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1、血红蛋白的提取与分离1 本课题学习目标本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1 1 1 1、主要概念：、主要概念：、主要概念：、主要概念：凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2 2 2 2、主要原理：、主要原理：、主要原理：、主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理电泳法分离样品的原理
2、缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理3 3、课题重点：、课题重点：、课题重点：、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法4 4、课题难点：、课题难点：、课题难点：、课题难点：样品的处理样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。蛋白质的知识蛋白质的知识(1)一个通式：是指组成蛋白质的基本单位氨基酸；氨基酸的通式只有一个通式：是指组成蛋白质的基本单位氨基酸；氨基酸的通式只有1个，即个，即(形象记忆：碳周围有四个邻居，三个固定邻居即形象记忆：碳周围有四个邻居，三个固定邻居即-H、-COOH、-NH2，一个变动邻居即一个变动邻居即-R基基)。
3、不同的氨基酸分子，具有不同的。不同的氨基酸分子，具有不同的-R基。基。(2)两个标准：是指判断组成蛋白质的氨基酸必须同时具备的标准有两个标准：是指判断组成蛋白质的氨基酸必须同时具备的标准有2个：个：一是数量标准，即每种氨基酸分子至少都含有一个氨基一是数量标准，即每种氨基酸分子至少都含有一个氨基(-NH2)和一个羧基和一个羧基(-COOH)；二是位置标准，即都是一个氨基和一个羧基连接在同一个碳原子上。；二是位置标准，即都是一个氨基和一个羧基连接在同一个碳原子上。(3)三个数量关系：是指蛋白质分子合成过程中的三个数量关系：是指蛋白质分子合成过程中的3个数量关系个数量关系(氨氨基酸数、肽键数或脱水分
4、子数、肽链数基酸数、肽键数或脱水分子数、肽链数)，它们的关系为：当，它们的关系为：当m个氨基个氨基酸缩合成一条肽链时，脱水分子数为酸缩合成一条肽链时，脱水分子数为(m-1)，形成，形成(m-1)个肽键，即脱个肽键，即脱去的水分子数去的水分子数=肽键数肽键数=氨基酸数氨基酸数-1；当；当m个氨基酸形成个氨基酸形成n条肽链时，条肽链时，肽键数肽键数=脱水分子数脱水分子数=m-n。(4)四个原因：是指蛋白质分子结构多样性的原因有四个原因：是指蛋白质分子结构多样性的原因有4个：个：组成蛋白质的氨基酸分子的种类不同；组成蛋白质的氨基酸分子的种类不同；组成蛋白质的氨基酸分子的数量成百上千；组成蛋白质的氨基
5、酸分子的数量成百上千；组成蛋白质的氨基酸分子的排列次序变化多端；组成蛋白质的氨基酸分子的排列次序变化多端；蛋白质分子的空间结构不同。蛋白质分子的空间结构不同。(5)五大功能：是指蛋白质分子主要有五大功能：是指蛋白质分子主要有5大功能大功能(由分子结构的多样性由分子结构的多样性决定决定)：有些蛋白质是构成细胞和生物体的重要物质，如人和动物的肌有些蛋白质是构成细胞和生物体的重要物质，如人和动物的肌肉主要是蛋白质；肉主要是蛋白质；有些蛋白质有催化作用，如参与生物体各种生命活动的绝大多有些蛋白质有催化作用，如参与生物体各种生命活动的绝大多数酶；数酶；有些蛋白质有运输作用，如细胞膜上的载体、红细胞中的血
6、红有些蛋白质有运输作用，如细胞膜上的载体、红细胞中的血红蛋白；蛋白；有些蛋白质有调节作用，如胰岛素和生长激素都是蛋白质，能有些蛋白质有调节作用，如胰岛素和生长激素都是蛋白质，能够调节人体的新陈代谢和生长发育；够调节人体的新陈代谢和生长发育；有些蛋白质有免疫有些蛋白质有免疫(包括细胞识别包括细胞识别)作用，如动物和人体的抗体作用，如动物和人体的抗体能清除外来蛋白质对身体生理功能的干扰，起着免疫作用。能清除外来蛋白质对身体生理功能的干扰，起着免疫作用。血红蛋白血红蛋白 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质(缩写为HB或HGB)。血红蛋白因含有血红素而
7、呈现红色，是使血液呈红色的蛋白。血红蛋白由四条链组成，两条链和两条链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白的特性是：在氧含量高的地方，容易与氧结合；在氧含量低的地方，又容易与氧分离。血红蛋白的这一特性，使红细胞具有运输氧的功能。血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含
8、有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：蛋白质提取和分离的原理蛋白质提取和分离的原理根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和状和 根据蛋白质各种特性的差异，根据蛋白质各种特性的差异，各种特各种特性的差异性的差异 大小、所带电荷的性质和多少、大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、溶解度、大小、所带电荷的性质和多少、大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质溶解度、吸附性质 和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等等等 可以用来分离不同种可以用来分离不同种 等等，等等，和对其他和对其他分
9、子的亲和力等等，可以用来分离不同种分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。类的蛋白质。1、凝胶色谱法、凝胶色谱法 凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称称分子筛层析分子筛层析。凝胶实际上是一些凝胶实际上是一些微小的多孔球体微小的多孔球体，例，例如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等烯酰胺、葡聚糖凝胶等 一、基本概念及原理一、基本概念及原理原理：原理：当不同的蛋白质通过凝胶时当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质
10、量较小相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶内部的通道凝胶内部的通道容易进入容易进入无法进入凝胶无法进入凝胶内部的通道内部的通道只能在只能在凝胶外部凝胶外部移动移动路程路程较长较长移动速度移动速度较慢较慢路程路程较短较短移动速度移动速度较快较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4.4.凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质的原理和具体过程具体过程思考：所有的蛋白质都可以用凝胶色谱法思考：所有的蛋白质都可以用凝胶色谱法 来分离吗？来分离吗？不是，能分离的蛋白质分子必须是具不是，能分离的蛋白质分子必须是具有相对分子质量不同的蛋白质。有相对分子质量不同的蛋白质。二、缓
