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1、工业微生物5.5.微生物的菌种微生物的菌种选育选育理想发酵工业用菌要求1、遗传性状稳定；、遗传性状稳定；2、生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；、生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；3、目标产物的产量尽可能接近理想转化率；、目标产物的产量尽可能接近理想转化率；4、最好是胞外产物；、最好是胞外产物；5、尽可能减少产物类似物的生成；、尽可能减少产物类似物的生成；6、培养基简单、来源广、价格低；、培养基简单、来源广、价格低；7、对、对T、pH、离子强度、剪切力不敏感；、离子强度、剪切力不敏感；8、溶氧要求低、便于培养能耗低；、溶氧要求低、便于培养能耗低；5.1 从自然界中获得新菌种采样采
2、样增殖增殖纯化纯化性能鉴定性能鉴定调查研究，查阅资料调查研究，查阅资料设计试验方案设计试验方案确定样品的生态环境、季节确定样品的生态环境、季节选择和地点选择选择和地点选择采样采样增殖培养增殖培养(1)控制营养成分控制营养成分(2)控制控制pH(3)温度控制温度控制纯种分离纯种分离(1)稀释法稀释法(2)划线法划线法(3)组织分离组织分离原种斜面原种斜面筛选筛选(1)纸片培养显色法纸片培养显色法(2)透明圈法透明圈法(3)变色圈法变色圈法(4)生长圈法生长圈法(5)抑菌圈法抑菌圈法复筛复筛再复筛再复筛35株株性能鉴定性能鉴定发酵发酵pH、T、通风、搅拌、无菌程度、适应性、通风、搅拌、无菌程度、适
3、应性、副产品和对低劣廉价原料的利用副产品和对低劣廉价原料的利用毒性实验毒性实验菌种鉴定菌种鉴定5.2 5.2 基因突变和微生物菌基因突变和微生物菌种选育种选育 一、一、3 3个经典实验个经典实验 （一）（一）经典转化试验经典转化试验 最早进行最早进行转化转化（transformation）实验的是实验的是F.Griffith（1928年）年），他以，他以Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌，旧称肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌肺炎双球菌”）作为研究对象。）作为研究对象。遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础（1 1）动物实验动物实验著名的肺炎球菌转化试验著名的肺炎球菌转化试验
4、S型，致病菌，型，致病菌，具荚膜，菌落表面光滑（具荚膜，菌落表面光滑（smoth）R型，非致病菌，型，非致病菌，无荚膜，菌落表面粗糙（无荚膜，菌落表面粗糙（rough）S型型R型型加热灭菌加热灭菌热死热死S菌活菌活R菌菌（2 2）细菌培养试验细菌培养试验（3 3）S S型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验AveryAvery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验（1 1）从活的）从活的S S菌中抽提各种细胞成分（菌中抽提各种细胞成分（DNADNA，蛋白质，蛋白质，荚膜多糖等）荚膜多糖等）（2 2）对各组分进行转化试验）对各组分进行转化试验只
5、有只有DNADNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNADNA是转化所必需的转化因子是转化所必需的转化因子（二）（二）噬菌体感染实验噬菌体感染实验 1952 1952年，和年，和M.ChaseM.Chase发表了证明发表了证明DNADNA是噬菌体是噬菌体的遗传物质基础的著名实验的遗传物质基础的著名实验 噬菌体感染实验噬菌体感染实验3535S S蛋白质外壳的噬菌体蛋白质外壳的噬菌体3232P PDNADNA核心的噬菌体核心的噬菌体在在DNADNA中存在着包括中存在着包括合成蛋白质外壳在内合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。的整套遗传信息。（三）（三）植物病毒的重建实验植
6、物病毒的重建实验 为了证明核酸是遗传物质，为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（19561956）用含用含RNARNA的的烟草花叶病毒烟草花叶病毒（TMVTMV）进行了著名的进行了著名的植物病毒重建实验植物病毒重建实验。烟草花叶病毒的核酸烟草花叶病毒的核酸抗血清处理，证明杂抗血清处理，证明杂种病毒的蛋白质外壳种病毒的蛋白质外壳来自来自病毒病毒1，而非，而非病病毒毒2杂种病毒的后代的杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现为蛋白质外壳表现为病毒病毒2，而非，而非病毒病毒1遗传物质是核酸（遗传物质是核酸（RNA）而非蛋白质而非蛋白质霍氏车前病毒霍氏车前病毒的蛋白质外壳的蛋白质外壳HRV
7、HMV亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。尚为发现该蛋白内含有核酸。其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠改变折叠状态为状态为PrP sc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。变。二、朊病的发现与思考二、朊病的发现与思考思考思考1）蛋白质是否可以作为遗传物质？）蛋白质是否可以作为遗传物质？prion是生命的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？是生命的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？2）蛋白质折叠与功能
