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1、基因工程程复习归归纳第一章 绪论1.基因因工程的的定义：是指按按照人们们的愿望望，经过过严密的的设计，将将一种或或多种生生物体（供供体）的的基因与与载体在在体外进进行拼接接重组，然然后转入入另一种种生物体体（受体体/宿主主）内，使使之按照照人们的的意愿稳稳定遗传传、并表表达出新新的性状状的技术术。2.基因因工程概概念的发发展：遗传工工程DNAA重组技技术分子/基因克克隆（MMoleecullar/Genne基因工工程基因操操作。应用领领域以“基因工工程”、“DNAA重组”为主基因工程程基因工工程的历历史性事事件19733：Booyerr和Coohenn建立DDNA重重组技术术19788：Gee
2、nettechh公司在在大肠杆杆菌中表表达出胰胰岛素19822：世界界上第一一个基因因工程药药物重组组人胰岛岛素上市市19888：PCCR技术术诞生19899：我国国第一个个基因工工程药物物rhIIFN1b上上市20033: 世世界上第第一个基基因治疗疗药物重重组腺病病毒-pp53上上市3.基因因工程的的三大关关键元件件基因（供供体）：外源基基因、目目的基因因载体：能能将外源源基因带带入受体体细胞，并并能稳定定遗传的的DNAA分子（克克隆载体体、表达达载体）。宿主（受受体）：，能摄摄取外源源DNAA、并能能使其稳稳定维持持的细胞胞（组织织、器官官或个体体）。4.基因因工程的的基本步步骤（切、接
3、接、转、增、检检（大肠肠杆菌是是中心角角色）（1）目目的基因因的获取取：从复复杂的生生物基因因组中，经经过酶切切消化或或PCRR扩增等等步骤，分分离出带带有目的的基因的的DNAA片断。（2）重重组体的的制备：将目的的基因的的DNAA片断插插入到能能自我复复制并带带有选择择性标记记（抗菌菌素抗性性）的载载体分子子上。（3）重重组体的的转化：将重组组体（载载体）转转入适当当的受体体细胞中中。（4）克克隆鉴定定：挑选选转化成成功的细细胞克隆隆（含有有目的基基因）。（5）目目的基因因表达：使导入入寄主细细胞的目目的基因因表达出出我们所所需要的的基因产产物。第二章 DNAA重组克克隆的单单元操作作一、用
4、于于核酸操操作的工工具酶1.限制制性核酸酸内切酶酶(主要存存在于原原核细菌菌中，帮帮助细菌菌限制外外来DNNA的入入侵)。限制性核核酸内切切酶的功功能与类类型主要特征征I型II型III型型功能限切/修修饰限切限切/修修饰蛋白结构构异源三聚聚体单体异源二聚聚体辅助因子子ATP Mg22+ SSAMMg2+ATP Mg22+ SSAM识别序列列TGANN8TGCCTAACNN6GTGGC旋转对称称序列GAGCCCCAGCCAG切割位点点距识别序序列1kkb处识别序列列内距识别序序列下游游24-226bpp处其中III型限制制性核酸酸内切酶酶：切割割位点专专一，适适于DNNA重组组，是DDNA重重组
5、中最最常用工工具酶。特点：11.识别别、并切切割双链链DNAA分子中中特异序序列的DDNA内内切酶。2.识别别序列为为4-66碱基对对的回文文对称结结构（旋旋转对称称结构）。3.单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性。4.切割产物末端：5突出末端、3突出末端、平头末端.6.最适温度：大多为37,适盐浓度：高盐、中盐、低盐。8.当反应条件不适合时，识别和切割序列发生变化（星号反应）。星活性（sstarr acctivvityy）：在在极端非非标准条条件下，限限制酶能能切割与与识别序序列相似似的序列列，这个个改变的的特殊性性称星活活性。引起星活活性的因因素： 高浓浓度甘油油（55%）、 酶