11、冲溶液二、缓冲溶液 在一定范围内，能够抵制在一定范围内，能够抵制 对溶对溶液液PHPH值的影响，维持值的影响，维持PHPH 不变。不变。1.1.作用作用:2.2.配制配制:通常由通常由 溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。调节缓冲剂调节缓冲剂 的就可以制得在的就可以制得在 使使用的缓冲液。用的缓冲液。3 3 3 3.提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是:_:_:_:_,其目的是其目的是其目的是其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观
12、察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色红色红色红色)和科和科 学研究学研究(活性活性活性活性)磷酸缓冲液磷酸缓冲液外界的酸和碱外界的酸和碱基本基本12 种缓冲剂种缓冲剂使用比例使用比例不同不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3三、三、电泳电泳-血红蛋白的分离鉴定方法血红蛋白的分离鉴定方法1.1.概念：概念：带电粒子在带电粒子在 作用下发生作用下发生 的过程。的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有具有 的基团，在一定的的基团，
13、在一定的PHPH下，这些基团会带下，这些基团会带上上 或或 。在电场的作用下，这些带电分子在电场的作用下，这些带电分子会向着的会向着的 的电极移动。电泳利用的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子了待分离样品中各种分子 以及分子以及分子本身的本身的 、的不同，使带电分子产生不同的不同，使带电分子产生不同的的 ，从而实现样品中各种分子的分离。，从而实现样品中各种分子的分离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。电场电场迁移迁移可解离可解离正电正电负电负电与其所带电荷相反与其所带电荷相反带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速
14、度 最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。脂糖凝胶。琼脂糖琼脂糖有一个相对较大的孔径，用有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。多数蛋白和小片段核酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）在电场的作用下，这些带电分子会向着在电场的作用下，这些带电分子会向着在电场的作用下，这些带电分子会向着在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动与其所带电荷相反的电极移
15、动与其所带电荷相反的电极移动与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图 （1 1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 等因素。等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小它所带静电荷的多少以及分子的大小（2）、）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，复合物，SDS所所带负电荷带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（
16、迁移率完全取决于（）。）。分子的大小分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳检测电泳检测PCR结果结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。测定蛋白质的相对分子质量常用测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的
17、大小、形状。带电荷的性质和分子的大小、形状。二、实验步骤二、实验步骤 蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定（电泳）纯度鉴定（电泳）实验操作实验操作样品处理样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤粗分离：粗分离：血红蛋白的释放血红蛋白的释放血红蛋白的释放血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液纯化：纯化：纯度鉴定纯度鉴定透析透析去除样品中分子量较小的杂质去除样品中分子量较小的杂质用用凝胶色谱法凝胶色谱法除去相对分子质量较
18、大的除去相对分子质量较大的杂质杂质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 2与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比,红细胞有什红细胞有什红细胞有什红细胞有什么特点么特点么特点么特点?这一特点对你进行蛋白质的分离有这一特点对你进行蛋白质的分离有这一特点对你进行蛋白质的分离有这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义什么意义什么意义什么意义?1.1.1.1.用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNADNADNA，用哺乳动物的红细胞，用哺乳动物的红细胞，用哺乳动物的红细胞，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？提取
19、血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNADNADNA，便于进行，便于进行，便于进行，便于进行DNADNADNADNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白答答答答:血红蛋白是有色蛋白血红
20、蛋白是有色蛋白血红蛋白是有色蛋白血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱分离时可因此在凝胶色谱分离时可因此在凝胶色谱分离时可因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液.这这这这使血红蛋白的分离过程非常直观使血红蛋白的分离过程非常直观使血红蛋白的分离过程非常直观使血红蛋白的分离过程非常直观,大大简化了实验操大大简化了实验操大大简化了实验操大大简化了实验操作作作作.采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）（二）操作过程（二）操
