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1、实训五培养基的制备与灭菌 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、实验目的一、实验目的 1.1.学会一般培养基的制备原理、方法。学会一般培养基的制备原理、方法。2.2.掌握培养基及器皿的灭菌方法。掌握培养基及器皿的灭菌方法。培养基是根据微生物生长繁殖的营养需要，培养基是根据微生物生长繁殖的营养需要，用人工方法配制而成的基质用人工方法配制而成的基质,其中含有水、碳源、其中含有水、碳源、氮源、无机盐及各种生长因子。培养基可为微生氮源、无机盐及各种生长因子。培
2、养基可为微生物的生长提供能源、组成菌体的原料，调节代谢物的生长提供能源、组成菌体的原料，调节代谢活动。活动。二、实验原理二、实验原理 不同微生物对营养物质的要求各不相同。不同微生物对营养物质的要求各不相同。因此，配制培养基要根据微生物的营养特点。因此，配制培养基要根据微生物的营养特点。一般，培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，一般，培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基基(或麦芽糖、蛋白胨培养基或麦芽糖、蛋白胨培养基)。二、实验原理二、实验原理 培养基
3、除了要满足微生物生长所要求的培养基除了要满足微生物生长所要求的各种营养物质外，还应保证微生物所需要的各种营养物质外，还应保证微生物所需要的其他生活条件，如适宜的酸碱度，渗透压等，其他生活条件，如适宜的酸碱度，渗透压等，因此，根据不同种类微生物的要求，应将培因此，根据不同种类微生物的要求，应将培养基调节到一定的养基调节到一定的pHpH范围，如细菌培养基中范围，如细菌培养基中性偏碱，放线菌培养基偏碱，霉菌、酵母菌性偏碱，放线菌培养基偏碱，霉菌、酵母菌培养基偏酸。培养基偏酸。二、实验原理二、实验原理 根据研究的不同，可以将培养基制成固体、根据研究的不同，可以将培养基制成固体、半固体和液体三种形式，固
4、体培养基的成分半固体和液体三种形式，固体培养基的成分与液体培养基相同，仅在液体培养基中加入与液体培养基相同，仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物，通常加入凝固剂作支持物，通常加入1.51.52.02.0的琼的琼脂，半固体培养基加入脂，半固体培养基加入0.30.30.50.5琼脂作支琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶作为凝固剂。持物，有时也可用明胶或硅胶作为凝固剂。二、实验原理二、实验原理 1.1.材料材料 马铃薯、蔗糖、牛肉膏、蛋白胨、马铃薯、蔗糖、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、琼脂、可溶性淀粉、琼脂、K K2 2HP0HP04 4、MgS0MgS04 47H7H2 2O O、FeS0FeS04
5、47H7H2 20 0、NaOHNaOH、HClHCl。2.2.用具用具 试管、三角烧瓶、漏斗、量筒、吸试管、三角烧瓶、漏斗、量筒、吸管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、pHpH试纸、铁试纸、铁架台、漏斗架、止水夹、电炉、台秤、硫酸纸、架台、漏斗架、止水夹、电炉、台秤、硫酸纸、药匙、牛皮纸、线绳、标签纸、剪刀、解剖刀、药匙、牛皮纸、线绳、标签纸、剪刀、解剖刀、镊子、白瓷盘、镊子、白瓷盘、(比色盘比色盘)铁丝筐。铁丝筐。三、实验材料和用具三、实验材料和用具 1.1.培养基的制作方法培养基的制作方法 (1)(1)称量称量 按照培养基的配方，准确称取各成分按照培养基的配方，准
6、确称取各成分于烧杯中。于烧杯中。(2)(2)溶解、加热溶解、加热 向上述烧杯中加入所需要水量，向上述烧杯中加入所需要水量，搅动，然后加热使其溶解。用马铃薯、豆芽等配制搅动，然后加热使其溶解。用马铃薯、豆芽等配制的培养基，须先将马铃薯或豆芽按其配方的浓度加的培养基，须先将马铃薯或豆芽按其配方的浓度加热煮沸热煮沸0.5h(0.5h(马铃薯须先削皮马铃薯须先削皮)并用纱布过滤，然并用纱布过滤，然后加入其他成分继续加热使其溶化，补足水量，如后加入其他成分继续加热使其溶化，补足水量，如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉加热煮融，再加果配方中含有淀粉，则需先将淀粉加热煮融，再加人其他药品，并补足水量。人其他药