8、的关系，是否存在折叠密码？）蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？DNARNARNA肽链肽链蛋白质蛋白质三、原核微生物的质粒三、原核微生物的质粒 1.1.定义和特点定义和特点质粒：质粒：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。cccDNAcccDNAocDNAocDNAlDNAlDNA另一类质粒的复制与核染色体的复制不同步，另一类质粒的复制与核染色体的复制不同步，在这类细胞中，一般含在这类细胞中，一般含10101515个或更多质粒。个或更多质粒。严紧型复制控制严紧型复制控
9、制（stringent replication control）松弛型复制控制松弛型复制控制（relaxed replication control）质粒的复制与核染色体的复制同步，质粒的复制与核染色体的复制同步，在这类细胞中，一般只含在这类细胞中，一般只含1 12 2个质粒；个质粒；质粒是一种独立存在于细胞内的质粒是一种独立存在于细胞内的复制子复制子（replicon）。通常以共价闭合环状（通常以共价闭合环状（covalently closed circle，简称简称CCC）的超螺旋双链的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；分子存在于细胞中；也发现有线型双链也发现有线型双链DNA质粒和质粒和R
10、NA质粒；质粒；质粒分子的大小范围从质粒分子的大小范围从1kb左右到左右到1000kb；（细菌质粒多在（细菌质粒多在10kb以内）以内）2.2.质粒的分子结构质粒的分子结构t 提取所有胞内提取所有胞内DNA后电镜观察；后电镜观察；t 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；t 对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。如抗药性初步判断。特定的质粒提取方特定的质粒提取方法和后处理使染色法和后处理使染色体和体和RNA均被除掉。均被除掉。3.3.质粒的检测质粒的检测质粒的主要功能质粒的主要功能在某些特殊条件下，质粒有
11、时能赋予宿主细胞以特殊的机能，在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。从而使宿主得到生长优势。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；质粒所编码质粒所编码的功能和赋的功能和赋予宿主的表予宿主的表型效应型效应致育因子致育因子（Fertility factor，F因子）因子）抗性因子抗性因子（Resistance factor，R因子）因子）产细菌素的质粒产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒代谢质粒（Metabolic
12、 plasmid）隐秘质粒隐秘质粒（cryptic plasmid）4.4.质粒的主要类型质粒的主要类型（1）F质粒（质粒（F plasmid）又称又称F因子、致育因子（因子、致育因子（fertility factor）或性）或性因子（因子（sex factor），），其大小约其大小约100kb，为为cccDNA，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。（接合作用）有关的质粒。携带携带F质粒的菌株称为质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），菌株（相当于雄性），无无F质粒的菌株称为质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。菌株（相当于
13、雌性）。（2）R质粒（质粒（R plasmid）包括抗药性和抗重金属二大类。包括抗药性和抗重金属二大类。又称又称R因子因子（R factor）、抗性因子抗性因子（resisitrance plasmid）。含调节含调节DNA复制和拷贝数的基因以及转移基因，复制和拷贝数的基因以及转移基因，相对分子量约相对分子量约11107，具有转移功能；具有转移功能；抗性转移因子抗性转移因子（resistance transfer factor，RTF）抗性决定因子抗性决定因子（r-determinant）大小不很固定，相对分子量从几百万至大小不很固定，相对分子量从几百万至11108以上，以上，无转移功能，含各
14、种抗性基因，如抗青霉素、氨苄青无转移功能，含各种抗性基因，如抗青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。R质粒一般由两个相连的质粒一般由两个相连的DNA片段组成片段组成由由RTFRTF和和r r决定子结合而形成决定子结合而形成R R质粒的过程：质粒的过程：抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。的重要原因之一。R100质粒（质粒（89kb）可使宿主对下列可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：药物及重金属具有抗性：汞（汞（mercuric ion，mer）四环素（四环素（tetracyc
