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1、转基因表达PPT课件外源基因与受体基因组整合，但该基因不表达或表达水平降低，或者植物新获得的遗传特性随着植物自身的繁殖在后代中又消失，这种现象转基因沉默（transgene silencing）或转基因失活（transgene inactivation）。对于育种来说，这无疑是不受欢迎的实质性障碍。对于基因表达来说，转基因植株为研究目的基因的表达调控提供了优良的材料。通过深入研究可加深理解自然植物在DNA水平上调控基因的表达，或在细胞质中通过mRNA水平来调控基因的表达。二、转基因沉默的可能机制二、转基因沉默的可能机制转基因沉默并不是所转化的基因发生了丢失或突变，而是整合进植物基因组的外源基因
2、在转化体的当代或其后代中出现了基因失活或表达受到抑制的现象。转基因的拷贝数和构型转基因在基因组中的整合位点转基因的转录水平和翻译水平环境因子对转基因表达的作用转基因沉默主要分为两类，转基因沉默主要分为两类，转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS），发生在核内转录后水平的基因沉默（Posttranscriptional gene silencing，PTGS）发生在细胞质中都是核酸的相互作用，即DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA。Gene silencing in transgenic plant Transcriptional ge
3、ne silencing(TGS)TGS mediated by DNA methylation TGS mediated by surrounding heterochromatin TGS mediated by copy number of insert TGS mediated by endogenous repetitive sequences Posttranscriptional gene silencing(PTGS)PTGS mediated by sense transgenes PTGS mediated by antisense transgenes PTGS medi
4、ated by DNA/RNA viruses1DNA的拷贝数和其结构 转基因沉默与转基因的拷贝数和其构型有关。DNA-DNA相互作用。多拷贝的整合方式并未使基因表达水平有所增加，反而使DNA发生甲基化或其他原因引起基因失活。农杆菌介导的转化方法比DNA 直接转化法所产生的拷贝数低。外源基因的拷贝数低也并一定能导致基因的充分表达，所以转基因拷贝数的多少对基因表达没有定论。倾向于多拷贝导致基因沉默。转录水平的基因沉默转录水平的基因沉默诱导重复DNA甲基化（repeatinduced DNA methylation），转基因作为串联重复或反向串联重复插入基因组同一位点则倾向于失活，因重复会导致甲基
5、化，通常，在一个位点内拷贝数愈高，失活愈严重。外源基因的构型是指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组中。（1）顺式失活（cis-inactivation），指紧密连锁的多拷贝的转基因以正向或反向相互串联而使基因失活。这种构型在DNA直接导入中常见，多以甲基化的方式发生。（2）反式失活（trans-inactivation），指转基因以顺式方式插入并发生失活，作为一个沉默子（silencer）而引起不同DNA分子上同源的等位或非等位的目标基因失活2位置效应外源基因整合到染色体的物理位置就直接决定着外源基因的表达，这种情况称为位置效应（position effect）有两种情况，
6、（1）外源基因插入染色体中高度甲基化的区域或异染色质区，外源基因的甲基化而导致基因沉默。（2）外源基因的碱基组成与整合区域的不同而被受体细胞的防御系统所识别，不进行转录使基因沉默。Green fluorescent protein(GFP)GFP sources from jellyfish Aequorea victoria GFP as a new vital reporter in plant for detection in living cell by light at 395 or 470 nm Small molecular(26.9 KD)and fusion at both
