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1、请核对导学案请核对导学案(xu n)答答案案绪绪1.差异性2.来源和性质3.20 、4、2个、2个、亚铁、一分子 氧、一分子二氧化碳4.血红蛋白含量丰富(fngf)，容易获取。第一页，共三十页。（一）样品处理及粗提取（一）样品处理及粗提取1.样品处理、粗分离、纯化 和纯度鉴定(jindng)。2.血浆、杂蛋白、柠檬酸钠、五、生理盐 水、缓慢、低速短时、上清液没有黄色3.红细胞、等、蒸馏水、甲苯、磁力搅拌器4.血红蛋白、高速离心、无、甲苯、白、脂溶 性沉淀、红、血红蛋白溶液、暗红、破碎物沉 淀、滤纸、脂溶性沉淀、分液漏斗、血红蛋白 溶液5.无机盐离子、有机小分子、透析袋、磷酸缓冲 液第二页，共三
2、十页。（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作2.交联程度、膨胀程度和分离范围、得水值、7.5、蒸馏水、均匀、气泡、磷酸缓冲液、紧密(jnm)。3.管壁、凝胶面、色谱柱底部、5（三）操作提示（三）操作提示1.白细胞2.洗脱液、沸水浴、微生物、空气3.扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序第三页，共三十页。请请拿出拿出课本、双色笔、导学案课本、双色笔、导学案 让我们让我们(w men)准备好进行思维的碰撞准备好进行思维的碰撞回顾：回顾：1.1.凝胶色谱法和电泳的基本原理？凝胶色谱法和电泳的基本原理？2.2.缓冲溶液缓冲溶液(hun chn rn y)(hun chn rn y)的作用？的作用？请请3组组A1阐
3、述阐述(chnsh)请请5组组A2阐述阐述第四页，共三十页。凝胶色谱法分离蛋白质的原理（根据分子量的大小分子量的大小）相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部通道(tngdo)，路程较长移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，路程较短移动速度较快；相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。凝胶电泳的原理 带电粒子在电场的作用下发生定向迁移，在加入SDS排除电荷多少的影响后，使电泳迁移率完全取决于分子大小，从而达到分离的目的。第五页，共三十页。课题3 血红蛋白的提取和分离(fnl)实验操作要领知识目标：知识目标：（1）描述描述凝胶色谱分离蛋白质的步骤步骤(bzhu)(bzhu)；
4、（2）理解进行样品的预处理的目的预处理的目的；（3）运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。重、难点：重、难点：（1）描述描述凝胶色谱分离蛋白质步骤步骤；（2）运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。全全班班同同学学一一起起(yq)朗朗读读第六页，共三十页。蛋白质提取和分离蛋白质提取和分离(fnl)步步骤骤具具体体操操作作步步骤骤(bzhu)（一）（一）（二）（二）（三）（三）（四）（四）第七页，共三十页。哺哺乳乳(b(b r)r)血血液液血血 浆浆水水 分分固体固体(gt)(gt)物物质质血浆血浆(xujing)(xujing)蛋白蛋白无机盐无机盐磷磷 脂脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细
5、胞血小板血小板红细胞红细胞（最多最多）血红蛋白血红蛋白 （）9090有没有，多不多，易不易有没有，多不多，易不易第八页，共三十页。1.洗涤洗涤(xd)红细胞红细胞1.1 洗涤的目的：洗涤的目的：洗去血液洗去血液(xuy)中血浆及血小板等中的中血浆及血小板等中的杂蛋白杂蛋白1.2 洗涤过程：洗涤过程：血液血液(xuy)100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积倍体积生理盐水生理盐水缓慢搅拌缓慢搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，直至上清液没有次，直至上清液没有防止破坏红防止破坏红细胞，使血细胞，使血红蛋白流失红蛋白流失（一）
6、样品处理（一）样品处理黄色黄色第九页，共三十页。2.血红蛋白血红蛋白(xuhng dnbi)的释放的释放原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放(shfng)血红蛋白血红蛋白第十页，共三十页。3.分离分离(fnl)血红蛋白溶液血红蛋白溶液分离分离(fnl)过程：过程：红细胞红细胞混合液混合液离心管离心管甲苯层甲苯层脂类物质脂类物质血红蛋白层血红蛋白层破碎物沉淀层破碎物沉淀层高速离心高速离心10min 滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质沉淀物沉淀物烧杯烧杯分液分液漏斗漏斗第十一页，共三十页。20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液透析的目的透析的目的(md)是什么？是什么？
7、1mL1mL1mL去除去除(q ch)血红蛋白中的小分子杂血红蛋白中的小分子杂质质（二）粗分离（二）粗分离(fnl)透析血红蛋白透析血红蛋白第十二页，共三十页。注意事项注意事项（1）生理盐水）生理盐水(shnglynshu)作用？作用？（3）两次离心）两次离心(lxn)的差异？的差异？（4）透析袋的作用）透析袋的作用(zuyng)机理机理？模拟红细胞生存环境，模拟红细胞生存环境，保持红细胞结构完整。保持红细胞结构完整。破碎红细胞；溶解细胞膜破碎红细胞；溶解细胞膜释放血红蛋白。释放血红蛋白。前慢后快，前短后长。前慢后快，前短后长。渗透作用渗透作用（2）蒸馏水和甲苯的作用？）蒸馏水和甲苯的作用？第