15、line，tet）链霉素（链霉素（Streptomycin,Str）、）、磺胺（磺胺（Sulfonamide,Su）、）、氯霉素（氯霉素（Chlorampenicol,Cm）夫西地酸（夫西地酸（fusidic acid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。在于抗性质粒上。R质粒的种类很多，质粒的种类很多，例如，例如，R1（94kb）和和R100（89.3kb）等。等。（3）Col质粒（质粒（colicin plasmid，col plasmid）又称又称大肠杆菌素质粒大肠杆菌素质粒或或产大肠杆菌素产大肠杆菌素因子因子（colicinogeni
16、c factor，col factor）。细菌素细菌素（bacteriocin）是质粒编码的蛋白质，一般是质粒编码的蛋白质，一般由细菌产生，可抑制或杀死其他近缘细菌或同种不由细菌产生，可抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株的代谢产物，但不具有很广的杀菌谱。同菌株的代谢产物，但不具有很广的杀菌谱。细菌素结构基因、细菌素结构基因、涉及细菌素运输及发挥作用（涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质的基因、的蛋白质的基因、赋予宿主对该细菌素具有赋予宿主对该细菌素具有“免疫力免疫力”的相关产物的基因的相关产物的基因一般都位于质粒或转座子上，一般都位于质粒或转座子上，细菌素可以杀死同种但不
17、携带该质粒的菌株。细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），大肠杆菌素），而质粒被称为而质粒被称为Col质粒。质粒。Col E1Col E1质粒：质粒：相对分子量小（相对分子量小（9kb，约约5106），），无接合作无接合作用，是松弛性控制、多拷贝的；用，是松弛性控制、多拷贝的；ColbColb质粒：质粒：相对分子量大（相对分子量大（94kb，约约8107），），具有通具有通过接合而转移的功能，属严紧型控制，只有过接合而转移的功能，
18、属严紧型控制，只有12个拷贝。个拷贝。（4）Ti质粒（质粒（tumor inducing plasmid）即即诱癌质粒诱癌质粒或或冠瘿质粒冠瘿质粒（crown gall plasmid）。Ti质粒是一种质粒是一种200kb的环状质粒，包括的环状质粒，包括毒性区（毒性区（vir）、接接合转移（合转移（con）、复制起始区（复制起始区（ori）和和T-DNAT-DNA区区4 4部分。部分。T-DNAT-DNA区可携带任何外源基因整合到植物基因组中，区可携带任何外源基因整合到植物基因组中，TiTi质粒是植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体。质粒是植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体。Ag
19、robacterium tumefaciens（根癌土壤杆菌或根癌土壤杆菌或根癌农杆菌）释放出的根癌农杆菌）释放出的TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA片断与植片断与植物细胞的核基因组整合，合成冠瘿碱类物细胞的核基因组整合，合成冠瘿碱类（opines）,破坏控制细胞分裂的激素调节系统，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，使之变成癌细胞。使之变成癌细胞。（5）Ri质粒（质粒（root inducing plasmid）250kb的的Ri质粒中的一段质粒中的一段T-DNAT-DNA整合到整合到宿主根部宿主根部细胞细胞的核基因组中，可发生转化。的核基因组中，可发生转化。Agrobacterium
20、 rhizogenes（发根土壤杆菌或发根土壤杆菌或发根农杆菌）可侵染双子叶植物的根部，并诱发发根农杆菌）可侵染双子叶植物的根部，并诱发大量称为毛状根的不定根。大量称为毛状根的不定根。RiRi质粒是外源基因的良好载体！质粒是外源基因的良好载体！（6）mega质粒（质粒（megaplasmid）即即巨大质粒巨大质粒，其相对分子量，其相对分子量比一般质粒大几比一般质粒大几十倍至几百倍，存在于十倍至几百倍，存在于Rhizobium（根瘤菌属）中，根瘤菌属）中，其上有一系列与共生固氮相关的基因。其上有一系列与共生固氮相关的基因。（7）降解质粒）降解质粒 这类质粒是由降解一系列复杂有机物的酶编码，这类质
21、粒是由降解一系列复杂有机物的酶编码，所以在污水处理、环境保护等方面发挥作用。所以在污水处理、环境保护等方面发挥作用。只在假单胞菌属（只在假单胞菌属（Pseudomonas）中发现降解质粒。中发现降解质粒。降解质粒以其所分解的底物命名，降解质粒以其所分解的底物命名，例如，例如，CAM（樟脑）质粒，樟脑）质粒，OCT（辛烷）质粒，辛烷）质粒，XYL（二甲苯）质粒，二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒，萘）质粒，TOL（甲苯）质粒等甲苯）质粒等“超级菌超级菌”通过遗传工程手段构建具有数种降解质粒的菌株，通过遗传工程手段构建具有数种降解质粒的菌株，具有广谱降解能力的工程菌。具有广谱降解能力的工程菌。