆明小鼠毛囊及白色FMN豚鼠表皮中呈阴性表达，在C57BL/6J小黑鼠毛囊黑素细胞及棕黄色HARTLY豚鼠表皮黑素细胞中呈阳性表达。结论白色昆明小鼠及白色FMN豚鼠相宜做色素增加动物试验探讨，C57BL/6J小黑鼠及棕黄色HARTLY豚鼠相
2、宜做色素减退动物试验探讨；?MSH可做为观测色素代谢障碍性疾病动物试验探讨的一个重要指标。 色素代谢障碍性皮肤病是皮肤科一类常见疾病，由于发病机理不详，故尚缺乏有效治疗手段。目前探讨表明，表皮黑素细胞、角朊细胞可因多种因素刺激通过自分泌和旁分泌机制产生?MSH，?MSH通过与黑素细胞表面黑皮素1受体结合而激活环磷酸腺酐/蛋白激酶A途径，使黑素细胞黑素合成及分泌增加1。我们拟采纳免疫组织化学技术，对?MSH在4种常用于探讨色素代谢障碍性皮肤疾病的动物2表皮中的表达进行视察，并判定其意义，以便为该病的动物试验探讨供应新的理论依据。1材料和方法1.1试验材料1.1.1试验动物SPF级雌性昆明种小白鼠
3、12只、C57BL/6J小黑鼠12只(由南方医科高校试验动物中心供应)，体重均为22g3g，12周龄。雌性白色FMN豚鼠、雌雄各半的棕黄色HARTLY豚鼠各12只(由南方医科高校试验动物中心供应)，体重均为300g20g。1.1.2试验试剂SheepAnti?MSHpolyclonalantibody（CHEMICON）；RabbitAnti?SheepIgG（HL）（SouthernBiotech）；DAB显色试剂盒（北京博奥森生物技术公司）；抗体稀释液（北京中山生物技术有限公司）；10%中性甲醛及多聚赖氨酸（北京赛驰生物科技有限公司）；PBS、柠檬酸盐缓冲液（武汉博士生物技术有限公司）。1
4、.1.3试验仪器RM2135型石蜡切片机(LEICA)；XSP?12C型OLYMPUS显微镜(上海长方光学仪器有限公司)；HS恒温恒湿箱(无锡索南亚试验设备有限公司)；可调微量移液仪、湿盒、切片架(北京金辉盛业科技有限公司)。1.2试验方法1.2.1动物处理小白鼠、小黑鼠各12只；雌雄各半的棕黄色豚鼠、雌性白色豚鼠各12只，各组动物预养3d，正常喂养1周后，于第8天上午将各组动物用3%戊巴比妥45mg/Kg腹腔麻醉后，作常规固定，刮除背部皮肤表面毛发，用组织剪剪取2cm2cm大小皮肤数块，10%中性甲醛固定，常规石蜡切片备用。1.2.2免疫组织化学检测链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(S-P
5、)常规染色法：石蜡标本常规4um连续切片。石蜡切片脱蜡，水中绽开；PBS缓冲液冲洗3min3次；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶室温10min；PBS缓冲液冲洗2min3次；枸橼酸盐缓冲液煮沸抗原修复；PBS缓冲液冲洗2min3次；滴加10%正常山羊血清封闭液室温孵育10min后倾去血清；滴加稀释好的SheepAnti?MSHpolyclonalantibody湿盒内室温孵育60min；PBS缓冲液冲洗2min3次；滴加RabbitAnti?SheepIgG（HL）室温孵育10min；PBS缓冲液冲洗2min3次；滴加HRP标记链亲和素室温孵育10min；PBS缓冲液洗2min3次；滴加棕色D
6、AB显色液（现配现用）镜下驾驭显色程度；蒸馏水充分冲洗；苏木素轻度复染23min；自来水冲洗515min；盐酸酒精分化8s；上行酒精脱水、透亮；中性树胶封片。用缓冲液替代第一抗体做阴性比照。用已知阳性切片作为阳性比照。1.2.3显微镜视察200倍下随机选择20个视野视察表皮黑素细胞?MSH阳性细胞，并由JVC彩色摄像头将细胞图像输入Mias系统拍照。1.2.4结果判定?MSH定位于黑素细胞胞浆和细胞外基质3，以显微镜下黑素细胞胞浆或细胞外基质出现棕黄色颗粒状或团块状者为阳性表达。采纳二级记分法推断结果，依据20个视野下阳性细胞数占总细胞数的比例分为4级：小于10%为0分；11%40%为1分；4
