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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流微生物菌种选育实验指导.精品文档.微生物菌种选育实验是一门涉及食品理化分析、微生物学实验且由学生自行设计实验方案的综合性、设计性实验课程，集中三周时间开课。一、实验目的通过本环节训练，加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；学会常规选种方法；掌握微生物诱变育种的方法；掌握常规工业微生物菌种保藏法；树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。二、实验内容实验一 工业微生物菌种分离根据一定的生产目的如产酶、产酸、产酯等，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如曲药、酸乳、土壤中筛选出高产适宜的菌株。1、分离培养基的配制2、无菌器材的准备3、菌悬液的制备
2、4、接种5、培养6、初步鉴定(1) 菌落形态(2) 个体形态7、斜面接种培养实验二 工业微生物菌种复筛通过摇瓶培养对实验一所得的菌株的生产性能进行精确的定量测定。1、发酵培养基的配制；2、目的菌株的摇瓶培养；3、发酵液的生理活性测定。实验三 微生物的诱变育种用紫外线对实验一所得的高产菌株进行诱变，并测定诱变后的菌株的生产能力。1、单细胞(或单孢子)悬液的制备；2、致死曲线的测定；3、诱变处理；4、初筛；5、复筛；6、菌种保藏。三、实验要求1学生自行设计具体实验方案，在教师指导下由学生自主完成实验。2实验结束后，要求学生完成一篇微型小论文。论文的撰写应本着实事求是的原则，对所做实验过程和数据进行
3、认真、严格的记录和处理，并进行独立分析，不得抄袭他人的数据。四、考核办法1、考核内容：实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等。2、考核办法：按照实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等内容综合考核学生，得到学生该门实验课程的成绩。成绩考核采用优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分制。3、考核标准：以实际操作技能和分析解决问题的技能为主，实验考核内容各单项所占分数比例为实验方案20%、实验态度10%、操作技能40%、实验报告30%。微生物菌种选育概述微生物的菌种对进行微生物工作来讲是非常重要的。没有“种”无法进行微生物的科学研究；没有良种，不能进行发酵工业的生产。所以微生物的很多工作都是围绕着
4、个“种”字而进行的。菌种选育包括选种和育种两方面的内容。选种是根据微生物的特性，挑选出符合需要的菌种，一方面可以根据有关信息向菌种保藏机构、工厂或科研单位直接索取；另一方面根据所需菌种的形态、生理、生态和工艺特点的要求，采用各种分离筛选方法，从自然界特定的生态环境中以特定的方法分离出新菌株。其次是育种的工作，根据菌种的遗传特点，在已有的菌种基础上，采用诱变或杂交等方法，迫使菌种发生变异，改良菌株的生产性能，使产品产量、质量不断提高。第三当菌种的性能下降时，还要设法使它复壮。最后还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合，这样菌种的优良性能才能充分发挥。第一节 工业微生物的分离筛选菌株分离、筛
5、选虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤（见图）。一、采样（一）从土壤中采样土壤样品往往是首选的采集目标：土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方；从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤。土壤中微生物分布规律：一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌(108)放线菌(107)霉菌(106
6、)酵母菌(105)藻类(104)原生动物(103)，其中放线菌和霉菌指其孢子数。在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品：因为各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。1、土壤有机质含量和通气状况(1) 耕作土、菜园土和近郊土壤适合于细菌、放线菌生长。(2) 山坡上的森林土适合霉菌、酵母菌生长繁殖。(3) 采土样最好的土层是525cm。2、土壤酸碱度和植被状况土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤(pH7.0一7.5)环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤(pH7.0以下)环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。3
7、、地理条件4、季节条件秋季采土样最为理想。5、采样方法用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取525cm处的土样1025g，装人事先推备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10一30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取34g撤到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。（二）根据微生物生理特点采样1、根据微生物营养类型每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。微生物的营养需
