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1、LOGOHPLCHPLC仪使用要点仪使用要点主讲人主讲人主讲人主讲人 唐辉唐辉唐辉唐辉石河子大学药学院石河子大学药学院2022/11/271HPLC的环境设置：HPLCHPLC的日常操作条件：温度：的日常操作条件：温度：的日常操作条件：温度：的日常操作条件：温度：10103030；相对；相对；相对；相对湿度湿度湿度湿度8080；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。高振动设备，有良好的通风设施。高振动设备，有良好的通风设施。高振动设备，有良好的通风设施。2HPLC用水
2、来源：vv1 1 专门的纯水机或超纯水机；专门的纯水机或超纯水机；专门的纯水机或超纯水机；专门的纯水机或超纯水机；vv2 2 去离子水重蒸；去离子水重蒸；去离子水重蒸；去离子水重蒸；vv3 3 二次或三次重蒸水；二次或三次重蒸水；二次或三次重蒸水；二次或三次重蒸水；vv4 4 采用类似家用的纯水机；采用类似家用的纯水机；采用类似家用的纯水机；采用类似家用的纯水机；vv5 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；vv6 6 其它途径；其它途径；其它途径；其它途径；不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质不管采用何种途
3、径，配制流动相应用新鲜水，水质不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。越高放置时间越短。越高放置时间越短。越高放置时间越短。理想的理想的理想的理想的HPLCHPLC用水应为用水应为用水应为用水应为18.218.2的超纯水，并通过的超纯水，并通过的超纯水，并通过的超纯水，并通过0.22 0.22 mm的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。3HPLC六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器是高效液相色
4、谱系统中最理想的进样六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫器，它是由圆形密封垫器，它是由圆形密封垫器，它是由圆形密封垫(转子转子转子转子)和固定底座和固定底座和固定底座和固定底座(定子定子定子定子)组成。组成。组成。组成。美国美国美国美国RheodyneRheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大公司的六通阀进样器最为通用，各大公司的六通阀进样器最为通用，各大公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLCHPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。仪器制造商均以此产品作为仪器的进样
5、器。仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。手柄位进样手柄位进样手柄位进样手柄位进样(Load)Load)位置时，样品经微量进样针从进位置时，样品经微量进样针从进位置时，样品经微量进样针从进位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；排出；排出；排出；将手柄转动至进样将手柄转动至进样将手柄转动至进样将手柄转动至进样(Inject)Inject)位置时，阀与液相流路位置时，阀与液相
6、流路位置时，阀与液相流路位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。相分析柱进行分析。相分析柱进行分析。相分析柱进行分析。4vv六六六六通通通通阀阀阀阀进进进进样样样样器器器器虽虽虽虽结结结结构构构构简简简简单单单单、使使使使用用用用方方方方便便便便、寿寿寿寿命命命命长长长长、日日日日常常常常无无无无需需需需维维维维修修修修等等等等特特特特点点点点，但但但但正正正正确确确确使使使使用用用用和和和和维维维维护护护
7、护将将将将能能能能增增增增加加加加使使使使用用用用寿寿寿寿命命命命，保保保保护护护护周周周周边边边边设设设设备备备备，同同同同时时时时增增增增加加加加分分分分析析析析准准准准确确确确度度度度。如如如如使使使使用用用用得得得得当当当当的的的的话话话话，六通阀进样器一般可连续进样六通阀进样器一般可连续进样六通阀进样器一般可连续进样六通阀进样器一般可连续进样3 3万次而无需维修。万次而无需维修。万次而无需维修。万次而无需维修。vv手柄处于手柄处于手柄处于手柄处于LoadLoad和和和和InjectInject之间时，由于暂时堵住了流路，之间时，由于暂时堵住了流路，之间时，由于暂时堵住了流路，之间时，
8、由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLCHPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针
9、头外侧紧贴进样器密封管内侧，头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。了针头刺坏密封组件及定子。了针头刺坏密封组件及定子。了针头刺坏密封组件及定子。HPLC六通阀进样器的使用及保养5六六六六通通通通阀阀阀阀进进进进样样样样器器器器的的的的进进进进样样样样方方方方式式式式有有有有部
10、部部部分分分分装装装装液液液液法法法法和和和和完完完完全全全全装装装装液液液液法法法法。使使使使用用用用部部部部分分分分装装装装液液液液法法法法进进进进样样样样时时时时，进进进进样样样样量量量量最最最最多多多多为为为为定定定定量量量量环环环环体体体体积积积积的的的的7575，如如如如2020ll的的的的定定定定量量量量环环环环最最最最多多多多进进进进样样样样1515ll的的的的样样样样品品品品，并并并并且且且且要要要要求求求求每每每每次次次次进进进进样样样样体体体体积积积积准准准准确确确确、相相相相同同同同；使使使使用用用用完完完完全全全全装装装装液液液液法法法法进进进进样样样样时时时时，进进
