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1、实验目录实验一实验一:培养基的制作与灭菌技术培养基的制作与灭菌技术(3学时）学时）实验二实验二:血球计数板检测灵芝孢子粉数量血球计数板检测灵芝孢子粉数量(3学时）学时）实验三实验三:土壤微生物的分离与计数土壤微生物的分离与计数(稀释平板法稀释平板法)(3学学时）时）实验四实验四:微生物的纯化微生物的纯化,培养与保种技术培养与保种技术(3学时）学时）实验五实验五:微生物菌落形态观察微生物菌落形态观察(1学时）学时）实验六实验六:微生物大小的测定微生物大小的测定(2学时）学时）实验七实验七:革兰氏染色革兰氏染色(3学时）学时）实验一培养基的制备与实验一培养基的制备与灭菌灭菌一、目的与要求：一、目的
2、与要求：1、了解培养基的配制原理，掌、了解培养基的配制原理，掌握制备培养基的过程。握制备培养基的过程。2、学习高压蒸汽灭菌操作技术。、学习高压蒸汽灭菌操作技术。3、了解干热灭菌操作要点。、了解干热灭菌操作要点。二、原理及说明:培养基是按照微生物生长繁殖所需培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。一般来说，培制而成的营养基质。一般来说，培养基包括有水份、碳源、氮源、无养基包括有水份、碳源、氮源、无机盐类以及生长素等五大类营养成机盐类以及生长素等五大类营养成份。此外还得有适宜的份。此外还得有适宜的PH值，一定值，一定的渗透压（即浓
3、度）以及氧化还原的渗透压（即浓度）以及氧化还原电位等。电位等。1、培养基的分类、培养基的分类（1）根据培养基原料来源不同：）根据培养基原料来源不同：天然培养基、合成培养基、半合成天然培养基、合成培养基、半合成培养基培养基（2）根据物理性状分为：液体培）根据物理性状分为：液体培养基、固体培养基、半固体培养基养基、固体培养基、半固体培养基（3）根据培养基使用的用途：基）根据培养基使用的用途：基础培养基、加富培养基、鉴别培养础培养基、加富培养基、鉴别培养基、选择培养基基、选择培养基2、培养基的配制（1）原料称量、溶解：）原料称量、溶解：按下列培养基的配按下列培养基的配方准确称取各成分，在容器中加所需
4、水量方准确称取各成分，在容器中加所需水量的一半，然后依次将各种原料加入水中，的一半，然后依次将各种原料加入水中，用玻棒搅拌使之溶解。用玻棒搅拌使之溶解。配制固体培养基时，预先将琼脂称好洗净，配制固体培养基时，预先将琼脂称好洗净，然后将液体培养基煮沸，再把琼脂放入，然后将液体培养基煮沸，再把琼脂放入，继续加热至琼脂完全融化。继续加热至琼脂完全融化。（2）调节）调节PH值值用精密的用精密的pH试纸测定，并用试纸测定，并用1%氧化钠或氧化钠或5%盐酸调盐酸调节到所需的节到所需的pH值。值。（3）过滤和澄清：）过滤和澄清：趁热用纱布将培养基进行过滤，除去沉渣、颗粒，趁热用纱布将培养基进行过滤，除去沉渣
5、、颗粒，使之澄清透明。使之澄清透明。（4）分装：）分装：过滤后根据不同需要，立即趁热装入试管或三角瓶等容器中，过滤后根据不同需要，立即趁热装入试管或三角瓶等容器中，分装如图：分装如图：培养基的分装注意事项：（1）不要使培养基沾在管口，如沾上，需）不要使培养基沾在管口，如沾上，需用干净的纱布擦干净。用干净的纱布擦干净。（2）液体培养基：分装高度以试管的）液体培养基：分装高度以试管的1/4左左右为宜。右为宜。（3）固体培养基：分装试管，其装量为管）固体培养基：分装试管，其装量为管高的高的1/61/5灭菌后制成斜面。分装三角瓶灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量之一半为宜。容量之一半为宜。（4）半固体培养
6、基：分装试管一般以试管）半固体培养基：分装试管一般以试管高度的高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。体深层琼脂。（6）做棉塞）做棉塞装好装好培养基的试管都要培养基的试管都要加上棉塞，这样既可过加上棉塞，这样既可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发，制棉塞的方法多种，形状各异，总原的蒸发，制棉塞的方法多种，形状各异，总原则如下：则如下：（1）用脱脂棉制作（脱脂棉花易吸水）用脱脂棉制作（脱脂棉花易吸水）（2）松紧适合）松紧适合（3）塞头不要太大，一般为球状。）塞头不要太大，一般为球状。（7）包装试管口或三