7、品，并补足水量。四、实验方法四、实验方法 (3)(3)(3)(3)调节调节调节调节pHpHpHpH值值值值 初制备好的培养基往往不能符合所初制备好的培养基往往不能符合所初制备好的培养基往往不能符合所初制备好的培养基往往不能符合所要求的要求的要求的要求的pHpHpHpH值，故需用酸度计，值，故需用酸度计，值，故需用酸度计，值，故需用酸度计，pHpHpHpH试纸或用氢离子浓试纸或用氢离子浓试纸或用氢离子浓试纸或用氢离子浓度比色计来矫正，用度比色计来矫正，用度比色计来矫正，用度比色计来矫正，用0.1mol/L NaOH0.1mol/L NaOH0.1mol/L NaOH0.1mol/L NaOH或或
8、或或lmol/L HCllmol/L HCllmol/L HCllmol/L HCl调调调调至合适的范围。至合适的范围。至合适的范围。至合适的范围。(4)(4)(4)(4)过滤过滤过滤过滤 用滤纸或双层纱布用滤纸或双层纱布用滤纸或双层纱布用滤纸或双层纱布(中间夹一层脱脂棉花中间夹一层脱脂棉花中间夹一层脱脂棉花中间夹一层脱脂棉花)趁热过滤。趁热过滤。趁热过滤。趁热过滤。(5)(5)(5)(5)分装分装分装分装 根据不同的需要，可将制好的培养基分根据不同的需要，可将制好的培养基分根据不同的需要，可将制好的培养基分根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管或三角烧瓶内，管装入试管或三角烧瓶内，管装入
9、试管或三角烧瓶内，管装入试管或三角烧瓶内，管(瓶瓶瓶瓶)口塞上棉塞口塞上棉塞口塞上棉塞口塞上棉塞(或硅胶或硅胶或硅胶或硅胶泡沫塞泡沫塞泡沫塞泡沫塞)，用牛皮纸包扎管，用牛皮纸包扎管，用牛皮纸包扎管，用牛皮纸包扎管(瓶瓶瓶瓶)口。口。口。口。四、实验方法四、实验方法 培养基的分装培养基的分装 液体培养基：分装高度以试管高度的液体培养基：分装高度以试管高度的液体培养基：分装高度以试管高度的液体培养基：分装高度以试管高度的1/41/41/41/4左右为左右为左右为左右为宜。宜。宜。宜。固体培养基：分装试管，每管装液量为管高的固体培养基：分装试管，每管装液量为管高的固体培养基：分装试管，每管装液量为管
10、高的固体培养基：分装试管，每管装液量为管高的1/51/51/51/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过1/21/21/21/2为宜；倒平板的培养基每管装为宜；倒平板的培养基每管装为宜；倒平板的培养基每管装为宜；倒平板的培养基每管装1515151520mL20mL20mL20mL。半固体培养基：分装试管一般以管高度半固体培养基：分装试管一般以管高度半固体培养基：分装试管一般以管高度半固体培养基：分装试管一般以管高度1/31/31/31/3为宜，为宜，为宜，为宜，灭
11、菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂灭菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂灭菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂灭菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂。四、实验方法四、实验方法 斜面的摆法斜面的摆法(6)(6)灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基0.1MPa0.1MPa，20-30min20-30min，含糖培养基为，含糖培养基为，含糖培养基为，含糖培养基为0.05MPa0.05MPa，30min30min。四、实验方法四、实验方法 （一）根据配制培养基的步骤（一）根据配制培养基的步骤,按下列培按下列培养基配方
12、配制培养基。养基配方配制培养基。1.1.肉膏蛋白培养基肉膏蛋白培养基(W/V)(W/V)(培养细菌用培养细菌用)牛肉膏牛肉膏 0.3g 0.3g 琼脂琼脂 2.0g2.0g 蛋白胨蛋白胨 1.0g 1.0g 蒸馏水蒸馏水 100ML100ML NaCl 0.5g pH 7.2-7.4 NaCl 0.5g pH 7.2-7.4五、实验内容五、实验内容 2.2.马铃薯马铃薯(PDA)(PDA)培养基培养基(W/V)(W/V)(培养霉菌用培养霉菌用)马铃薯马铃薯 20g 20g 蒸馏水蒸馏水 100mL100mL 蔗糖蔗糖 2.0g pH 2.0g pH 自然自然 琼脂琼脂 2.0g2.0g 马铃薯