21、作过程从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。白、透析。1.红细胞的洗涤：红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，用离心机进行分离。采用低速短时间离心，如500r/mim离心2mim，用胶头滴管吸出上层透明液体（黄色血浆），将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯中，再加入五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液），缓慢搅拌10mim，低速时间离心，如此重复洗涤三遍，直至上层清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。1、样品的处理（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的:B、分离时采用 离心
22、，用 洗 涤，重复洗涤 ，直至 为什么要低速短时离心？防止白细胞沉淀C、能否用蒸馏水代替生理盐水？去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化低速短时间低速短时间五倍体积的生理盐水五倍体积的生理盐水三次三次 上清液不再呈现黄色，上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净表明红细胞已洗涤干净不能，不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，而不至于破裂，若红细胞若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。，加大分离难度。D、为什么要缓慢搅拌？、为什么要缓慢搅拌？防
23、止红细胞破裂释放出血红蛋白。防止红细胞破裂释放出血红蛋白。初次离心后的结果3次洗涤后的结果 2.血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：将洗好的红细胞倒入烧杯中，加入蒸馏水到原血液的体积，再加入40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10mim。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。（2）释放血红蛋白）释放血红蛋白思考：思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？哪些物质？（蒸馏水，（蒸馏水，40%体积的甲苯）体积的甲苯）2.为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？（使用磁力搅拌器充分搅拌）（使用磁
24、力搅拌器充分搅拌）目的分析：目的分析：1.蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。2.加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。3.充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作3.分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液转移到离心管中，以2000r/mim的速度离心10mim后，可以看出溶液分为4层，从上往下数，第一层是无色透明的甲苯层，第二层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层，第三层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中
25、的液体用滤纸过滤，出去脂溶性沉淀物，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体（3）分离血红蛋白溶液：）分离血红蛋白溶液：用滤纸过滤，除去用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片分液漏斗中静置片刻后，刻后，分出下层的分出下层的红色透明液体红色透明液体。甲苯层（无色透明）甲苯层（无色透明）甲苯层（无色透明）甲苯层（无色透明）白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体红色透明液体红色透明液体红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）杂质沉淀层（暗红色）杂质沉淀层（暗红色）杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次柜式离心机4.透析：透析：取1mL的血红蛋白
26、溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲剂中（pH为7.0），透析12h。2.粗分离-透析（去除分子量较小的杂质）（1）用 方法进行粗分离，透析袋由半透膜制 成，常用 。将透析袋放入 溶液中进行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是 。透析透析玻璃纸、肠衣、膀胱膜玻璃纸、肠衣、膀胱膜 透析袋能使小分子自由进出，而将透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内大分子保留在袋内去除样品中分子量较小的杂质去除样品中分子量较小的杂质磷酸缓冲磷酸缓冲透析过程中如何去除无机盐离子和小分子透析过程中如何去除无机盐离子和小分子有机物？有机物？半透膜的选择透过
27、性，大分子物质不能通半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到小分子不断通过半透膜扩散进入到pH7的的磷酸缓冲液中。磷酸缓冲液中。透析过程中为何使用透析过程中为何使用pH7的磷酸缓冲液？的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。子充分地向外扩散。透析过程动画演示透析过程动画演示（1 1）凝胶色
28、谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，两厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网，再用，再用100100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。3、纯化（凝胶色谱）、纯化（凝胶色谱）-去除相对分子量去除相对分子量较大的杂质蛋白较大的杂质蛋白 凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。凝胶