8、十三页，共三十页。（三）纯化（三）纯化(chn hu)1.凝胶色谱凝胶色谱(s p)柱的制柱的制作作（2）规格：玻璃管）规格：玻璃管长长40cm，内径，内径(ni jn)1.6cm，两端磨平；，两端磨平；橡皮塞橡皮塞能塞入玻璃管，上平小凹；能塞入玻璃管，上平小凹；移液管移液管0.5mL，长，长5cm；尼龙网尼龙网100目；目；打孔器打孔器移液管能塞入。移液管能塞入。（1）材料：玻璃管，橡皮塞、移液管、尼龙网）材料：玻璃管，橡皮塞、移液管、尼龙网 尼龙管、打孔器、小刀、螺旋夹尼龙管、打孔器、小刀、螺旋夹第十四页，共三十页。2.凝胶色谱凝胶色谱(s p)柱的填柱的填装装（1）认识）认识(rn sh
9、i)凝胶凝胶Sephadex G75 G:交联程度、膨胀程度、分离范围交联程度、膨胀程度、分离范围 75：凝胶得水值，即每克凝胶膨胀得水：凝胶得水值，即每克凝胶膨胀得水7.5克克（3 3）填装：缓慢一次填装，均匀，紧密、不能有气泡）填装：缓慢一次填装，均匀，紧密、不能有气泡(qpo)(qpo)，迅速，迅速 连接缓冲液连接缓冲液（2）认识缓冲液：）认识缓冲液：300mL、20mmol/L、PH=7.0磷酸缓冲液磷酸缓冲液第十五页，共三十页。3.样品样品(yngpn)的加入和的加入和洗脱洗脱开下端开下端(xi dun)关下端关下端(xi dun)开下端开下端加样加样样品完全渗入样品完全渗入缓冲液面
10、缓冲液面=凝胶面凝胶面关下端关下端加缓冲液加缓冲液接洗脱瓶接洗脱瓶开下端开下端注意：待红色的蛋白质接近柱底是，开始收集，注意：待红色的蛋白质接近柱底是，开始收集，连续收集，每管连续收集，每管5ml疑问：疑问：连续收集得到的连续收集得到的每一管每一管中是否为中是否为同一分子质量同一分子质量的蛋白质？的蛋白质？第十六页，共三十页。（四）纯度鉴定（四）纯度鉴定(jindng)电电泳泳1.原理：带电粒子在电场中发生定向迁移，从而把不同质量原理：带电粒子在电场中发生定向迁移，从而把不同质量和电量的粒子分离开。加入电量远大于比粒子自身带电量的和电量的粒子分离开。加入电量远大于比粒子自身带电量的SDS，排除
11、电荷对粒子迁移大小的影响，据此将，排除电荷对粒子迁移大小的影响，据此将不同分子不同分子(fnz)质质量量的粒子分开。的粒子分开。2.电泳结果分析电泳结果分析如果出现一个条带：样品中含有如果出现一个条带：样品中含有一个分子质量一个分子质量(zhling)级别级别多肽；多肽；如果出现两个条带：样品中含有如果出现两个条带：样品中含有两个分子质量级别两个分子质量级别多肽。多肽。第十七页，共三十页。第十八页，共三十页。第十九页，共三十页。题目：题目：（1）探究探究问题问题1、2、3（2）自己存在的其他疑问）自己存在的其他疑问要求：要求：（1）小组长搞好组织调控：先）小组长搞好组织调控：先一对一一对一讨论
12、，再组内跨层讨论，再组内跨层 交流；重点讨论答交流；重点讨论答案案的的科学性；科学性；（2）讨论形成的答案要条）讨论形成的答案要条理清晰、要点化、序号化理清晰、要点化、序号化。帮。帮 助展示同学做好展示准备。助展示同学做好展示准备。A层层 解决全部疑难，并帮助解决全部疑难，并帮助B层完善答案层完善答案,帮助其他同学解决疑难点。帮助其他同学解决疑难点。B层层 解决疑难后，负责解决疑难后，负责(fz)展示。展示。C层层 解决疑难解决疑难，狂记狂记导学案自主学习部分导学案自主学习部分。第二十页，共三十页。展示点评展示点评(din pn)安排安排题目题目(tm)展示展示(zhnsh)小小组组点评小组点
13、评小组 非展示同学非展示同学探究探究1 1讨论完后讨论完后B B、C C层层落实基落实基本原理的理解和记忆本原理的理解和记忆（3 3分钟记住）分钟记住）A A层层及时补充点评及时补充点评探究探究2 2探究探究3 3 点评、拓展、升华点评、拓展、升华 约约1010分钟分钟点评答题规范、答案的正误或全面否，进行答案的补充修正，或知识拓点评答题规范、答案的正误或全面否，进行答案的补充修正，或知识拓展，或规律方法的总结。展，或规律方法的总结。其他同学注意倾听、积极思考其他同学注意倾听、积极思考,重点内容记好笔记。有不明白或有补充重点内容记好笔记。有不明白或有补充的同学要大胆提出。的同学要大胆提出。其它
14、小组可进行补充点评或拓展其它小组可进行补充点评或拓展1B21B24B24B2、5B15B12B12B1、3B13B16B16B17B27B28B28B2要求：要求：展示人及时到位，规范快速、脱稿展示人及时到位，规范快速、脱稿。答案要答案要序号化、要点化序号化、要点化。组长搞好调控，可分工展示。组长搞好调控，可分工展示。准备准备质疑、补充质疑、补充，高效科研小组成员发挥带头作用，高效科研小组成员发挥带头作用。第二十一页，共三十页。要求：要求：1.B1.B层、层、C C层结合学习目标，巩固落实层结合学习目标，巩固落实(lush)(lush)本课的基础本课的基础知知 识；识；A A层达成目标后，整理
15、合作探究答案。层达成目标后，整理合作探究答案。2.2.组长抽查本组基础知识的掌握情况。组长抽查本组基础知识的掌握情况。（1）记忆凝胶色谱分离蛋白质的步骤；（2）理解进行(jnxng)样品的预处理的目的；第二十二页，共三十页。本节内容目标：获取本节内容目标：获取(huq)血红蛋白溶液血红蛋白溶液获获 取取红细胞红细胞（离心（离心(lxn)）破碎红细胞，释破碎红细胞，释放血红蛋白放血红蛋白从各从各红细胞红细胞的成分的成分中获取中获取血红蛋白血红蛋白 （离心）（离心）初步纯化初步纯化血红蛋白血红蛋白（透析）（透析）第二十三页，共三十页。1.下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述正确的是（下列有关提取和