6、过过量（1000U/mmg）、 低离离子强度度（pHH8.00)、 有机机溶剂、 用其其它二价价阳离子子代替MMg2+，如Mnn2+，CCu2+，Coo2+, Znn2+。II型限限制性核核酸内切切酶的命命名具体规则则是：以以生物体体属名的的第一个个大写字字母和种种名的前前两个小小写字母母构成酶酶的基本本名称，如如果酶存存在于一一种特殊殊的菌株株中，则则将株名名的一个个字母加加在基本本名称之之后，若若酶的编编码基因因位于噬噬菌体（病病毒）或或质粒上上，则还还需用一一个大写写字母表表示这些些非染色色体的遗遗传因子子。酶名名称的最最后部分分为罗马马数字，表表示在该该生物体体发现此此酶的先先后次序序
7、。例子：EEschheriichaa（属名名）cooli（种种名）RR （质质粒）大大肠杆菌菌R质粒粒EcooRI EEcoRRVHaemmophhiluus（属属名） infflueenzaae（种种名） d（株株名） 嗜血血流感杆杆菌d株株-HH i n dd IIIH i nn d IIII。罗罗马数字字表示同同一菌株株中所含含的多个个不同的的限制性性核酸内内切酶。特殊性质质的III型限制制酶：同同裂酶，同同尾酶同裂酶：又称异异源同序序酶或异异源同工工酶，是是指识别别位点与与切割位位点均相相同的不不同来源源的酶识识别相同同序列，如如HinndIIII HssuI: A / AAGCTTT
8、同尾酶：是指识别别位点不不同，但但切出的的片段具具有相同同的末端端序列的的一类酶酶，如BBglIII：A / GAATCTT；BammHI: G / GAATCCC。同尾酶酶的切割割产物互互为粘性性末端，并并能连接接，但连连接后二二个酶的的识别序序列均被被破坏。2.DNNA连接接酶（TT4-DDNA连连接酶）功能：体体外连接接片段常用的连连接酶： 连接酶酶参与连接接反应的的基团：端羟羟基和端磷酸酸基团，形形成磷酸酸二酯键键DNA连连接酶的的基本性性质 ：修复双双链DNNA上缺缺口处的的磷酸二二酯键、修复RRNA-DNAA杂合分分子中DDNA链链上缺口口处的磷磷酸二酯酯键、连连接多个个平头双双链
9、DNNA分子子T4 DDNA连连接酶的的活性单单位定义义：在 220l 反反应体系系中于 16 ，使使 Hiind 切过过的 ll DNNA （3300g/mml，00.122M 55 末末端）在在 300 分钟钟内连接接 500% 所所需的酶酶量为 1 个个 NEEB 单单位。3.DNNA聚合合酶大肠杆杆菌DNNA聚合合酶 II（ DDNA poll I ）基本性质质：1. 53的DNNA聚合合酶活性性 2.53的核酸酸外切酶酶活性 3.335的核酸酸外切酶酶活性大肠杆菌菌DNAA聚合酶酶 I 的基本本用途：1.切口口平移标标记法 2.NNickk trransslattionn 3.制备3
10、22P标记记的探针针。所有的的DNAA聚合酶酶中只有有此酶有有该反应应。缺口平平移标记记原理见见pptt。大肠杆菌菌DNAA聚合酶酶 I 大片段段（ KKlennow 酶）：大肠杆杆菌DNNA聚合合酶I经经枯草杆杆菌蛋白白酶处理理，获得得N端三三分之二二的大肽肽段，即即为Kllenoow酶。Kleenoww酶仍拥拥有53的DNNA聚合合酶活性性和35的核酸酸外切酶酶活性，但但失去了了53的核酸酸外切酶酶活性。Klennow酶酶的基本本用途：1. 补平由由核酸内内切酶产产生的55粘性末末端 22.DNNA片段段的同位位素末端端标记 3.ccDNAA第二链链的合成成 4.双脱氧氧末端终终止法测测定
