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1、食品微生生物检验验方法（FFDA与与ISOO对比）内容提要要：l 菌落总数数检测l 大肠菌群群及大肠肠杆菌检检测l 金黄色葡葡萄球菌菌检测l 沙门氏菌菌检测l 单核细胞胞增生李李斯特氏氏菌检测测菌落总数数测定菌落落总数的的概念l 菌落总数数是指在在被检样样品的单单位重量量（g）、容容积（mml）或或表面积积（cmm2）内，所所含能于于某种固固体培养养基上，在在一定条条件下培培养后所所生成的的菌落的的总数。菌落总数数测定卫生生学意义义l 判定食品品被细菌菌污染的的程度及及卫生质质量。l 及时反映映食品加加工过程程是否符符合卫生生要求，为为被检食食品卫生生学评价价提供依依据。l 通常认为为，食品品
2、中细菌菌数量越越多，则则可考虑虑致病菌菌污染的的可能性性越大，菌菌落总数数的多少少在一定定程度上上标志着着食品卫卫生质量量的优劣劣。FDA BAMM 菌落落总数测测定流程程检样xgg/mLL+9xxml稀稀释液（磷磷酸盐缓缓冲液）适当十倍倍稀释样样品选择23个连连续适宜宜稀释度度各取1mmL分别别加入灭灭菌平皿皿内（每个稀稀释度做做两个平平行）每皿内加加入适量量平板计计数琼脂脂（PCCA）35 488 2hh菌落计数数FDA BAMM 菌落落计数方方法l 选择2552550CFFU之间间的菌落落进行计计数，计计算公式式如下： N=C/（1*nn1+0.1*nn2）*dl 所有平板板的菌落落数都
3、不不足255CFUU，报告告EAPPC/mml（g）为25*1/dd。 EAAPC：esttimaatedd aeerobbic plaate couuntl 所有平板板的菌落落数都超超过2550CFFU，但但不足1100/ccm2，报告告EAPPC/mml（g）为最最接近2250CCFU的的平板菌菌落数的的估计值值，乘以以相应的的稀释度度。l 所有平板板的菌落落数都超超过1000/ccm2，计算算平板的的面积（直直径为990mmm的平板板面积为为65ccm2），估估计最高高稀释度度每cmm2的菌落落数，乘乘以相应应平板面面积作为为该稀释释度的菌菌落计数数结果，报报告EAAPC/ml（g）为6
4、5*1000* 11/d。l 无法计数数的平板板报告LLA（Labboraatorry AAcciidennt）。l 最终结果果保留前前两位有有效数字字。按照照4舍6入，5是奇进进偶不进进。ISO448333-20003 菌落总总数测定定流程检样xgg/mLL+9xxml稀稀释液（磷磷酸盐缓缓冲液）适当十倍倍稀释样样品选择23个连连续适宜宜稀释度度各取1mmL分别别加入灭灭菌平皿皿内（每个稀稀释度做做两个平平行）每皿内加加入适量量（122155mL）平板计数数琼脂（PCA），3011 ，72 3 hh菌落计数数ISO448333-20003菌菌落计数数方法l 选择连续续2个稀释释度不超超过30
5、00CFFU的平平板，且且一个平平板至少少含155CFUU进行计计数，计计算公式式如下： N=C/（n1+0.1*nn2）*dl 所有平板板的菌落落数都不不足155CFUU，计算算2平板菌菌落的算算术平均均值m，液体体样品：NE=m固体体样品： NE=md-1l 无菌生长长：液体体样品：lesss tthann 1; 固固体样品品：leess thaan 11 d-1l 最终结果果保留前前两位有有效数字字。菌落总数数测定几几点说明明l 由于检样样中采用用30/35有氧条条件下培培养，因因而并不不是样品品中实际际的总活活菌数，一一些特殊殊营养要要求的细细菌、厌厌氧菌、微微需氧菌菌、以及及非嗜中中