13、汁制备：将马铃薯去皮，称量所需重马铃薯汁制备：将马铃薯去皮，称量所需重量，切成小块量，切成小块,加水煮沸加水煮沸30min,30min,纱布过滤，补足纱布过滤，补足水量。水量。五、实验内容五、实验内容3 3 3 3.高氏高氏高氏高氏1 1 1 1号号号号(W/V)(W/V)(W/V)(W/V)(培养放线菌用培养放线菌用培养放线菌用培养放线菌用)可溶性淀粉可溶性淀粉可溶性淀粉可溶性淀粉 2.0g FeSO2.0g FeSO2.0g FeSO2.0g FeSO4 4 4 4 0.001g 0.001g 0.001g 0.001g K K K K2 2 2 2HP0HP0HP0HP04 4 4 4
14、0.05g 0.05g 0.05g 0.05g 琼脂琼脂琼脂琼脂 2.0g2.0g2.0g2.0g MgS0 MgS0 MgS0 MgS04 4 4 47H7H7H7H2 2 2 20 0.05g 0 0.05g 0 0.05g 0 0.05g 蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水 100mL100mL100mL100mL KNO KNO KNO KNO3 3 3 3 0.1g pH 7.6-7.8 0.1g pH 7.6-7.8 0.1g pH 7.6-7.8 0.1g pH 7.6-7.8 NaCl 0.05g NaCl 0.05g NaCl 0.05g NaCl 0.05g 五、实验内容五、实验内容
15、 配制时，先用少量蒸馏水将可溶性淀粉调成配制时，先用少量蒸馏水将可溶性淀粉调成配制时，先用少量蒸馏水将可溶性淀粉调成配制时，先用少量蒸馏水将可溶性淀粉调成糊状，在沸水浴中搅拌，煮融，再加入其他成分，糊状，在沸水浴中搅拌，煮融，再加入其他成分，糊状，在沸水浴中搅拌，煮融，再加入其他成分，糊状，在沸水浴中搅拌，煮融，再加入其他成分，补足水量，补足水量，补足水量，补足水量，0.1MPa0.1MPa0.1MPa0.1MPa压力，灭菌压力，灭菌压力，灭菌压力，灭菌20min.20min.20min.20min.1.1.1.1.加热溶化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其加热溶化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或
16、其加热溶化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其加热溶化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其他固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加他固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加他固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加他固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加热过程中所蒸发的水分应补足。热过程中所蒸发的水分应补足。热过程中所蒸发的水分应补足。热过程中所蒸发的水分应补足。2.pH2.pH2.pH2.pH值必须按各种不同培养基的要求准确测定。值必须按各种不同培养基的要求准确测定。值必须按各种不同培养基的要求准确测定。值必须按各种不同培养基的要求准确测定。3.3.3.3.所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质
17、器皿。保证所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿。保证所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿。保证所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿。保证容器外壁无水。容器外壁无水。容器外壁无水。容器外壁无水。（二）培养基制作注意事项（二）培养基制作注意事项五、实验内容五、实验内容4.4.分装培养塞时，注意不得使培养基在瓶分装培养塞时，注意不得使培养基在瓶口或管壁上端沾染，以免引起杂菌污染。口或管壁上端沾染，以免引起杂菌污染。5.5.培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证杀菌效果和培养基的规定进行，以保证杀菌效果和不损失培养基的必要成分，培养基灭菌不损失培养基的必