29、的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定计算并称取一定量的凝胶浸泡于量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液蒸馏水或洗脱液中充分中充分溶胀溶胀后，配成后，配成凝胶悬浮液凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A A、固定：、固定：将色谱柱装置固定在支架上。将色谱柱装置固定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液将凝胶悬浮液一次性一次性缓慢倒入色谱柱缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，
30、以降低凝胶颗粒之间、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。的空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。教材教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、为什么凝胶的装填要紧密、均匀？均匀？如果装填如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。质的洗脱次序，影
31、响分离的效果。装配好的凝胶柱(3(3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱加样前加样前 打开下端出口，使柱内凝打开下端出口，使柱内凝胶面上的（胶面上的（）缓慢下）缓慢下降到与（降到与（）平齐，）平齐，关闭出口关闭出口缓冲液缓冲液凝胶面凝胶面注意：注意：注意：注意：正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。加透析样品加透析样品调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：加到色谱柱的（滴加透析样品：加到色谱柱的（）样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床
32、：（）再调整缓冲液面洗脱：再调整缓冲液面洗脱：收集：收集：待（待（）接近色谱柱底接近色谱柱底端时收集端时收集顶端顶端样品完全进凝胶层样品完全进凝胶层红色的蛋白质红色的蛋白质色谱柱制作成功的标志：色谱柱制作成功的标志：红色区带均匀一致的移动红色区带均匀一致的移动记记4、纯度鉴定（电泳）、纯度鉴定（电泳）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳1、垂直板电泳装置、垂直板电泳装置2、稳流稳压电泳仪；、稳流稳压电泳仪；3、微量进样器（可用微量移液器代替）、微量进样器（可用微量移液器代替）（5）装槽、点样：）装槽、点样：拔出梳子拔出梳子 将胶板固定在电泳槽上（凹板将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）一
33、侧向内）在电泳槽中加入缓冲液在电泳槽中加入缓冲液 点样。点样。（6）电泳：）电泳：（7)、剥胶、染色及脱色、剥胶、染色及脱色 凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。色，然后用脱色液脱色。(8)、结果、结果 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-5-1818），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长
34、，会使白细胞和淋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放
35、一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。如果凝胶色谱柱装填得
36、很成功、分离操作也正确如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。装填有关。3 3 3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效动吗？
37、请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？果？果？果？3 3、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：2.2.2.2.试剂的配制：试剂的配制：试剂的配制：试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。1.1.1.1.目的：目的：目的：目的：丙烯酰胺和丙烯酰胺和丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-N,N-N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺:用去离子水配制用去离子水配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和，
38、下同）的丙烯酰胺和1%1%的的N,N-N,N-亚亚亚亚甲甲基基基基双双丙烯酰胺的贮存液。丙烯酰胺的贮存液。十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDSSDSSDS）:用去离子水用去离子水配成配成10%10%的贮存液，于室温保存。的贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶用于制备分离胶和浓缩胶用于制备分离胶和浓缩胶用于制备分离胶和浓缩胶的的的的TrisTrisTrisTris缓冲液。缓冲液。缓冲液。缓冲液。TEMED TEMED TEMED TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。而加速丙烯酰胺与
39、双丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制用去离子水配制用去离子水配制用去离子水配制10%10%10%10%过硫酸铵：过硫酸铵：过硫酸铵：过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。的自由基。此溶液须配制新鲜液。TrisTrisTrisTris甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样品处理液：样品处理液：样
40、品处理液：样品处理液：50 mmol/L Tris50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)HCl(pH 6.8)，100 100 mmol/L DTT(mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。染色液：染色液：染色液：染色液：0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲醇，的甲醇，10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。脱色液：脱色液：脱色液：脱色液：10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰的冰醋酸。醋酸。1 1、由于制备凝胶的