8、求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长；在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所，容易分离到产生淀粉酶、糖化酶的菌株。若要筛选以糖质为原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。在筛选果胶酶产生菌时，由于柑橘、草莓及山查等果蔬中合有效多的果胶，因此，从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这
9、种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的结果。2、根据微生物的生理特性筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样。因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压，如从海中筛到一株水活微球菌，它能在600个大气压下生长。分离耐高渗透压酵母菌时，由于其偏爱糖分高、酸性的环境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。二、富集培养一般情况下，采来的样品可以直接进行分离，但是如果样品中我们所需要的菌类含量并不很多，而另一些微生物却大量存在。此时，为了
10、容易分离到所需要的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，即设法增加所要菌种的数量，以增加分离的几率。可以通过选择性的配制培养基（如营养成分、添加抑制剂等），选择一定的培养条件（如培养温度、培养基酸碱度等）来控制。富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。（一）控制培养基的营养成分在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于
11、不能分解这些物质，生长受到抑制。（二）控制培养条件在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱(pH7.0一7.5)，霉菌和酵母菌要求偏酸(pH4.56.0)。因此，富集培养基的pH调节到被分离微生物要求范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。分离放线菌时，可将样品液在40恒温预处理20min，有利于孢子的萌发，可以较大地增加放线菌数目，达到富集的目的。（三）抑制不需要的菌类1、分离细菌时，在培养基中加入浓度为50uml制霉菌素，可以抑制霉菌和酵母菌的
12、生长。2、分离放线菌时，在样品中加入0.05十二烷基磺酸钠(SDS)不仅可以抑制细菌的生长，还能激活放线菌孢子的萌发。加入氟派酸(5mg/L)+制霉菌素(50 mg/L)+青霉素(0.8mg/L)也可以有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的生长。3、分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素和四环素各30Uml，可以抑制细菌和放线菌生长。4、分离根霉和毛霉时，由于这些微生物的菌丝易蔓延成片，难以得到纯化的菌落，通常在培养基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨酸防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密。三、纯种分离经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并
13、未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。（一）稀释涂布法把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取一定量的某一稀释度的悬浮液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。土壤样品的稀释程度，要看样品中的含菌数多少，一般有机质含量高的菜园土等、样品中含菌量大，稀释倍数高些，反之稀释倍数低些。采用该方法，在平板培养基上得到单菌落的机会较大，特别适合于分离易蔓延的微生物。（二）划线分离法用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌路移入斜面培养基上，培养后备用。该分离
14、方法操作简便、快捷，效果较好。（三）利用平皿的生化反应进行分离这是一类利用特殊的分离培养基对大量混杂微牛物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。1、透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。(1) 分离水解酶产生菌该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选样性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。(2) 分离产
15、生有机酸的菌株在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板成混浊状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以轻易地鉴别出来。2、变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。3、生长圈法生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围使会形成一个混浊的生长圈。4、抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选。抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采