16、分离血红蛋白的程度叙述正确的是（）多选多选 A.样品的处理就是样品的处理就是(jish)通过一系列操作收集到血红蛋白溶液通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D.可通过可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度ACD2.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，
17、其中正确的是（）A.可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料(cilio)B.用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤红细胞 C.血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D.洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液A 2组组A11组组A2第二十四页，共三十页。3.样品的加入和洗脱的操作不正确样品的加入和洗脱的操作不正确(zhngqu)的是（的是（）A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓 冲液缓慢下降到凝胶面的下面冲液缓慢下降到凝胶面的下面B.加样后，打开下端出口，使样品渗入
18、凝胶床内加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D.用吸管小心的将用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要 破坏凝胶面破坏凝胶面4.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是（在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是（）A.气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离(fnl)效果效果B.气泡阻碍蛋白质的运动气泡阻碍蛋白质的运动C.气泡与蛋白质发生化学反应气泡与蛋白质发生化学反应D.气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密气泡在装填凝胶的时
19、候，使凝胶不紧密A A 5组组A23组组A1第二十五页，共三十页。6.下列操作正确的是（下列操作正确的是（）A.分离红细胞时采用低速长时间离心分离红细胞时采用低速长时间离心 B.红细胞释放出血红蛋白只需要红细胞释放出血红蛋白只需要(xyo)加入蒸馏水就可加入蒸馏水就可C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D.透析时要用透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析的磷酸缓冲液，透析12h5.选用红细胞作分离蛋白质的实验材料选用红细胞作分离蛋白质的实验材料(cilio)，下列是其优点的是，下列是其优点的是 ()多多A.血红蛋白是有色蛋白血红蛋白是有色蛋白 B.红细胞
20、无细胞核红细胞无细胞核C.红细胞蛋白质含量高红细胞蛋白质含量高 D.红细胞红细胞DNA含量高含量高ABC D 4组组A16组组A2第二十六页，共三十页。7.下面关于下面关于(guny)对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是 ()多多A.采集血样后要高速短时问离心获得血细胞采集血样后要高速短时问离心获得血细胞B.洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血 浆蛋白无法除净。浆蛋白无法除净。C.在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红
21、蛋白D.释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂 质分离开来质分离开来 BCD8组组A2第二十七页，共三十页。8.在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误(ww)的的是是 ()A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果的效果C洗涤过程选用洗涤过程选用0.1%的生理盐水的生理盐水D透析的目的是去除样品中相
22、对分子质量较小的杂质下透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质下 D 7组组A1第二十八页，共三十页。学科助理：学科助理：1.1.回扣目标回扣目标 总结总结(zngji)(zngji)收收获获 2.2.评出优秀小组和个人评出优秀小组和个人 谢谢谢谢(xi xie)(xi xie)！第二十九页，共三十页。内容(nirng)总结请核对导学案答案。3.扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，路程较短移动速度较快。助展示同学做好展示准备。A层 解决全部疑难，并帮助B层完善(wnshn)答案,。讨论完后B、C层落实基本原理的理解和记忆（3分钟记住）A层。有不明白或有补充的同学要大胆提出。答案要序号化、要点化。1.B层、C层结合学习目标，巩固落实本课的基础知。D.洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液。谢谢第三十页，共三十页。