11、DNNA序列列。T4-DNAA聚合酶酶基本特性性：1.53的DNNA聚合合酶活性性和35的核酸酸外切酶酶活性(极强) 2.在无ddNTPP时，可可以从任任何3-OHH端外切切 3.在四种种dNTTP均存存在时，聚聚合活性性占主导导地位基本用途途：1.切平由由核酸内内切酶产产生的33粘性末末端，该酶也也能降解解双链DDNA，只只是其活活性比单单链降解解活性低低很多。2.DDNA片片段的同同位素末末端标记记。依赖于于RNAA的DNNA聚合合酶（反反转录酶酶）基本用途途：1. 以RRNA为为模板合合成cDDNA链链 2.双向外外切DNNA-RRNA杂杂合链中中的RNNA链4.核酸酸酶单链核酸酸外切酶
12、酶：核酸酸外切酶酶VIII（ExxoVIII）；双链核核酸外切切酶：核核酸外切切酶 IIII（EExoIIII）；双链核核酸外切切酶：核酸外外切酶（Exo）【特异性地从5 端外切】；单链核酸内切酶：S1核酸酶【降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍，比降解单链RNA快7倍】5核酸酸修饰酶酶末端脱氧氧核苷酰酰转移酶酶（TddT）；碱性磷磷酸单酯酯酶【小小牛胸腺腺的碱性性磷酸单单酯酶（CCIP）&大肠杆杆菌的碱碱性磷酸酸单酯酶酶（BAAP）】；T4-多核苷苷酸磷酸酸激酶（TT4-PPNP）二、用于于克隆的的载体1. 载载体（VVecttor）：是把外外源DNNA（目目的基因因）导入入宿
13、主细细胞，使使之传代代、扩增增或表达达的工具具。载体应具具备的条条件： 1.具具有针对对受体细细胞的亲亲缘性或或亲和性性（可转转移性）22. 具具有与特特定受体体细胞相相适应的的复制位位点或结结合位点点3. 具有较较高的外外源DNNA的载载装能力力 4. 具有有多种单单一的核核酸内切切酶识别别切割位位点(多克隆隆位点 ) 55. 具具有合适适的筛选选标记2.载体体类型：（1）根根据主要要用途可可以分为为：克隆隆载体和和表达载载体克隆载载体：主主要用于于在大肠肠杆菌细细胞中克克隆目的的基因，或或在大肠肠杆菌或或酿酒酵酵母细胞胞中构建建基因文文库。克隆载体体关键元元件：A.多多克隆位位点 BB.筛
14、选选标记基基因 CC.复制制起始位位点表达载载体：除含基基因克隆隆所需元元件外，还还有供外外源基因因表达用用的启动动子、终终止子等等顺式元元件，用用于在特特定的宿宿主中表表达目的的基因。（2）按按传代特特性分：自主复复制型载载体：含含复制子子，可独独立于宿宿主染色色体外复复制与传传代（穿穿梭载体体：装有针针对两种种不同受受体的复复制起点点，便于于基因克克隆）。整合型型载体：不含复复制子，需需借助同同源重组组机制整整合于宿宿主基因因组。3.分子子克隆载载体常用用类型：（1）质质粒：115kbb以下严紧型复复制控制制的质粒粒：1 - 55 拷贝贝，如ppSC1101松弛型复复制控制制的质粒粒：30
15、0 - 50 拷贝，如如 CoolE11氯霉素扩扩增：在在宿主菌菌生长的的中后期期，通过过添加氯氯霉素抑抑制蛋白白质合成成、关闭闭主要代代谢途径径，以使使松弛型型质粒 迅速速大量扩扩增（可可达上千千拷贝）的的操作。质粒载体体的特点点：分子子量小，便便于操作作；易于于构建，可可作为其其他宿主主系统载载体的骨骨架；用用途广泛泛；缺点点：装载载量小（小小于100kb），不不能用来来克隆大大片段。重要的大大肠杆菌菌质粒载载体：pBRR3222：松弛弛型复制制；氯霉霉素可扩扩增；拷拷贝数 50 1000 / ceell；用于基基因克隆隆。还有有pUCC18/19；T载体体，详见pppt，了了解一下下。实