7、1%70%为2分；大于71%为3分。依据着色深浅分4级:浅黄色为0分，黄色为1分；棕黄色为2分；深棕色为3分。以上两种分级相加小于2分为阴性(-)，23分为弱阳性(+)，45分为阳性(+)，6分为强阳性(+)。2结果?MSH的表达定位于小鼠毛囊黑素细胞及豚鼠表皮黑素细胞的胞浆或细胞外基质，为黄或棕黄色颗粒，呈局灶性或充满性分布。结果显示，?MSH在白色昆明小鼠毛囊及白色FMN豚鼠表皮中均呈阴性表达，在C57BL/6J小黑鼠毛囊黑素细胞及棕黄色HARTLY豚鼠表皮黑素细胞中均可见阳性表达，镜下在细胞浆成颗粒状或团快状（图1、图2）。?MSH测定结果如表1所示。图1?MSH在小黑鼠毛囊黑素细胞中阳
8、性表达（IHC200）（略）图2?MSH在棕黄色豚鼠表皮黑素细胞中阳性表达（IHC200）（略）表1?MSH在小黑鼠毛囊黑素细胞及棕黄色豚鼠表皮黑素细胞中表达率的比较（略）3探讨色素代谢障碍性疾病主要是皮肤黑素代谢障碍引起的,但目前国内外对该病的探讨多固定于酪氨酸酶表达水平的检测，大多数动物试验也以此为指标，缺乏较深层次的探讨指标。事实上黑素细胞的黑素生成是一困难的过程,有多种因素参加调整。早在20世纪80年头有人发觉在皮肤中存在?MSH4，并且?MSH对鼠毛囊黑素细胞及表皮黑素细胞的调控作用随之证明；Matsumoto5等视察到人体皮片移植到裸鼠身上后，在创面愈合过程中其表皮可检测到?MSH
9、有很强的表达；Dorr6等也报道给自愿者注射合成的强效黑皮素激素Nle4?D?Phe7?MSH，与比照组比较自愿者面部及前臂皮肤色素镇静明显加深，且优黑素合成比率增加；Tsatmali7等亦报道了外周皮肤中存在的?MSH与皮肤色素镇静有关；最近有探讨证明，表皮细胞中黑素细胞能产生和分解阿黑皮素原，生成?黑素细胞刺激素等黑皮素，再与黑皮素1受体结合，激活腺甘酸环化酶，提高细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，进而激活cAMP倚赖蛋白激酶，促进酪氨酸酶的合成及表达，促进黑素细胞有丝分裂，使黑素细胞快速增值，促进黑速合成8。因此?MSH在色素代谢过程中具有重要的调控作用。上述试验中的四种动物目前广泛应用
10、于色素代谢障碍性皮肤疾病的动物试验探讨中，或是建立动物模型，或是用于相关病理、药理等的探讨，文献报道颇多，但却缺乏相应的理论依据及说明。而笔者通过免疫组化方法，证明了?MSH在白色昆明小鼠毛囊及白色FMN豚鼠表皮中呈阴性表达，在C57BL/6J小黑鼠毛囊黑素细胞及棕黄色HARTLY豚鼠表皮黑素细胞中呈阳性表达，且主要分布在细胞浆中。因此以上试验提示我们，以两种小鼠而论，因?MSH仅在其毛囊黑素细胞中可呈阳性表达，故相宜用于仅观测毛囊黑素及?MSH改变状况的试验探讨，而且白色昆明小鼠相宜做皮肤色素增加类型的动物试验，C57BL/6J小黑鼠相宜做皮肤色素减退类型试验；以两种豚鼠而论，因?MSH在毛
11、囊黑素细胞及表皮黑素细胞中均可呈阳性表达，且与人体皮肤较为接近，故相宜用做视察皮肤整体黑素及?MSH改变状况的试验探讨，而且白色FMN豚鼠相宜做皮肤色素增加类型的动物试验，棕黄色HARTLY豚鼠相宜做色素减退型试验。并以此为色素代谢障碍性皮肤疾病动物试验中动物的选择供应肯定的理论依据。同时，本探讨结果表明，?MSH在4种不同种属的正常动物表皮中呈现不同程度的表达，提示我们?MSH可作为一个较酪氨酸酶更为深化的指标，用来观测及探讨动物表皮色素代谢改变，但其详细的作用机制尚有待进一步探讨。总之，随着动物试验探讨的进步以及对?MSH调控黑素合成作用的更进一步了解，必将为解决临床上获得性色素镇静或色素脱失性疾病供应一种新的治疗方法。