6、温细菌菌，均难难以反映映出来。l 鉴于食品品检样中中的细菌菌细胞是是以单个个、成双双、链状状、葡萄萄状或成成堆的形形式存在在，因而而在平板板上出现现的菌落落可以来来源于细细胞块，也也可以来来源于单单个细胞胞，因而而平板上上所得菌菌落的数数字不应应报告活活菌数，而而应以单单位重量量、容积积或表面面积内的的菌落数数或菌落落形成单单位（ccoloony forrminng uunitts，CFUU）报告告。菌落总数数测定几几点要求求l 每个样品品从开始始稀释到到倾注最最后一个个平皿所所用的时时间不得得超过115miin，主主要为防防止细菌菌增殖和和产生片片状菌落落。样液液与琼脂脂应充分分混合，避避免
7、将混混合物溅溅到平皿皿壁和皿皿盖上。皿皿内琼脂脂凝固后后，不要要长时间间放置，然然后倒置置培养，可可避免菌菌落蔓延延生长。l 检样过程程中应用用稀释剂剂做空白白对照，用用以判定定稀释液液、培养养基、平平皿或吸吸管可能能存在的的污染。同同时，检检样过程程中应在在工作台台上打开开一块空空白平板板计数琼琼脂，其其暴露时时间应与与检样时时间相当当，以了了解检样样在检验验操作过过程中有有无受到到来自空空气的污污染。l 检样稀释释液有时时带有食食品颗粒粒，为避避免与细细菌菌落落发生混混淆，可可作一检检样稀释释液与平平板计数数琼脂混混合的平平皿，不不经培养养，于44 放置，以以便在计计数检样样时用作作对照。
8、大肠菌群群的定义义l 大肠菌群群系指一一群能发发酵乳糖糖、产酸酸产气、需需氧和兼兼性厌氧氧的革兰兰氏阴性性无芽孢孢杆菌。l 大肠菌群群不是细细菌学上上的分类类命名，而而是根据据卫生学学方面的的要求，提提出的与与粪便污污染有关关的细菌菌，即作作为食品品、水体体等是否否受过人人畜粪便便污染的的指示菌菌，这些些细菌在在生化及及血清学学方面并并非完全全一致。根根据进一一步的生生化试验验，可将将这群细细菌再分分为大肠肠艾希氏氏菌（俗俗称大肠肠杆菌）、弗弗氏柠檬檬酸杆菌菌、肺炎炎克雷伯伯氏菌和和阴沟肠肠杆菌等等。大肠杆菌菌的定义义l 大肠杆菌菌（也称称大肠埃埃希氏菌菌），分分类于肠肠杆菌科科，归属属于埃希
9、希氏菌属属。l 大肠杆菌菌指革兰兰氏阴性性无芽孢孢杆菌、乳乳糖发酵酵产酸产产气、IIMViiC试验验（靛基基质、MMR、V-PP、柠檬檬酸盐试试验）为为+-或-+-的细细菌。l 与人类有有关的大大肠杆菌菌统称为为致泻性性大肠杆杆菌，包包括五种种：肠毒毒素性大大肠杆菌菌（ETTEC）、致致病性大大肠杆菌菌（EPPEC）、出出血性大大肠杆菌菌（EHHEC）、侵侵袭性大大肠杆菌菌（EIIEC）、黏黏附性大大肠杆菌菌（EAAEC）。卫生学意意义l 大肠菌群群和大肠肠杆菌是是评价卫卫生质量量的重要要指标，作作为食品品中的粪粪便污染染指标。l 食品中检检出大肠肠菌群，表表明该食食品有粪粪便污染染，既可可能
10、有肠肠道致病病菌存在在，因而而也就有有可能通通过污染染的食品品引起肠肠道传染染病的流流行。大大肠菌群群数的高高低，表表明了粪粪便污染染的程度度，也反反映了对对人体健健康危害害性的大大小。l 大肠杆菌菌在外界界存活时时间与一一些主要要肠道致致病菌接接近，它它的出现现预示着着某些肠肠道病原原菌的存存在，因因此该菌菌是国际际上公认认的卫生生监测指指示菌。近近年来，有有些国家家在执行行HACCCP管管理中，将将大肠杆杆菌检测测作为微微生物污污染状况况的监测测指标和和HACCCP实实施效果果的评估估指标。大肠杆菌菌的生物物学特性性基本形态态：此菌为两两端钝圆圆的短小小杆菌，一一般约00.5-0.88m*