16、验室一一般使用用下列三三种方法法制备质质粒DNNA： 氯化铯密密度梯度度离心法法：质粒粒DNAA纯度高高、周期期长、设设备要求求高、溴溴乙锭污污染；碱裂解解法（最最常用）：质粒DDNA纯纯度、操操作周期期介于氯氯化铯法法和沸水水浴法之之间；沸水浴浴法：质质粒DNNA纯度度底、快快速、操操作简便便。质粒的不不相容性性的分子子机制两种含有有相似复复制子结结构的不不同质粒粒，在复复制时受受到同一一种拷贝贝数控制制系统的的干扰，致致使两种种质粒的的最终拷拷贝数不不同，可可导致子子代细胞胞质粒组组成不同同，且这这种差异异具随机机性，经经过若干干代后宿宿主细胞胞中处于于数量弱弱势的质质粒必然然被淘汰汰，而
17、仅仅剩强势势质粒。质粒载体体不稳定定性的类类型分离的不不稳定性性：在细细胞分裂裂过程中中发生的的质粒不不平均的的分配，有有的细胞胞没有获获得质粒粒 DNN拷贝，并并最终增增殖成为为无质粒粒的优势势群体。结构的不不稳定性性：由转转位作用用和重组组作用所所引起的的质粒DDN的重排排与缺失失。 影响质粒粒载体稳稳定性的的主要因因素新陈代谢谢负荷对对质粒载载体稳定定性的效效应；拷拷贝数差差度对质质粒载体体稳定性性的影响响低差差度-稳定 / 高高差度-不稳定定；寄主主重组体体系对质质粒载体体稳定性性的效应应形成成重组质质粒二聚聚体，便便会以高高出质粒粒单体分分子两倍倍的速度度进行复复制，从从而导致致出现
18、质质粒寡聚聚体的克克隆增殖殖。（2）llamdda噬菌菌体DNNA:25kkb噬菌体体是大肠肠杆菌的的温和型型噬菌体体，由外外壳包装装蛋白和和l-DNNA组成成。DNNA重组组技术一一般需要要噬菌体体进入溶溶菌状态态-DNNA是线线性双链链DNAA分子，全全长4885022个核苷苷酸。-DNAA两端各各带有一一个122bp的的粘性末末端，称称为coos位点点。噬菌菌体感染染细菌以以后，双双链DNNA分子子通过CCOS位位点成环环状。插入型型载体：改造后后的长度度正好为为包装的的下限，因因而本身身也能被被包装，叫叫插入型型载体1.cII基因失失活：ccI基因因失活后后将导致致噬菌体体不能溶溶原化
19、，产产生清晰晰的噬菌菌斑。相相反，产产生混浊浊的噬菌菌斑。22. LLac Z基因因插入失失活：在在lacc Z基基因上有有EcooR II位点，插插入失活活后利用用X-ggal法法筛选（蓝蓝白筛选选）。 取代型型载体：长度为为40kkb，在在非必需需区域有有酶切位位点，距距离为114kbb。载量为为10-25kkb。用取代型型载体克克隆外源源DNAA可能需需要经过过哪些步步骤？第一，应应用适当当的核酸酸内切限限制酶消消化载体，除除去基因因组中可可取代的的DNAA区段。第二，将将上述所所得的 DNNA臂同同外源DDNA片片段连接接。第三三，对重重组体的的DN A分子子进行包包装和增增殖，以以得
20、到有有感染性性的重组噬噬菌体。-DNNA重组组分子需需在体外外人工包包装成有有感染力力的噬菌菌体重组组颗粒，方方可高效效导入受受体细胞胞。-DNNA作为为载体的的优点：1. -DNNA可在在体外包包装成噬噬菌体颗颗粒，能能高效转转染大肠肠杆菌22. -DNNA载体体的装载载能力为为25 kb，远远远大于于质粒的的装载量量 3.重组l-DNNA分子子的筛选选较为方方便4. 重组组-DNNA分子子的提取取较为简简便5. -DNNA载体体适合克克隆和扩扩增外源源DNAA片段，但但不适合合表达外外源基因因。cos质质粒：llamdda DDNA的的coss区和质质粒组成成的载体体: 331-445 k
21、kb（3）考考斯质粒粒载体的的特点：1.能像像-DNNA那样样进行体体外包装装，并高高效转染染受体细细胞2.能像质质粒那样样在受体体细胞中中自主复复制 33. 重组组操作简简便，筛筛选容易易 4. 装载载量大（445 kkb）且且克隆片片段具有有一定的的大小范范围 55. 不能能体内包包装，不不裂解受受体细胞胞.（4）人人工染色色体载体体人工染色色体实际际上是一一种“穿梭”克隆载载体：含含有质粒粒克隆载载体所必必备的第第一受体体（大肠肠杆菌）源源质粒复复制起始始位点（oori），还还含有第第二受体体（如酵酵母菌）染染色体DDNA着着丝点、端粒和和复制起起始位点点的序列列，以及及合适的的选择标标