16、用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，使会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。采用该方法已得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。（四）通过控制营养和培养条件进行分离各种微生物对营养要求和培养条件是不同的，在分离筛选时，若在这两个方面加以调节控制，就能获得更好的分离效果。四、代谢产物鉴别在目的菌株分离的基础上，进一步通过筛选，选择具有目的产物合成能力相对高的菌株。某些产生菌在分离时就可结合筛选，一般在平皿上通过与指示剂、显色剂或底物等的生化反应直接定性分离，这种方法本身就包含筛选内容的一部分。但并非所有产生菌都能应用平皿定性方法进行分离，而
17、是需要经过常规生产性能测定，即初筛和复筛方能确定。另外，即使已经通过平皿定性反应分离的菌株也需要进一步筛选和更加精确的定量测定。（一）初筛初筛是从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物的微生物筛选出来的过程。出于菌株多，工作量大，为了提高初筛的效率，通常需要设计一种快速、简便又较为准确的筛选方法。初筛要求筛选的菌株尽可能的多，筛选的菌株越多，就约有希望筛选到所需要的菌株。初筛可以分为两种情况进行：1、平板筛选对那些在纯化分离阶段没有采用平皿定性法挑选比来的菌落，即随机挑选的菌株，由于数量很大，又不知是否具有目的产物的生产能力，这时只能首先采取较粗放的检测方法，如平皿快速检测法。2、摇瓶发酵筛选
18、由于摇瓶振荡培养法更接近于发酵罐培养的条件，效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广；因此，经过平板定性筛选的菌种可以进行摇瓶培养。一般一个菌株接一个瓶，在一定转速的摇瓶机上及适宜的温度下振荡培养，得到的发酵液过滤后按以下方法进行活性测定：先取玻璃板16cm x 26cm或18cm x 28皿，制备含有鉴定曲(测定抗生家)或底物(两制剂)等的平板。琼脂板厚约3mm，用内径5mm钢圈打孔，取以上过滤后的发酵液10ul逐个加入，放在鉴定菌或酶作用最适温度下温育一定时间，孔的周围出现透明的溶菌圈或水解圈。根据活性圈的大小决定取舍。用该法初步测定发酵液的产物活性时，为避免活性圈较大造成的误差，可用滤纸片
19、代替。在灭过菌的圆滤纸片上调入l一2ul发酵液，温育后测定。苦水解圈仍过大，则可采取稀释发酵液或增加底物浓度或琼脂板厚度的方法，使活性圈的大小有所控制。初筛一株一瓶，取其中10-20%复筛，一株3瓶，直至最后3-5株，广泛考察。（二）复筛琼脂平板活性测定法，其最大的优点就是简便、快速，因而在筛选工作量大时具有相当的优越件。该法的不足之处是产物活性只能相对比较，难以得到确切的产量水平，只适用于初筛。通过该法可淘汰85一90不符合要求的微生物，剩下较好的菌株则需进行摇瓶培养复筛；这时一个菌株通常要重复35个瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定。具体做法：把所有摇瓶复筛菌株的发酵液，用琼脂平板法测
20、定一遍(同步重复23块板)，将其中活性圈大而清晰的菌株发酵液进一步采用精确检测法测定，选出较优良的菌株23株。这种直接从自然界样品中分离出来具有一定生产性能的菌株，称为野生型菌株。第二节 诱变育种工业微生物育种过程分为三个阶段：菌种基因型改变；筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型的变异株；产量评估，全面考察此变异株在工业化生产上的接受性。简言之，工业微生物育种就是经由改变和操纵微生物的基因，进而选育出适合工业化生产的菌种的一种综合技术。从自然界直接分离的菌种，一般而言其发酵活力往往是比较低的，不能达到工业生产的要求，因此要根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。一、诱变育种的作用1、提高
21、有效产物的产量2、改善菌种特性、提高产品质量3、简化工艺条件4、开发新品种二、诱变育种的试验设计和准备工作诱变育种工作包括诱发突变、突变株的筛选和高产变株最佳环境条件的调整。诱发突变包括出发菌株、诱变剂及其剂量的选择、影响诱变效果的因素。突变株的筛选包括筛选条件(培养基和培养条件)及选择一个简便、快速、有效的筛选方法。环境条件调整是突变株的最佳培养条件改变。以上是决定诱变育种成败的三个方面，在育种开展之前，根据试验目的紧紧围绕三个环节制订试验方案。（一）了解影响菌种生长发育的主要因素主要影响有如下几个方面：1、培养基2、培养基斜面制备技术3、移种的密度4、温度5、湿度（二）了解菌株的菌落形态霉
22、菌、放线菌的菌落形态特征包括：菌落大小、形状、高度、放射线多少、外观组织结构(粉状、绒毛状、絮状等)、孢子多少和色泽、可溶性色素情况等。细菌菌落形态特征包括：菌落大小、形状、边缘结构、高度、颜色、光泽、黏性、表面结构、可溶性色素等。（三）了解菌种特性及其与生产性能的关系1、多方面考查菌种的生活史，了解它们的形态、生理、生化等生物学特性，以及这些特性与代谢产物合成的关系。2、研究菌种的某些生物学特性与产量合成相关性。3、了解菌种的最佳培养基和培养条件(包括斜面培养基及一、二级发酵培养基)。（四）建立一个准确、简便、快速检测产物的方法由于诱发突变频率极低，需要从相当数量的诱变分离菌株中筛选，才有可
23、能移得较理想的突变株。限制筛选量的主要因素，除了摇瓶量之外，检测方法也是重要因素，所以建立一个适应于大规模筛选的有效的检测方法是十分必要的。（五）研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件一个优良菌种的获得往往要花费巨大的人力、物力和时间，是非常不容易的，不能随便采用某个培养基、培养条件和保藏方法进行培养和保藏。否则，容易发生回复突变，使菌种特性衰退，优良特性消失，结果将前功尽弃。因此，事先研究一个最佳的培养基、培养条件和适宜的保藏方法是相当重要的。三、诱变育种的步骤与方法基本步骤：原种 （出发菌株） 纯化斜面同步培养离心洗涤振荡打散过滤菌悬液诱变处理 平板分离 斜面 斜面 斜面 保藏及扩大试验（活菌