18、要成分，培养基灭菌后，必须放在后，必须放在3737C C温箱培育温箱培育24h24h无菌生无菌生长方可使用。长方可使用。五、实验内容五、实验内容 棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环。正确的棉塞是形状大小，松紧应与试管要的一环。正确的棉塞是形状大小，松紧应与试管要的一环。正确
19、的棉塞是形状大小，松紧应与试管要的一环。正确的棉塞是形状大小，松紧应与试管(或三角烧瓶或三角烧瓶或三角烧瓶或三角烧瓶)完全适合。过紧时妨碍空气流通，操作完全适合。过紧时妨碍空气流通，操作完全适合。过紧时妨碍空气流通，操作完全适合。过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管(或三角或三角或三角或三角烧瓶烧瓶烧瓶烧瓶)中，达不到过滤杂菌的目的。棉塞过小往往易中，达不到过滤杂菌的目的。棉塞过小往往易中，达不到过滤杂菌的目的。棉塞过小往往易中，达不到过滤杂菌的目的。棉塞
20、过小往往易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有1/31/31/31/3在外，在外，在外，在外，2/32/32/32/3在试管内。在试管内。在试管内。在试管内。（三）（三）棉塞制作棉塞制作五、实验内容五、实验内容 棉塞制作棉塞制作 目前，有条件的实验室已使用目前，有条件的实验室已使用目前，有条件的实验室已使用目前，有条件的实验室已使用.塑料试塑料试塑料试塑料试管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，管帽、金属试管帽、硅胶泡沫
21、塞替代棉塞，此处介绍棉塞的制作，以备不时之需。此处介绍棉塞的制作，以备不时之需。此处介绍棉塞的制作，以备不时之需。此处介绍棉塞的制作，以备不时之需。五、实验内容五、实验内容 1.1.培养基的高压蒸汽灭菌培养基的高压蒸汽灭菌 需灭菌的物品需灭菌的物品(分装在试管、三角烧瓶中的分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基固、液体培养基)，棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮，棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好纸包好(防止锅内水汽把棉塞淋湿防止锅内水汽把棉塞淋湿)，放人灭菌锅，放人灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍内的套筒中。摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。蒸汽流通，影响灭菌效果。（四
22、）灭菌四）灭菌五、实验内容五、实验内容将灭菌锅盖的排气管插入套筒侧壁的凹槽内，将灭菌锅盖的排气管插入套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气约内冷空气，排气约5 510min10min，关闭放气阀。，关闭放气阀。五、实验内容五、实验内容 关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至汽又不断增多，这
23、时压力和温度都上升，当温度升至汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至121121121121 C C C C，压力达，压力达，压力达，压力达0.1MPa0.1MPa0.1MPa0.1MPa时，保持时，保持时，保持时，保持20202020 30min30min30min30min，即达到灭，即达到灭，即达到灭，即达到灭菌目的。菌目的。菌目的。菌目的。灭菌完毕，待压力自然降至灭菌完毕，待压力自然降至灭菌完毕，待压力自然降至灭菌完毕，待压力自然降至“0”0”0”0”时，打开放气时，打开放气时，打开放气时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压