41、丙烯酰胺和双丙烯酰胺、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。因此操作必须在通风橱内或通风处进行。2 2、TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。致命。3 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。步骤完成。操作时要戴好一次性手套。注意事项：注意事项：SDS SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳
42、 SDS-SDS-SDS-SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水用去离子水用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL4.6 mL4.6 mL，30%30%30%30%的的的的丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺2.7 mL2.7 mL2.7 mL2.7 mL，1.5mol1.5mol1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8pH 8.8pH 8.8的的的的TrisTrisTrisTris缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液2.5 mL2.5 mL2.5 mL2.5 mL，10%10%10%10%的的的的SDS 0.1 mLSDS 0
43、.1 mLSDS 0.1 mLSDS 0.1 mL，10%10%10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 mL0.1 mL0.1 mL0.1 mL，TEMED 0.006mLTEMED 0.006mLTEMED 0.006mLTEMED 0.006mL，混合均匀，混合均匀，混合均匀，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加梳子的齿长再加梳子的齿长再加梳子的齿长再加0.5 cm)
44、0.5 cm)0.5 cm)0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高，再在胶液面上小心注入一层水（约高，再在胶液面上小心注入一层水（约高，再在胶液面上小心注入一层水（约高2 2 2 23 mm3 mm3 mm3 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。），以阻止氧气进入凝胶溶液。），以阻止氧气进入凝胶溶液。），以阻止氧气进入凝胶溶液。分离胶聚合完全后分离胶聚合完全后分离胶聚合完全后分离胶聚合完全后（约（约（约（约30 min30 min30 min30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。），倾出覆盖水层，再用
45、滤纸吸净残留水。配制配制配制配制SDSSDSSDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL2.7 mL2.7 mL2.7 mL，30%30%30%30%的的的的丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺0.67 mL0.67 mL0.67 mL0.67 mL，1.0 mol1.0 mol1.0 mol1.0 mol、pH 6.8pH 6.8pH 6.8pH 6.8的的的的TrisTrisTrisTris缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液0.5 mL0.5 mL0.5 mL0.5 mL，
46、10%10%10%10%的的的的SDS0.041 mLSDS0.041 mLSDS0.041 mLSDS0.041 mL，10%10%10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺0.04 mL0.04 mL0.04 mL0.04 mL，TEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mL，混，混，混，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干
47、净的梳子入干净的梳子入干净的梳子入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。温下聚合。温下聚合。温下聚合。（1 1 1 1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板）根
48、据厂家说明书安装电泳用的玻璃板（2 2 2 2）SDSSDSSDSSDS聚丙烯酰胺凝胶制备：聚丙烯酰胺凝胶制备：聚丙烯酰胺凝胶制备：聚丙烯酰胺凝胶制备：3 3、电泳方法步骤、电泳方法步骤（3 3 3 3）样品处理：）样品处理：）样品处理：）样品处理：在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，在体积比加入样品处理液，在100 100 温度下加热温度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性。，以使蛋白质变性。（4 4 4 4）浓缩胶聚合完全）浓缩胶聚合完全）浓缩胶聚合完全）浓缩胶聚合完全后（后（后（后（30 min30 min30 min30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于
49、电泳装置上，上下槽），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入各加入各加入各加入TrisTrisTrisTris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。之间的气泡。之间的气泡。之间的气泡。（5 5 5 5）加样：）加样：）加样：）加样：按顺序加样，加样量通常为按顺序加样，加样量通常为101025 L25 L。样品可以多加几个，例如，血浆
50、样品红细胞破碎后样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色即进行凝胶色谱分离之前谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品的样品和凝胶色谱分离之后的样品（6 6 6 6）电泳：）电泳：）电泳：）电泳：将电泳将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm8 V/cm。当染料前沿进入分离。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到胶后，把电压提高到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约部上方约1 cm1 cm处，关闭电源。处，关闭电源。（7 7 7 7）剥胶：）剥胶：）剥胶：）剥胶：从电泳装