7、角瓶口棉塞部分，用牛皮纸扎，以防灭菌时水蒸气打湿棉塞。（8）灭菌）灭菌灭菌是指杀死物品上或环境中的所有微生物。灭菌方法可分为四种：物理灭菌、机械灭菌、化学灭菌和生物灭菌。物理灭菌：1、热力灭菌：2、紫外光灭菌：一般应用于无菌室和接种箱的灭菌。热力灭菌热力灭菌：干热灭菌：适用于玻璃仪器，将物品放入烘箱，160170oC，12小时。火焰灭菌：适用于常用用具，如接种环、镊子等。灭菌方法是放在火焰上直接灼烧。湿热灭菌：(1)高压蒸汽灭菌：适用于培养基、衣物等的灭菌。（2）间歇蒸汽灭菌：适用于不耐高温的培养基或无高压蒸汽灭菌锅时。（3）巴斯德灭菌：适用于牛乳类等不耐高温的物体。紫外光灭菌：一般应用于无菌
8、室和接种箱的灭菌。原理与区别原理与区别基本原理基本原理：即通过不同的加热方法，使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的,蛋白质的凝固变性与蛋白质中含水量的多少有关，含水量较多者，其凝固所需要的温度低，反之，含水份较少者需要高温才能使蛋白质凝固。因此杀灭芽孢比杀灭营养体所需的温度高。干热灭菌与湿热灭菌的区别干热灭菌与湿热灭菌的区别：在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时水蒸汽穿透力强，水蒸汽的导热性也强。而且当蒸汽与被灭菌的物体接触凝为水时，又可放出热量，使被灭菌物体温度迅速增高，从而增加灭菌效力。高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌锅是一个耐高压又
9、密闭的金属锅。它是利用在密闭条件下产生高压蒸汽来达到灭菌的效果。其温度在100oC以上，有强大的杀菌能力。因此它是一种用途广泛，效率高的灭菌工具。分类：1、卧式 2、立式具体操作步骤：（1）加入适量自来水于灭菌锅中（至水位线）（2）摆入上述包装好的待灭菌的培养基，注意：不要摆得太挤，以免影响蒸汽流通和灭菌效果。（3）加盖旋紧螺旋，使蒸汽锅密闭不漏气（对角线均匀拧旋）（4）打开放气阀，打开电源，自开始产生蒸汽后10 min（此时蒸汽锅内的冷空气由排气阀排尽）关紧放气阀，让温度随蒸汽压力上升而上升，当达所需压力时（15磅/平方英寸）控制热源维持所需时间（30min）然后停止加热，让其自然冷却。（5
10、）待压力降至0磅时，打开排气阀，再打开锅盖，取出灭菌物。注意：压力未降至0磅时，切勿打开锅盖，否则突然降压，招致培养基沸腾，沾湿棉塞，甚至冲出管外。（6）自锅中取出灭菌好的培养基，放置稍冷却后摆成斜面，而后至37oC恒温箱培养24h，无菌生长，方可保存备用。应用此法灭菌是否彻底的一个重要关键是在压力上升之前，必须将锅内的冷空气完全排尽，否则虽然压力表已指15磅/平方英寸（1.055kg/cm2,121.6）时，但锅内的温度还只有100oC，结果往往造成灭菌不彻底。斜面摆放示意图：斜面摆放示意图：无菌水的制备：用10ml量筒量取9.0ml的自来水，装入18*180的中号试管中，用100ml量筒量
11、取99ml的自来水装入250ml的三角瓶中，做好棉塞，用牛皮纸包好，高压灭菌，备用。移液管、培养皿的移液管、培养皿的干热灭菌干热灭菌：（1）在移液管尾部塞上少许脱脂棉花，然后用报纸条包好。（2）用报纸条包好干燥的培养皿。（3）将已包好的移液管、培养皿放入电烘箱干热灭菌。干热灭菌是在恒温电箱中进行，它是利用高热空气来达到灭菌效果，因此称干热灭菌。适合玻璃器皿和金属用具的灭菌。带有胶皮的物品，含水份的物质，培养基等不可用这种方法。操作步骤：（1）将待灭菌物品包扎好，均匀放入烘箱内，注意不要摆的太挤，以免妨碍气流流通。（2）打开鼓风机、开启电源，当温度100oC时，关闭通气孔，调温度至160oC，借