11、进进样样样样量量量量最最最最少少少少为为为为定定定定量量量量环环环环体体体体积积积积的的的的3 3至至至至5 5倍倍倍倍，即即即即2020ll的的的的定定定定量量量量环环环环最最最最少少少少进进进进样样样样6060至至至至100100ll的的的的样样样样品品品品，这这这这样样样样才才才才能能能能完完完完全全全全置置置置换换换换样样样样品品品品定定定定量量量量环环环环内内内内残残残残留留留留的的的的溶溶溶溶液液液液，达达达达到到到到所所所所要要要要求求求求的的的的精精精精密密密密度度度度及及及及重重重重现现现现性性性性。推推推推荐荐荐荐采采采采用用用用100100ll的的的的平平平平头头头头进进
12、进进样样样样针针针针配配配配合合合合2020ll满环进样。满环进样。满环进样。满环进样。可可可可根根根根据据据据进进进进样样样样体体体体积积积积的的的的需需需需要要要要自自自自已已已已制制制制作作作作定定定定量量量量环环环环，一一一一般般般般不不不不要要要要求求求求精精精精确确确确计计计计算算算算定定定定量量量量环环环环的的的的体体体体积积积积，譬譬譬譬如如如如，一一一一根根根根名名名名义义义义上上上上1010ll的的的的定定定定量量量量环环环环，实实实实际际际际是是是是9 9ll还还还还是是是是1 1llll并并并并不不不不重重重重要要要要，因因因因为为为为被被被被测测测测样样样样品品品品和
13、和和和校校校校正正正正样样样样品品品品的的的的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。六通阀进样方式6v进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用质，样品溶液均要用质，样品溶液均要用质，样品溶液均要用0.450.45mm的滤膜过滤。防止微的滤膜过滤。防止微的滤膜过滤。防止微的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对
14、进样阀的磨损。粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。v为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进
15、样阀的LoadLoad和和和和InjectInject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。器针头的外侧。器针头的外侧。器针头的外侧。进样样品要求进样样品要求7泵的保养泵的保养vv用流动相要清洁，过滤流动相和溶剂；用高质量试剂用流动相要清洁，过滤流动相和溶剂；用高质量试剂用流动相要清洁，过滤流动相和溶剂；用高质量试剂用流动相要清洁，过滤流动相和溶剂；用高质量试剂和和和和HPLCHPLC级溶剂；级溶剂；级溶剂；级溶剂；vv进液处的砂芯过滤头要经常清洗；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；进液
16、处的砂芯过滤头要经常清洗；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；vv流动相交换时要防止沉淀；流动相交换时要防止沉淀；流动相交换时要防止沉淀；流动相交换时要防止沉淀；vv定期更换垫圈，需要时加润滑油定期更换垫圈，需要时加润滑油定期更换垫圈，需要时加润滑油定期更换垫圈，需要时加润滑油vv脱气，避免泵内堵塞或有气泡；脱气，避免泵内堵塞或有气泡；脱气，避免泵内堵塞或有气泡；脱气，避免泵内堵塞或有气泡；vv每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；不让水或腐蚀性溶
17、剂滞留泵中，从泵中洗去叉污染；不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中，从泵中洗去叉污染；不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中，从泵中洗去叉污染；不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中，从泵中洗去缓冲液。缓冲液。缓冲液。缓冲液。8vv柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；vv当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；vv要注意流动相的脱气；要注意流动相的
18、脱气；要注意流动相的脱气；要注意流动相的脱气；vv避免使用高粘度的溶剂作为流动相；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；vv进样样品要提纯；进样样品要提纯；进样样品要提纯；进样样品要提纯；vv严格控制进样量；严格控制进样量；严格控制进样量；严格控制进样量；vv每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；vv每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；每
19、天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；vv若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。柱的保养柱的保养9LOGO紫外灯的保养紫外灯的保养v在分析前、柱平衡得差不多在分析前、柱平衡得差不多在分析前、柱平衡得差不多在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完时，打开检测器；在分析完时，打开检测器；在分析完时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。成后，马上关闭检测器。成后，马上关闭检测器。成后
20、，马上关闭检测器。v样品池要保养。样品池要保养。样品池要保养。样品池要保养。2022/11/2710液相色谱常见问题及处理办法关于保留时间漂移问题：关于保留时间漂移问题：1.1.温度控制不好，解决方法是采用恒温装置；温度控制不好，解决方法是采用恒温装置；温度控制不好，解决方法是采用恒温装置；温度控制不好，解决方法是采用恒温装置；2.2.流动相发生变化，解决办法是防止其发生蒸发、反应等流动相发生变化，解决办法是防止其发生蒸发、反应等流动相发生变化，解决办法是防止其发生蒸发、反应等流动相发生变化，解决办法是防止其发生蒸发、反应等 3.3.柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡柱子未平衡好，需对柱