22、记基因因。细菌人人工染色色体（BBAC）:50-3000kb,主要要用于基基因文库库构建易于于发生重重组、缺缺乏稳定定性、制制备工艺艺繁琐 酵母人工工染色体体（YAAC）: 3550-4400kkb，主主要用于于基因文文库构建建克隆隆大型基基因簇（ggenee cllustter）结结构&构建动动植物基基因文库库三、用于于基因转转移的受受体菌或或细胞（1）受受体（宿宿主）应应具备的的条件1.限制制性缺陷陷型外切酶酶和内切切酶活性性缺陷（hsdR-） 2. 重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA- ， recB-，recC- ）3. 具有较高的转化效率 4. 具有与载体选择标记
23、互补的表型 5. 感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外。（2）各各种基因因工程受受体（宿宿主）的的特性A. 大大肠杆菌菌遗传传背景清清楚，载载体受体体系统完完备，生生长迅速速，培养养简单，重重组子稳稳定。适适用于外外源DNNA的扩扩增和克克隆、基基因文库库的构建建和外源源基因的的高效表表达，是是DNAA重组实实验和基基因工程程的主要要受体菌菌。产生生结构复复杂、种种类繁多多的内毒毒素。B. 枯枯草芽孢孢杆菌遗传传背景清清楚，蛋蛋白质分分泌机制制健全，生生长迅速速，培养养简单，不不产内毒毒素。遗遗传欠稳稳定，载载体受体体系统欠欠完备。适用于于重组蛋蛋白与多多肽、特特别是微微生物来来源
24、的酶酶的高效效分泌表表达。C.链霉霉菌抗生素素的主要要生产者者，相对对操作简简便，不不产内毒毒素。遗遗传不稳稳定，生生长相对对缓慢。主要用用于抗生生素生产产菌株的的改良。D. 酵酵母菌具有有真核生生物的特特征，遗遗传背景景清楚，生生长迅速速，培养养简单，外外源基因因表达系系统完善善，遗传传稳定。内源性性蛋白产产物种类类繁多且且含量高高。适用于于外源DDNA的的扩增、克隆以以及真核核生物基基因的高高效表达达、基因因文库的的构建、真核生生物基因因表达调调控的研研究，是是DNAA重组实实验和基基因工程程重要的的真核性性受体菌菌。E. 昆昆虫细胞胞（家蚕蚕，杆状状病毒表表达系统统）具有真真核生物物的特
25、征征，外源源基因表表达量高高，繁殖殖相对较较快，培培养成本本低廉，遗遗传稳定定。DNAA重组操操作系统统欠完善善。适用于于真核生生物基因因的高效效表达。F. 哺哺乳动物物细胞（中中国仓鼠鼠卵巢细细胞 CCHO）与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统。细胞培养条件苛刻，生长缓慢。适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体。G . 植物细细胞（拟拟南芥菜菜、烟叶叶） 农作作物的经经济意义义重大，转转基因植植物细胞胞易于分分化，细细胞培养养简单且且成本低低廉，具具有光合合作用。遗传操操作繁琐琐。适用于于高等植植物基因因表达调
26、调控的研研究、基基因药物物的生产产，农作作物品质质的改良良。实验室常常用的基基因工程程受体（宿宿主）：大肠杆杆菌；真真菌：酵酵母菌（毕毕赤酵母母，汉森森酵母，啤啤酒酵母母）&丝丝状真菌菌（黑曲曲霉、青青霉）；哺乳动动物细胞胞 CHOO（3）大大肠杆菌菌转化常常用方法法感受态（ccomppenttentt )：受体(宿主）细细胞经过过一些理理化或生生物学方方法处理理后，细细胞膜的的通透性性发生暂暂时性的的改变，成成为能允允许外源源DNAA进入的的一种生生理状态态。感受受态细胞胞（coompeenteent celll )CaCCl2法法原理Ca2+诱导的的完整细细胞的转转化适用用于革兰兰氏阴性性