11、11.0-3.00 m，多单单独存在在或成双双，但不不呈长链链排列。约约50%的菌株株有周生生鞭毛，但但多数只只有1-4根，一一般不超超过100根，故故菌体动动力弱。多多数菌株株有菌毛毛，有的的有荚膜膜或微荚荚膜，不不形成芽芽孢，对对普通碱碱性染料料着色良良好，革革兰氏染染色阴性性。培养特性性：l 大肠杆菌菌合成代代谢能力力强，在在含无机机盐、铵铵盐、葡葡萄糖的的普通培培养基上上生长良良好。最最适生长长温度为为37，在422-444 条件下下仍能生生长，生生长温度度范围115-446 。大肠菌群群及大肠肠杆菌测测定 MMPN法法检验流流程（FFDA BAMM）检样500g+4450mml稀释释
12、液适当十倍倍稀释样样品选择3个个适宜的的连续稀稀释度的的样品稀稀释液，每个稀释释度接种种三管LLST肉肉汤（每每管9mmlLSST肉汤汤并加有有导管），每管接种种1mLL35，24 2hh 448 2hh没有产气气管有产产气管报告阴性性接种BGGLB肉肉汤管接接种ECC肉汤44.550.55 （水浴浴培养）24 2hh 448 2hh查MPNN表报告告结果产产气管接接种EMMB平板板（355、1824hh）（大肠菌菌群）从从EMBB平板上上挑取55个可疑疑菌转接接到PCCA斜面，进行行革兰氏氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气查MPNN表报告告结果（大大肠杆菌菌）大肠菌群群测定MPPN
13、法检检验几点点说明l MPN检检索表： MMPN检检索表只只给了三三个稀释释度，如如改用不不同的稀稀释度，则则表内数数字应相相应降低低或增加加10倍。l 初发酵和和证实试试验： 1）两两步法进进行了两两次乳糖糖发酵试试验。初初发酵和和证实实实验所用用培养基基不同，但但都是为为了证实实培养物物是否符符合大肠肠菌群的的定义，即即“在37分解乳乳糖产酸酸产气”。 2）初初发酵阳阳性管，不不能肯定定就是大大肠菌群群细菌，经经过证实实试验后后，有时时可能成成为阴性性。有数数据表明明，食品品中大肠肠菌群检检验步骤骤的符合合率，初初发酵与与证实试试验相差差较大。因因此，在在实际检检测工作作中，证证实试验验是
14、必需需的。l 产气量与与倒管：在乳糖发发酵试验验工作中中，经常常可以看看到在发发酵倒管管内极微微少的气气泡（有有时比小小米粒还还小），有有时可以以遇到在在初发酵酵时产酸酸或沿管管壁有缓缓缓上浮浮的小气气泡。实实验表明明，大肠肠菌群的的产气量量，多者者可以使使发酵倒倒管全部部充满气气体，少少者可以以产生比比小米粒粒还小的的气泡。如如果对产产酸但未未产气的的乳糖发发酵如有有疑问时时，可以以用手轻轻轻打动动试管，如如有气泡泡沿管壁壁上浮，即即应考虑虑可能有有气体产产生，而而应作进进一步试试验。大肠杆菌菌测定EMMB选择择性分离离鉴别EMB平平板典型型大肠杆杆菌菌落落特征：中心黑色色或紫红红色，有有或
15、无绿绿色金属属光泽大肠杆菌菌测定EMMB选择择性分离离鉴别l EMB是是一种弱弱选择性性培养基基，一些些球菌也也可在该该培养基基上生长长；l 高压灭菌菌可使得得美蓝还还原从而而使培养养基的颜颜色呈不不均一橘橘黄色，轻轻轻摇动动培养基基可以恢恢复原有有的正常常紫色，倾倾注平板板前应先先摇匀；l 大肠杆菌菌在该培培养基上上并不一一定总是是呈现绿绿色的金金属光泽泽；l 该培养基基受可见见光易使使其中的的成分氧氧化，储储存及培培养细菌菌时都应应在避光光条件。大肠杆菌菌测定革兰兰氏染色色基本步骤骤：l 将涂片在在火焰上上固定，滴滴加结晶晶紫染液液，染11minn，水洗洗；l 滴加革兰兰氏碘液液，作用用1