21、子进行更长时间的平衡柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡 关于保留时间发生快速变化关于保留时间发生快速变化 ：1.1.流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之稳定流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之稳定流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之稳定流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之稳定 2.2.泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。3.3.流流流流动动动动相相相相不不不不合合合合适适适适，解解解解决决决决办办办办法
22、法法法为为为为改改改改换换换换流流流流动动动动相相相相或或或或使使使使流流流流动动动动相相相相在在在在控控控控制室内进行适当混合制室内进行适当混合制室内进行适当混合制室内进行适当混合 111.1.拆去保护预柱，看柱压是否还高；拆去保护预柱，看柱压是否还高；拆去保护预柱，看柱压是否还高；拆去保护预柱，看柱压是否还高；2.2.把把把把色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱从从从从仪仪仪仪器器器器上上上上取取取取下下下下，看看看看压压压压力力力力是是是是否否否否下下下下降降降降，否否否否则则则则是是是是管管管管路路路路堵塞，需清洗；堵塞，需清洗；堵塞，需清洗；堵塞，需清洗；3.3.将将将将柱柱柱柱子子子子的的的的
23、进进进进出出出出口口口口反反反反接接接接在在在在仪仪仪仪器器器器上上上上，用用用用1010倍倍倍倍柱柱柱柱体体体体积积积积的的的的流流流流动动动动相相相相冲冲冲冲洗，此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池；洗，此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池；洗，此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池；洗，此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池；4.4.更更更更换换换换柱柱柱柱子子子子入入入入口口口口筛筛筛筛板板板板，若若若若柱柱柱柱压压压压下下下下降降降降，说说说说明明明明您您您您的的的的溶溶溶溶剂剂剂剂或或或或样样样样品品品品含含含含有有有有颗颗颗颗粒粒粒粒杂杂杂杂质质质质，正正正正
24、是是是是这这这这些些些些杂杂杂杂质质质质将将将将筛筛筛筛板板板板堵堵堵堵塞塞塞塞引引引引起起起起压压压压力力力力上上上上升升升升。若柱压还高，请与厂商联系。若柱压还高，请与厂商联系。若柱压还高，请与厂商联系。若柱压还高，请与厂商联系。一一一一般般般般情情情情况况况况下下下下，在在在在进进进进样样样样器器器器与与与与保保保保护护护护柱柱柱柱之之之之间间间间接接接接一一一一个个个个在在在在线线线线过过过过滤滤滤滤器器器器便便便便可可可可避避避避免免免免柱柱柱柱压压压压过过过过高高高高的的的的问问问问题题题题，SGESGE提提提提供供供供的的的的RheodyneRheodyne 73157315型过
25、滤器就是解决这一问题的最佳选择。型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。柱压过高，为什么？柱压过高，为什么？121.1.泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；溶剂进行脱气处理；溶剂进行脱气处理；溶剂进行脱气处理；2.2.比例阀失效，更换比例阀即可；比例阀失效，更换比例阀即可；比例阀失效，更换比例阀即可；比例阀失效，更换比例阀即可；3.3.泵密封垫损坏，更换密封垫即可；泵密封垫损坏，更换密封
26、垫即可；泵密封垫损坏，更换密封垫即可；泵密封垫损坏，更换密封垫即可；4.4.溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；要时改变脱气方法；要时改变脱气方法；要时改变脱气方法；5.5.系统检漏，找出漏点，密封即可；系统检漏，找出漏点，密封即可；系统检漏，找出漏点，密封即可；系统检漏，找出漏点，密封即可；6.6.梯度洗脱，这时压力波动是正常的。梯度洗脱，这时压力波动是正常的。梯度洗脱，这时压力波动是正常的。梯度洗脱，这时压力波动是正常的。柱压不稳定，原因何在？柱压不
27、稳定，原因何在？13色谱峰出现拖尾或双峰的原因是什么？色谱峰出现拖尾或双峰的原因是什么？1.1.筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。替换筛板或更换柱子。替换筛板或更换柱子。替换筛板或更换柱子。2.2.存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子。换流动相或更换选择性好的柱子。换流动相或更换选择性好的柱子
28、。换流动相或更换选择性好的柱子。14因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODSODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与填料表面硅醇基的浓度不同。正是
29、这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的同牌号的同牌号的同牌号的ODSODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺（中加入少量竞争物，如三乙基胺（中加入少量竞争物，如三乙基胺（中加入少量竞争物，如三乙基胺（TEATEA），），），），将会使硅醇基将会使硅醇基将会使硅醇基将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。时间具有较好的重现性。时间具有较好的重现性。时间具有较好的重现性。不同牌号不同牌号ODS柱保留时间不能重现，为什么？柱保留时间不能重现，为什么？15