24、致使培养基冲阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。五、实验内容五、实验内容2.2.干热灭菌法干热灭菌法 常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有橡胶或塑常用于空玻璃器皿的
25、灭菌，但凡带有橡胶或塑常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有橡胶或塑常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有橡胶或塑料的物品、液体及固体培养基等，都不能用于干料的物品、液体及固体培养基等，都不能用于干料的物品、液体及固体培养基等，都不能用于干料的物品、液体及固体培养基等，都不能用于干热法灭菌。进行灭菌时，先将要灭菌器皿热法灭菌。进行灭菌时，先将要灭菌器皿热法灭菌。进行灭菌时，先将要灭菌器皿热法灭菌。进行灭菌时，先将要灭菌器皿(培养皿、培养皿、培养皿、培养皿、吸管的包装方法见示范吸管的包装方法见示范吸管的包装方法见示范吸管的包装方法见示范)包好，放入电热烘箱内，包好，放入电热烘箱内，包好，放入电热烘箱内，包好
26、，放入电热烘箱内，调节温度至调节温度至调节温度至调节温度至160160160160170170170170 C C C C，维持，维持，维持，维持1 1 1 12h(2h(2h(2h(当温度升至当温度升至当温度升至当温度升至80808080 C C C C以上切勿打开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂以上切勿打开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂以上切勿打开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂以上切勿打开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂和火灾和火灾和火灾和火灾)。灭菌后，当温度降至。灭菌后，当温度降至。灭菌后，当温度降至。灭菌后，当温度降至3030303040404040 C C C C时，打开时，打开时，打开时，打开箱门，
27、取出灭菌器皿。箱门，取出灭菌器皿。箱门，取出灭菌器皿。箱门，取出灭菌器皿。五、实验内容五、实验内容 1.1.1.1.按教师指定的小组，每一小组制一种培养按教师指定的小组，每一小组制一种培养按教师指定的小组，每一小组制一种培养按教师指定的小组，每一小组制一种培养基基基基300mL300mL300mL300mL，其中，其中，其中，其中200ml200ml200ml200ml分装于分装于分装于分装于2 2 2 2 3 3 3 3个锥形瓶中，个锥形瓶中，个锥形瓶中，个锥形瓶中，另外另外另外另外l00mLl00mLl00mLl00mL分装入试管每管分装入试管每管分装入试管每管分装入试管每管5 5 5 5
28、7mL7mL7mL7mL，灭菌后制成，灭菌后制成，灭菌后制成，灭菌后制成斜面。斜面。斜面。斜面。2.2.2.2.每一小组制备无菌水每一小组制备无菌水每一小组制备无菌水每一小组制备无菌水1 1 1 1瓶瓶瓶瓶(100mL(100mL(100mL(100mL三角烧瓶中三角烧瓶中三角烧瓶中三角烧瓶中加水加水加水加水99mL99mL99mL99mL，内装少许玻璃珠，内装少许玻璃珠，内装少许玻璃珠，内装少许玻璃珠)，制备无菌水试管，制备无菌水试管，制备无菌水试管，制备无菌水试管4 4 4 4支支支支(每支试管加水每支试管加水每支试管加水每支试管加水9mL)9mL)9mL)9mL)灭菌。灭菌。灭菌。灭菌。3.3.3.3.每一小组准备每一小组准备每一小组准备每一小组准备lmLlmLlmLlmL塑料吸嘴塑料吸嘴塑料吸嘴塑料吸嘴5 5 5 5支支支支(湿热蒸汽灭湿热蒸汽灭湿热蒸汽灭湿热蒸汽灭菌菌菌菌)，培养皿，培养皿，培养皿，培养皿12121212套套套套(干热灭菌）。干热灭菌）。干热灭菌）。干热灭菌）。（五）实验步骤（五）实验步骤五、实验内容五、实验内容 写出你所制备的培养基的配方，并写出你所制备的培养基的配方，并分析其中所含物质对微生物生命活动所分析其中所含物质对微生物生命活动所起的作用。起的作用。六、实验报告六、实验报告