16、miin，水水洗；l 滴加955%乙醇醇脱色约约1530ss,直至至染色液液被洗掉掉，不要要过分脱脱色，水水洗；l 滴加番红红复染液液，复染染1miin，水水洗、待待干、镜镜检。l 结果：革革兰氏阳阳性菌呈呈紫色，革革兰氏阴阴性菌呈呈红色。大肠杆菌菌测定生化化鉴定（表略）金黄色葡葡萄球菌菌概述述l 根据伯伯杰氏鉴鉴定细菌菌学手册册，按按葡萄球球菌的生生理化学学组成，将将葡萄球球菌分为为金黄色色葡萄球球菌(Staaphyyloccocccus aurreuss)、表皮皮葡萄球球菌(S. epiiderrmiddis)和腐生生葡萄球球菌(S. sappropphytticuus)，其中中金葡多多为
17、致病病性菌，表表葡偶尔尔致病。l 金黄色葡葡萄球菌菌是人类类化脓性性感染中中最常见见的病原原菌。可可引起局局部化脓脓性感染染，如疖疖、痈、皮皮下脓肿肿、外科科切口及及烧伤创创面的感感染；也也可引起起肺炎、伪伪膜性肠肠炎、肾肾盂肾炎炎、心包包炎等多多系统的的化脓性性感染；还可引引起败血血症、脓脓毒症等等全身性性感染。葡葡萄球菌菌的致病病力强弱弱主要取取决于其其产生的的毒素和和侵袭性性酶。金黄色葡葡萄球菌菌生物物学特性性金黄色葡葡萄球菌菌呈球形形，直径径0.88m左右，排排列成葡葡萄串状状，无芽芽孢，无无荚膜。金黄色葡葡萄球菌菌生长长特性l 金黄色葡葡萄球菌菌在肉汤汤中呈浑浑浊生长长，在胰胰酪胨大
18、大豆肉汤汤内有时时液体澄澄清，菌菌量多时时呈浑浊浊生长。金黄色葡葡萄球菌菌检验方法法适用性性l MPN法法：适用用于检测测带有大大量竞争争菌的食食品及其其原料和和未经处处理的含含少量金金黄色葡葡萄球菌菌的食品品。l 直接平板板计数法法：适用用于检查查金黄色色葡萄球球菌数不不小于110/gg（ml）的的食品。l 增菌培养养法：适适用于检检查含有有受损伤伤的金黄黄色葡萄萄球菌的的加工食食品。金黄色葡葡萄球菌菌检验直接接平板计计数法（FDAA BAAM &ISOO）检样（550g+4500mL稀稀释液）适当十倍倍稀释样样品选择23个连连续适宜宜稀释度度吸取1mml菌液液按照00.3mmL、0.33m
19、L、0.44mL分分别涂布布于3块900mmBBairrd-PParkker平板板上（做做平行试试验）35，4548 h确证试验验报告FDA BAMM 金黄黄色葡萄萄球菌检检验MPNN法检样（550g+4500mL稀稀释液）适当十倍倍稀释样样品选择3个个适宜的的连续稀稀释度的的样品稀稀释液，每个稀释释度接种种三管110% NaCCl TTSB肉肉汤，每管接种种1mLL35，48 2 hh从生长的的管中接接种1环划线线于 BBairrd-PParkker平平板上35，48 h确证试验验报告FDA BAMM 金黄黄色葡萄萄球菌确确证试验验1.凝固固酶试验验l 方法：从从平板上上至少挑挑取1个可疑疑
20、金黄色色葡萄球球菌菌落落，移种种到TSSB/BBHI肉肉汤中，置置35培养188-244h。取取肉汤培培养物00.3mmL同0.55mL凝凝固酶试试验兔血血浆充分分混合，置置35培养，定定时观察察是否有有凝块形形成，至至少观察察6h。试验中中需同时时做已知知阳性和和阴性对对照。l 结果判定定：以内内容物完完全凝固固，使试试管倒置置或倾斜斜时不流流动为阳阳性。部部分凝固固（2+和3+）的的必须进进行生化化鉴定加加以证实实。FDA BAMM金黄色色葡萄球球菌确证证试验2.革兰兰氏染色色l 对所有的的可疑培培养物都都要进行行革兰氏氏染色。3.生化化鉴定l 过氧化氢氢酶试验验l 葡萄糖厌厌氧利用用试验
21、l 甘露醇厌厌氧利用用试验l 金葡溶菌菌酶敏感感性试验验l 耐热核酸酸酶试验验（辅助助）ISO 金黄色色葡萄球球菌检验验MMPN法法检样（xxg+99xmLL稀释液液）适当十倍倍稀释样样品选择3个个适宜的的连续稀稀释度的的样品稀稀释液，每个稀释释度接种种三管modiifieed GGiollittti aand Canntonni bbrotth，37，2448 h从变黑或或出现黑黑色沉淀淀的管中中接种1环环培养物物于 BBairrd-PParkker平平板上37，48 h确证试验验报告沙门氏菌菌属简介介l 18800年E. Berrth首首先发现现伤寒沙沙门氏菌菌，18885年年Sallmo