7、N-and C-terminal provide protein localization and intercellular protein traffickingTransgenic Barley,2N=14 Seeding of line GFP expression on root tips in different transgenic barley linespc nc I+Anc I pc+EDpc nc IAmplified PCR with GFP primers for transgenic barley Molecular analysis of T1 generatio
8、n for gfp geneCA1A3A2DF1F2CEIgri GFP expression and inheritance on pollen in T1 and T2 generation5S5S7L7LLine EFluorescent in situ hybridization Physical location of GFP on chromosomes5S5S7L7L66 Fluorescent in situ hybridization in line F Physical location of gfp insert on chromosomes in different t
9、ransgenic barley plants by FISH 74.734.2435.963.3860.283.539.013.4289.559.539.552.46Discussion Number of insert on chromosome results in brighter GFP expression Gene silence happened in line D Line E and line F are same transformed plants with GFP Preferential integration for insert located on middl
10、e and terminal region of chromosomes3DNA甲基化 DNA甲基化是植物发育分化过程中调控基因表达的手段之一，DNA甲基化也是植物细胞最常用的防御外来遗传物质入侵的现象，它可以识别与植物基因组DNA序列组成不同的外源基因并对其甲基化，引起基因沉默。DNA 甲基化主要发生在基因的5端的启动子区域，阻碍转录因子与启动子的结合，从而引起转录抑制。DNA甲基化引起的外源基因沉默可以被逆转，利用去甲基化试剂可以恢复外源基因的表达。转录后水平的基因沉默转录后水平的基因沉默 这类沉默是RNA-RNA的关系，基因的启动子（promoter）是活跃的，基因能转录，但不能积累。因
11、转基因和内源基因有很大程度的同源性而抑制了内源基因的表达，这一现象在植物中称共抑制（cosuppression）。1 RNA与阈值 转基因产生大量的RNA而超过一个正常的标准或阈值（threshold），将激活RNA依赖性的RNA聚会酶以此转录物为模板合成配对的RNA，结果促使同源RNA（不管其来源）的去除，而造成RNA不能积累。这一现象通过对病毒抗性得到支持，如转基因植株高表达转基因mRNA但不能积累，但对同源RNA病毒的抗性提高，反之具较低水平转录，对RNA 病毒侵染却是敏感的。2甲基化PTG S情况下的甲基化，启动子仍活跃和正常转录。常见转基因编码区的上、下游都被甲基化，转录产物通常缩短
12、了，即甲基化的部分转录受阻。RNA指导的DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation），在转基因烟草中发现有3-4个顺序排列的viroid cDNA被甲基化，这种甲基化不是转基因的重复所产生，而是 viroid RNA的作用。由于viroid cDNA和viroid RNA接触后使cDNA产生了甲基化，这种DNA-RNA的相互作用可能有利于DNA甲基化酶的作用。3异位配对和异常RNA当病毒和转入的外源基因内部有同源序列，或者外源基因与内源基因之间有同源序列时，往往会导致异位配对（ectopic pairing），其结果是转录产生异常RNA（aberrant RNA，a
13、RNA）。aRNA一旦产生并进入细胞质后，就会激活依赖于RNA的RNA聚合酶的活性，该酶以aRNA为模板合成大量的20-30bp的互补RNA（complementary RNA，cRNA），这些cRNA与同源的mRNA相遇就配对形成部分双链结构dsRNA，而后被双链特异性的Rnase识别降解。内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合而被降解。外源基因的导入最终导致内源和外源基因的表达共同受阻，即共抑制。4反义RNA 外源基因的转录可能形成反义RNA，反义RNA与靶mRNA互补形成双链而被降解。使细胞内完整的mRNA含量降低，导致内外源基因的沉默。TGS与PTGS其实两者并非完全独立，两者可通