24、计数） （计数） （变异率）（初筛） （复筛） （再复筛）（一）出发菌株的选择用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株。在诱变育种中，出发菌株的选择，会直接影响到最后的诱变效果，因此必须对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了解，挑选出对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。1、对出发菌株的要求生长快，营养要求粗放，发育早，产孢子多，对诱变剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。2、出发菌株的选择(1) 选取自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异；(2) 选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较
25、好的诱变效果；(3) 选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高。另外，出发菌株还可以同时选取23株，在处理比较后，将更适合的菌株留着继续诱变。（二）出发菌株的纯化1、目的：获得遗传性状基本一致的，并且稳定的变种。2、原因：遗传背景复杂的菌种诱变后负变率将增加；诱变史长的菌株，采用强烈诱变剂处理，又不进行纯化分离，诱变效果差的。3、纯种分离方法：常用划线分离法和稀释分离法。（三）同步培养（前培养）1、目的：获得生理状态一致的培养物。在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，这称为同步培养。2、原因：突
26、变率高，重现性也好。3、方法：(1) 细菌一般要求培养至对数生长期；(2) 霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体。（四）单细胞(或单孢子)悬液的制备1、目的获得单细胞(或单孢子) 、均匀的悬液。2、原因在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。这是因为，一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象发生。另一方面又可避免长出不纯菌落。3、方法(1) 菌龄：对数期细胞、刚成熟的孢子或活化的孢子(2) 菌悬液浓度：一般真菌孢子或酵母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、放线菌或细菌的浓度为108个mL左右
27、。菌悬液的孢子或细菌数可用平板计数、血球计数器计数和光密度计数。(3) 菌悬液的配制方法： 离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min，令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。（五）诱变处理1、诱变剂种类的选择常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。常用的物理诱变剂有紫外线、x射线、射线(如Co60等)、等离子、快中子、射线、射线、超声波等。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。物理诱变剂中最常用的有紫外线。(1) 根据诱变剂对基因作用的特异性选择(2) 根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱
28、变剂(3) 参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂2、最适诱变剂量的选择(1) 诱变剂剂量的表示方式各种诱变剂有不同的剂量表示方式：1) UV的剂量指强度与作用时间的乘积。2) 化学诱变剂常以在一定外界条件下诱变剂的浓度和作用时间的乘积来表示。3) 在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂的相对剂量。(2) 最适诱变剂量的确定1) 确定依据诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比例。2) 确定方法通过比较剂量存活率曲线和剂量诱变率曲线，找到某诱变剂的剂量存活率诱变率三者的最佳结合点，即为诱变剂的最适剂量。 剂量存活率曲线以诱变剂的剂量为横坐标，以细胞存活率的对数值为纵坐标绘制
29、的曲线。 剂量诱变率曲线以诱变剂的剂量为横坐标，以诱变后获得的突变细胞数为纵坐标绘制的曲线。一般以诱变后微生物的致死率在90%99.9%的剂量为最佳剂量，近来也有倾向于采用杀菌率70%75%甚至更低(30%70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。3) 紫外诱变的方法 将10mL菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10min左右。
30、为准确起见，照射前紫外灯应先预热2030min，然后再进行处理。不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。 设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。 实验中避免光复活现象。实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛
31、选。3、诱变剂的处理方式诱变剂的处理方式，可分为单因子处理和复合因子处理。(1) 单因子处理采用单一诱变剂处理出发菌株。(2) 复合因子处理指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。（六）后培养对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程，即细胞内原酶有量的稀释过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。据此应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
32、（七）突变株的分离与筛选突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条件决定选育的方向，因为突变体高产性能总是在一定的培养条件下才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的特定条件下可以筛选到具有新性状的菌株，其他原养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是决定菌种某些持性保留或淘汰的“筛子”。为了有效地选出突变株，必须采用使新个体表型得以充分表达的筛选条件。1、筛选方案：在实际工作中，一般认为应采用把筛选过程分为初筛与复筛两个阶段的筛选方案为好。前者以量(选留菌株的数量)为主，后者以质(测定数据的精确度)为主。2、筛选方法(1) 随机筛选也称摇瓶筛选。该法主要是随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选。具
33、体做法是：将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一支斜面，然后一个斜面的菌体接入只锥形三角瓶、放置在摇瓶机上振荡培养，根据测定产物活性的高低，决定取舍。这种筛选法的优点是：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条件如何，都与发酵罐大生产条件相近，可以模拟进行。摇瓶中的通气量可以通过调整转速、装量和瓶内加档板等方法加以控制。在突变概率小的情况下，如果菌落挑取少了，很难筛选到理想的突变株。根据瑟芝帝工作法，高产菌株概率愈低筛选菌落数量就越大，如果突变频率为1、那么初筛挑选菌落起码要200个。(2) 平板菌落预筛平板菌落筛选，是在培养皿或特制玻璃框平板上进行的，是用于诱变后
34、从试样小检出突变体的一种琼脂平板筛选法。实际上是摇瓶初筛前的一种预筛，应该说是初筛的部分。通过预筛可以淘汰那些低产菌株。平板筛选技术种类很多，有的是根据菌落形态淘汰低产菌株，有的则利用每个菌落产生的代谢产物与培养基中检定菌、底物或指示性物质作用后，在其周围形成抑菌圈、呈色圈或其他特异性反应圈，通过测量反应圈白径与菌落直径之比值，来衡量突变株的产量高低。常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。3、摇瓶液体培养常规随机筛选的全过程，都要通过摇瓶培养，而平板菌落筛选是经过平板菌落预筛后，弃去大量低产菌株，被挑选的菌落移入试管斜面，然后再进行摇瓶液体培养，才能逐步地筛选出高产菌株。4、产
35、物活性别定活性测定是菌种筛选工作的重要组成部分，也是决定筛选效率的主要因素。根据一般突变规律，一个出发菌株通过一次诱发突变，生产能力提高5的变株约150，而生产能力提高10以上的变株仅在1/300左右。由此可见，初筛的菌株越多，优良菌株漏筛的概率越少。扩大筛选量，是提高育种效率很重要的一个方面。通常诱变一代至少要挑选1000株以上，经平皿预筛后，约保留200株进行摇瓶初筛，这时产物活性测定的工作量还是相当大的。(1)琼脂平板空洞法该法是在特制的玻璃框琼脂平板上进行的，以检验菌或底物与一定量的琼脂制成平板，用专制的打孔器取出琼脂块，在留下的圆孔中加入发酵液，或用圆滤纸片浸透发酵液直接覆于琼脂平板
36、上，在适合温度下培养一定时间，测量圆孔或滤纸片周围形成的抑菌圈或水解圈，根据活性团的大小挑选高产菌株。(2) 纸片法随着诱变代数的增加，有效产物浓度不断提高，当发酵液中产物浓度相当高时，活性圈大小与产物浓度之间失去线性关系，掩盖了菌株的高产性能而被漏筛。此时可改用纸片法。具体做法是：取直径05cm圆纸片，灭菌后覆于含底物或检菌的琼脂板上，准确取发酵液12uL在滤纸片上，置于定温度下培养20-25h，测量水解圈大小。如果活性圈仍然很大(直径15mm以上)，则可将发酵液稀释，或者增加底物的浓度和琼脂板的厚度，使水解圈控制在一定范围内。5、摇瓶数据的调整和有关菌株特性的观察分析摇瓶发酵液的测试数据是
37、否准确直接关系到高产菌株筛选频率。一个菌株产量的检测总会存在两种误差，一种是摇瓶培养条件变化影响遗传特性的表达，另一种是检测过程中的误差。虽然严格地控制摇瓶和检测中试验条件，可以使试验误差减少，但无法完全避免。比如，要完成大量菌株的摇瓶培养，在一台摇瓶机上要进行多批试验或同时使用多台摇瓶机试验，在这种情况厂，不同的批次或不同的摇床都会造成系统误差，致使数据之间处于不可比的状态。所以，对摇瓶发酵液的测试数据要尽量应用生物学统计方法来处理，以便从复杂的差异中，去伪存真，由此及被，抓住本质，找出其中真正的规律性。在分离、筛选的整个试验过程中，每个阶段都要周密地观察菌株特性，诱变后分离在平板上的菌落生
38、长情况，如生长快慢、菌落形态、大小、颜色等，要一一详细记录。菌落移入试管斜面后的生长情况、接入到摇瓶种子和发酵培养基后，其培养过程中的糖、氮利用、生长速度、PH变化、颜色、强度等，都要及时观察，结合镜检、测定产物活性，进行详细记录。然后综合菌落的形态特征、培养特征及生化特征作为初筛时挑选菌落的依据。另外还要对筛选过程中摇瓶产量数据的分布作全面分析，以便帮助判断诱变剂、诱变剂量及筛选条件的选择是否恰当。如果菌株在初筛时产量数据分布具有明显差异，说明诱变剂、剂量和筛选条件是可行的，若几乎所有菌株都与出发菌株相差无几，则要考虑重新调节和更换诱变剂或筛选条件。摇瓶复筛是经过初筛得到的较优良菌株进一步复证，考察其产量性状的稳定性，从中再淘汰一部分不稳定的、相对产量低的或某些遗传性状不良的菌株。6、培养基和培养条件的调整利用单因子法、正交实验法、均匀设计、响应面法等方法进行培养基和培养条件的优化，以充分发挥高产菌株的高产性能。（八）菌种保藏