22、nn与Smiith又又分离出出猪霍乱乱沙门氏氏菌，以以后取SSalmmon氏氏之名为为本菌属属之名。l 沙门氏菌菌属是一一群符合合肠杆菌菌科定义义并与其其血清学学相关的的革兰氏氏阴性、需需氧性、无无芽孢杆杆菌。本本菌属种种类繁多多，抗原原结构复复杂，现现已发现现20000多个个血清型型，我国国已发现现血清型型近2000个。沙门氏菌菌属生物学学特性形态特征征：革兰氏阴阴性，大大小为1130.440.9m的两端端钝圆的的短杆菌菌，无芽芽孢，一一般无荚荚膜，除除鸡沙门门氏菌和和雏沙门门氏菌以以外，都都有周身身鞭毛，运运动力强强。培养特性性：l 沙门氏菌菌需氧或或兼性厌厌氧，110-442 都可生生长
23、，最最适生长长温度为为37，最适适pH为6.887.8。l 营养琼脂脂平板上上：355377培养188244h，其其菌落大大小一般般为23mmm，光滑滑、湿润润、无色色、半透透明、边边缘整齐齐。l 血平板上上：中等等大小的的灰白色色菌落。沙门氏菌菌属的抗抗原l 菌体抗原原（O抗原）l 表面抗原原（K抗原）：Vi抗原原和M抗原l 鞭毛抗原原（H抗原）l 纤毛抗原原FDA BAMM沙门氏氏菌检验验流程前增菌225g样样+2225mLL乳糖肉肉汤（肉肉制品、肉肉副产品品、动物物产品）匀质2mmin，室室温放置置60 5miin混合均匀匀，测定定调节PPH6.8 0.2235、24 2hh选择性增增菌
24、0.1mml+110mllMM（RV） 1mml+110mllTTBB42、24hh（水浴培培养）335、24hh 443、24hh（水浴浴培养）含菌量高高含菌量量低分离培养养划线接接种选择择性培养养基（BBS、XLDD、HE）35、2448hh（BS）生化鉴定定每个平平板挑取取至少22个可疑疑菌（包包括典型型和非典典型各22个）接种TSSI三糖糖铁、LLIA赖赖氨酸铁铁高层斜斜面（LLIA高高层深44cm）（松盖以以保持有有氧条件件防止产产生过多多H2S）35、242h弃去尿素素酶试验验卫矛醇醇、氰化化钾、丙丙二酸钠钠、吲哚哚试验阳性阴性性血清学血血清学试试验沙门氏氏菌的分分类报告结果果IS
25、O665799沙门氏氏菌检验验流程前增菌225g样样+2225mLLBPWW匀质3711、18 2hh选择性增增菌0.1mml+110mllRVSS 11ml+10mmlMKKTTnn41.55 1、24 3h 337 1、24 3hh（水浴培培养）分离培养养划线接接种选择择性培养养基（XXLD和和第二种种选择性性培养基基，如 BS）37、2448hh（BS）每个平板板挑取至至少5个可疑疑菌进行行纯培养养和确认认试验37、243h生化鉴定定 TTSI、尿尿素酶、赖赖氨酸脱脱羧酶、-牛乳糖、V-P、吲哚试验血清学血血清学试试验沙门氏氏菌的分分类报告结果果沙门氏菌菌检验选选择性分分离培养养XLD琼
26、琼脂：FDA BAMM典典型菌落落：粉色色菌落，带带或不带带黑色中中心。许许多沙门门氏菌培培养物可可呈现大大的具光光泽的黑黑色中心心或几乎乎为全部部黑色的的菌落。 非非典型菌菌落：黄黄色带或或不带黑黑色中心心。ISO中心心黑色、周周围由于于指示剂剂颜色的的改变而而出现红红色的轻轻微透明明带。菌名菌落形态态鼠伤寒沙沙门氏菌菌 红色，有有黑心伤寒沙门门氏菌红色，有有黑心弗氏志贺贺氏菌红色大肠埃希希氏菌 黄色，有有胆盐沉沉淀环粪链球菌菌 -沙门氏菌菌检验选选择性分分离培养养BS琼脂脂：FDA BAMM典典型菌落落：产硫硫化氢菌菌落黑色色有金属属光泽、棕棕褐色或或灰色，菌菌落周围围的培养养基通常常开始