14、过RNA-DNA互作保持联系。上述的RNA指导的DNA甲基化就是他们之间联系的例子，RNA特异性地与靶DNA配对，形成RNA-DNA双螺旋，引起 RNA指导的DNA甲基化的程度提高，从而发生转基因沉默。三、转基因沉默的消除途径三、转基因沉默的消除途径农杆菌介导的转化法常产生低拷贝或单拷贝的整合方式，而DNA直接转化则产生多拷贝的整合方式。但农杆菌介导要比DNA直接介导受宿主或受体基因型的限制大。通过基因枪法将仅含基因表达盒（启动子、开放阅读框、终止子）的线性DNA片段导入植物基因组。1转基因方法的改进2启动子及基因的构建外源基因由于其碱基组成与宿主基因组不同，尤其是整合位点处的不同，常引起甲基
15、化而关闭基因的表达。因此，要尽量采用植物偏爱的密码子而适合与植物基因组的碱基组成。使导入的DNA序列在结构上与宿主基因组保持一致，降低宿主基因组防御系统的识别能力。利用基因组核基质结合序列（matrix attachment region,MAR）结构促进转基因的整合。MAR序列亦称核骨架结合区（scaffold-attachment region，SAR）,是与核基质结合的一段DNA序列，富含AT并具有拓扑异构酶II的切点，它不编码任何功能蛋白。核基质核基质是存在于细胞核中主要由蛋白质构成的网状结构，细胞核中染色质纤维与核基质结合形成染色质的高级结构而实行其遗传功能。3核基质序列转化将MAR
16、连接在转基因的两侧导入植物后，两个MAR的连接使转基因作为一个转录单元与周围DNA区域隔离，形成独立稳定不受周围宿主染色质抑制的区域，避免位置效应。在以农杆菌和基因枪转化的烟草、拟南芥、水稻和大麦等植物中发现外源基因的整合靶点附近存在MAR序列，说明MAR可能以某种方式提供外源基因的整合热点,使目的基因的导入具有一定的方向性。可能是染色体蛋白如组蛋白Hl等能选择性地与MAR序列结合，保护了外源DNA，刺激整合过程，甚至帮助外源基因定位到基因组的活性区域。利用大豆的P1-MAR序列（520bp）和矮牵牛的TBS-MAR（516bp）构建载体，通过基因枪转化大麦，提高了2倍的转化频率。而且MAR的
17、存在使转基因拷贝数减少，表达无位置效应，表达差异减少。利用烟草的MAR(Rb7)和酵母的MAR（ARS1)通过基因枪共转化水稻，具有MAR的转化子在T0代明显提高GUS表达，其中Rb7明显改进了基因表达的稳定性。苏金等（1999）将MARs构建在转基因GUS的两侧，发现其表达活性比没有MAR的高900倍。MAR存在时gus基因的表达随转基因拷贝数而增加，20以上时表达下降。Gus表达与MAR的结构相关，高表达需要MAR结构4去甲基化试剂的使用 利用去甲基化试剂二羟基丙基腺嘌呤或5-氮胞苷处理可使转基因序列非编码区大约30%的胞嘧啶去甲基化，转基因的表达水平提高12倍。但该类药物对植物将产生一定
18、的不利影响，因此在使用时在方法、用量、时间等方面要注意。5利用特异性的重组系统 利用噬菌体P1 Cre-lox、酿酒酵母FLP-FRT位点特异重组系统，可以将外源基因以单拷贝、位点特异的方式整合到事先整合有lox，FRT位点的植物上,不产生重复。四、转基因沉默的应用四、转基因沉默的应用1作物遗传育种 通过反义RNA与其同源的内源基因转录的正义RNA配对形成双链RNA并使之降解而使内源基因沉默，达到人们抑制植株某一内源基因表达的目的。如水稻中降低直链淀粉含量就是通过反义RNA技术。利用病毒外壳蛋白基因的转化，转基因转录的RNA与外源侵染的RNA病毒通过RNA的配对互补，抑制外壳蛋白的形成或抑制病
19、毒的脱壳，达到抑制病毒增殖来抗病毒。2功能基因组学上的应用 可以有目的有选择性地抑制某一内源基因序列的活性，从而知道这一DNA序列在植株基因组中的功能。3生理生化代谢研究 利用共抑制效应可以抑制植物代谢某一关键酶的活性而中断或减少该代谢循环，从而使某种代谢产物在代谢过程中积累，得到高产量的代谢产物而方便地进行研究。综述题（课程开卷考试部分）1 基因克隆方法的理论及应用2 基因工程中的载体类型、要求3 转基因沉默机制的研究4 生物技术安全性及其对策5 转基因方法的比较及应用6 突变体库的构建方法及比较7 基因文库的构建方法及比较各人选择上述任一题进行综述，按发表文章格式撰写，字数不要超过6000字，并在7月底前以Word文件（文件名：姓名学号）形式送至如下地址：此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