12、恒温调节器的自动控制调节器，保持此温度12小时。（3）中断电源，待温度降至60oC以下时，打开箱门，取出灭菌物品。注意事项灭菌物品不能堆的太满、太紧，以免影响温度均匀上升灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防报纸烘焦灭菌温度恒定在160-170为宜，温度过高，纸和棉花会被烤焦降温时，待温度自然降至60 下再打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。培养基配制步骤与配方：1、称药、称药:量小不易称量量小不易称量,可先配成高浓度的可先配成高浓度的溶液再按比例稀释溶液再按比例稀释2、溶化、溶化:不易溶解的不易溶解的,可先用小容器溶解可先用小容器溶解,或或溶于其他溶剂溶于其他溶剂3、
13、pH值值:用用1%NaOH或用或用1%HCl调调,当配当配大量培养基时可用大量培养基时可用10%NaOH或用或用10%HCl调调,配制酸度高配制酸度高(低于低于pH值值3-4)时时,应该在凝应该在凝固前将适量经过灭菌过的酸加在培养基中固前将适量经过灭菌过的酸加在培养基中,否则不凝固否则不凝固4、过滤、过滤5、分装、分装6、做棉塞、做棉塞P587、包装、包装8、灭菌、灭菌灭菌对培养基的影响酸度的变化酸度的变化,碳水化合物的水解碳水化合物的水解,葡萄糖发生的反应葡萄糖发生的反应,沉淀的产生沉淀的产生梅拉特梅拉特反应反应:葡萄糖与氨基酸反应而使氨基酸失效葡萄糖与氨基酸反应而使氨基酸失效铁离子与磷酸盐
14、很容易生成沉淀铁离子与磷酸盐很容易生成沉淀,常需分开灭菌常需分开灭菌实验完成内容：（实验完成内容：（4 4人一组）人一组）1、包培养皿、包培养皿(12皿皿/组）。组）。2、9ml的无菌水，的无菌水，6支支/组。（试管）组。（试管）3、99ml无菌水（数粒玻璃珠），无菌水（数粒玻璃珠），1瓶瓶/组组4、做、做NA斜面斜面2根根/人。人。5、固体固体培养基平均分装入培养基平均分装入2个三角瓶中个三角瓶中,装装2/3(三角瓶三角瓶)。理科班高泽氏理科班高泽氏1号（号（1L）,文科班文科班PDA（1L）,另值日另值日生生NA（1L）.6、全班、全班1ml 的蓝色枪头的蓝色枪头4盒盒,0.2ml黄色枪头
15、黄色枪头4盒盒7、0.5ml的无菌水的无菌水2管管/人（人（1.5 ml的离心管）。的离心管）。8、湿热灭菌。、湿热灭菌。9、干热灭菌。、干热灭菌。10、40%甘油甘油100ml。11、无菌水两瓶。、无菌水两瓶。思考作业题：思考作业题：1、总结一下，配制培养基应注意哪些问题。、总结一下，配制培养基应注意哪些问题。2、高压灭菌的关键是什么？、高压灭菌的关键是什么？3、干燥灭菌为何要比湿热高温蒸汽灭菌所需的温、干燥灭菌为何要比湿热高温蒸汽灭菌所需的温度高，时间长度高，时间长?4、为何配制培养基后要调节、为何配制培养基后要调节PH值？值？培养基配制步骤与配方：NA牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌)：牛肉
16、膏 3g蛋白胨 10gNaCl 5g琼脂 20g水 1000mlPH 7.07.2 121oC 灭菌20分钟淀粉硝酸钾培养基（高泽氏1号）淀粉淀粉20.0g、硝酸钾硝酸钾1.0g、磷酸二氢钾磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁硫酸镁0.5g、氯化钠氯化钠0.5g、硫酸亚铁硫酸亚铁0.01g、水水1000.0ml。调节调节pH7.2-7.4。为分离、培养放线菌常用的培养基。为分离、培养放线菌常用的培养基。PDA培养基马铃薯 200克 葡萄糖 20克 琼脂 1520克 水 1000毫升 自然PH培养基也可以加入氯霉素或土霉素，加入量为0.1g/L培养基，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰性 PDA培养基先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸2030分钟，能被玻璃棒戳破即 可），用四层纱布过滤取滤液，加琼脂加热至融，加入葡萄糖，再补水至1000毫升。