27、呈呈褐色，但但伴随培培养时间间的延长长而变为为黑色，并并有晕环环效应；非典典型菌落落：有些些菌株不不产生硫硫化氢，形形成灰绿绿色菌落落，周围围培养基基不变色色。沙门氏菌菌检验选选择性分分离培养养HE琼脂脂：FDA BAMM典典型菌落落：兰绿绿色至兰兰色，多多数菌株株产硫化化氢，菌菌落带或或不带黑黑色,中心或或几乎全全黑色。 非非典型菌菌落：乳乳糖阳性性的菌株株为黄色色中心黑黑色或全全黑色。沙门氏菌菌检验生生化鉴定定TSI：典型反应应：斜面面产碱（K）：红色；底部产酸（A）：黄色；产H2S：黑色（少数不产）沙门氏菌菌检验几点点注意l 冷冻样品品解冻需需在455以下，有有自动调调温器自自控的水水浴
28、锅内内不断搅搅拌进行行15mmin或或在2-8，18小时时内软化化。 为保证检检验的准准确性，必必须在选选择性培培养基上上挑取足足够数量量的菌落落进行生生化和血血清学鉴鉴定。l 进行生化化反应时时，应以以纯培养养物进行行试验，如如出现血血清学阳阳性，而而生化反反应特征征不符合合时，应应对接种种物进行行纯化，用用纯化后后的培养养物重新新进行生生化试验验。 测试中应应同时接接种阳性性对照菌菌株。李斯特菌菌属简介介l 伯杰氏氏鉴定细细菌学手手册第第9版中，李李斯特菌菌属有77个种：单单核细胞胞增生李李斯特氏氏菌（LL. mmonoocyttogeeness）、英英诺克李李斯特氏氏菌（LL. iinn
29、oocuaa）、西尔尔李斯特特氏菌（L. seeligeri）、威尔斯李斯特氏菌（L. welshimeri）、绵羊李斯特氏菌（L. ivanovvi）、格氏李斯特氏菌（L. grayi）、默氏李斯特氏菌（L. murrayi）。l 单核细胞胞增生李李斯特氏氏菌是李李斯特氏氏菌病的的致病菌菌，可引引起动物物的感染染，也可可引起人人的感染染。单核细胞胞增生李李斯特氏氏菌生物学学特性形态特征征：革兰氏阳阳性短杆杆菌，大大小为00.40.550.552m，两端钝钝圆，常常两两相相串成弯弯曲及VV形，偶偶尔有球球状、双双球状、短短链状，但但很少有有长链状状，兼性性厌氧、无无芽孢，一一般不形形成荚膜膜。
30、该菌菌有4根周毛毛和1根端毛毛，周毛毛易脱落落。200培养后后可见到到很多鞭鞭毛。培养特性性：l 生长温度度为242（冷藏藏不能阻阻止该菌菌的生长长），最最适生长长温度为为3537。2025 培养有有动力，37 培养动力消失；在显微镜下观察该菌新鲜的室温肉汤培养物可见翻筋斗运动。l 在pH33.84.44仍能生生长，在在pH中性性至弱碱碱性（99.6）、氧氧分压略略低、二二氧化碳碳张力略略高的条条件下该该菌生长长良好，在在6.55%NaaCl肉肉汤中也也能良好好生长。l 血平板上上：菌落落通常不不大呈灰灰白色，刺刺种血平平板可产产生窄小小的溶血环环。FDA BAMM单核细细胞增生生李斯特特氏菌
31、检检验流程程检样255g增菌 EB增增菌液基基础2225mLL30 44h加入抑菌菌剂30 220h 30 44hh选择性分分离培养养接种OXXA和 PAALCAAM 接种OXXA和 PAALCAAM35 224-448h335 24-48hh生化鉴定定TSAA-YEE纯培养养30 24-48hh典型运动动TSBB-YEE过氧化氢氢酶试验验硝酸盐还原试验SIM动力麦芽糖葡萄糖七叶苷鼠李糖木糖甘露醇革兰氏染染色溶血试验验ISO单单核细胞胞增生李李斯特氏氏菌检验验流程测试样品品（x g或x mmL）+9xx mLL一次增增菌培养养基（HHalff Frraseer肉汤汤）30培培养2442h1mL
32、培培养液加加入划线线接种OOxfoord琼琼脂10mLL二次增增菌培养养基中和和PALLCAMM琼脂（Fraaserr肉汤）35或或37培养4882h 300、35或37培培养244-488h划线接种种Oxffordd琼脂和PALLCAMM琼脂30、35或37培养244-488h李斯特菌菌属的确确证： 挑挑取可疑疑菌接种种TSAAYE培培养基过氧化氢氢酶试验验革兰氏染染色动力试验验单核细胞胞增生李李斯特菌菌的确证证： 溶溶血试验验碳碳源利用用试验 CAMMP（协协同溶血血）试验验单核细胞胞增生李李斯特氏氏菌溶血试试验l 制备57%羊羊血琼脂脂平板。l 挑取TSSAYEE平板上上的典型型菌落刺刺
33、种血平平板，刺刺种时避避免接触触到平板板底部和和使琼脂脂破裂，同同时接种种阳性（单单核细胞胞增生李李斯特氏氏菌）和和阴性（英英诺克李李斯特氏氏菌）对对照。l 单增呈现现狭窄、清清晰、明明亮的-溶血；l 西尔李氏氏菌出现现弱的溶溶血现象象；l 绵羊李氏氏菌通常常呈宽的的、轮廓廓清晰的的-溶血；l 英诺克李李氏菌不不产生溶溶血现象象。单核细胞胞增生李李斯特氏氏菌协同溶溶血试验验（CAAMP）l 方法：在在羊血琼琼脂平板板上平行行接种-溶血金金黄色葡葡萄球菌菌（S.aurreuss）和马马红球菌菌(R.equui),在它们们中间垂垂直划线线接种可可疑菌，与与两线相相近但不不相交，在在30培养244h
34、-448h,检查平平板中垂垂直接种种点对溶溶血环的的影响。l 结果：靠靠近金黄黄色葡萄萄球菌接接种点的的单增李李斯特氏氏菌的溶溶血增强强，西尔尔李斯特特氏菌的的溶血也也增强，绵绵羊李斯斯特氏菌菌在马红红血球附附近的溶溶血增强强。ISO李李斯特氏氏菌鉴定定反应种别溶血性产酸CAMPP试验鼠李糖木糖金黄色葡葡萄球菌菌马红球菌菌L.moonoccytoogennesL. iinnoocuaaL. iivannovvviL. sseelligeeriL. wwelsshimmeriiL. ggrayyiL. mmurrrayii+-+(+)-+v-v-v-+-+-(+)-+-v: vvatiiabll
35、e rreacctioon(+): weeak reaactiion+: 90% off poosittivee reeacttionn -: nno rreacctioonFDA李李斯特氏氏菌属的的区别种别溶血性毒力a糖发酵cc甘露醇鼠李糖木糖L.moonoccytoogennesL. iivannovvvi L. iinnoocuaa L. wwelsshimmeriiL. sseelligeeriL. ggrayyiL. mmurrrayii b+-+-+-+-vv-vv-+-+-a: mmousse ttesttv: vvariiablle bbiottypeesb: 硝硝酸盐还还原试
36、验验阳性，其其它种该该反应为为阴性。c: 葡葡萄糖、麦麦芽糖、七七叶苷糖糖发酵试试验全部部为阳性性。几种常用用稀释缓缓冲液介介绍l 磷酸盐缓缓冲液储备液的的制备：称取334g磷磷酸二氢氢钾溶解解于5000mll蒸馏水水中，用用1NNNaOHH溶液调整整pH值为为7.22，再用用蒸馏水水稀释至至10000mll，1211高压灭灭菌 15mmin，于于冰箱中中储存。稀释液的的制备：取1.25mml储备备液，用用蒸馏水水稀释至至10000mll，定量量分装，1221高压灭灭菌155minn备用。l 0.855%生理理盐水称取8.5gNNaCll溶解于于10000mll蒸馏水水中，定定量分装装，1221高压灭灭菌 15mmin备备用。l 0.1%蛋白胨胨水称取1gg蛋白胨胨溶解于于10000mll蒸馏水水中，定定量分装装，1221高压灭灭菌 15mmin备备用。蛋蛋白胨水水对细菌菌细胞有有更好的的保护作作用，不不会因为为在稀释释过程中使使检样中中原已受受损伤的的细菌细细胞导致致死亡。l 无菌水