27、细菌（如如大肠杆杆菌等），119700年建立立此技术术，其原原理是CCa2+与细菌菌外膜磷磷脂在低低温下形形成液晶晶结构，转转化混合合物中的的DNAA与其形形成抗DDnasse的羟羟基-钙钙磷酸复复合物黏黏附于细细胞表面面，后者者经热脉脉冲发生生收缩作作用，使使细胞膜膜出现空空隙，细细菌细胞胞此时的的状态即即为感受受态。具体大肠肠杆菌感感受态细细胞的制制备及质质粒转化化详见pppt。电转化化法热激法法转化率的的定义：每微克克DNAA分子转转化宿主主菌能获获得的转转化子数数。例如，ppUC118对大大肠杆菌菌的转化化率为1108，即即每微克克pUCC18中中只有1108个个分子能能进入受受体细胞
28、胞。一微微克pUUC188共有33.4XX10111个分分子（66.022X10017 / 226866X6660），也也就是说说，每334000个pUUC188分子才才有一个个分子进进入受体体细胞。 另一方方面，在在实际操操作过程程中，转转化一微微克pUUC188共需22ml感感受态细细胞，大大约含有有2X110100个大肠肠杆菌细细胞，也也就是说说，每2200个个细胞只只有一个个细胞能能接纳ppUC118 DDNA。不同转化化方法转转化率：Ca2+诱导转转化106 1007 / mg DDNA 原生质质体转化化1005 1006 / mg DDNA -DNNA转染染1007- 1108 /
29、 mg DDNA 电电穿孔转转化106 1009 / mg DDNA 转化子的的筛选和和鉴定（检检）由于重组组率和转转化率不不可能达达到理想想极限，因因此必须须借助各各种筛选选和鉴定定方法区区分转化化子与非非转化子子、重组组子与非非重组子子、目的的重组子子与非目目的重组组子。转化子筛筛选和鉴鉴定流程程1、筛选选选择性性平板筛筛选2、重重组子初初步鉴定定显色色、PCCR、比比大小、酶切、分子杂杂交、生生物/免免疫学活活性3、重重组子确确证DNAA序列分分析4、外外源基因因表达产产物检测测仅当当外源基基因克隆隆于特定定表达载载体和宿宿主中时时才需要要。常规规基因克克隆则否否。转化子筛筛选方法法：抗
30、药性筛筛选法；营养缺缺陷型筛筛选法；显色筛筛选法laacZ基因（蓝蓝色反应应）、链链霉菌质质粒pIIJ7002携带带的meelC基基因（黑黑色反应应）等；DNAA电泳检检测【直直接电泳泳检测法法；限制制性酶切切图谱法法；PCCR扩增增检测法法】；原原位杂交交法（高高通量筛筛选）；DNAA序列分分析双脱氧氧末端终终止测序序法；外外源基因因表达产产物检测测法【聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳法法（SDDS-PPAGEE）；酶酶联免疫疫吸附法法ELIISA；免疫印印记（WWestternn bllotttingg）；蛋蛋白质生生物功能能测定法法（高通通量筛选选）淀粉酶酶基因；原位免免疫沉淀淀法（高高通量筛筛
31、选）；放射免免疫原位位杂交鉴鉴定】四、基因因克隆基因文库库：从特定定生物个个体中分分离的全全部基因因，这些些基因以以克隆的的形式存存在（人人工构建建）。根根据构建建方法的的不同，基基因文库库分为：基因组组文库（含含有全部部基因）&cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）。在高度分化的生物体中cDNA文库的信息量远小于基因组文库基因克隆隆常用方方法：鸟枪法法基本策略略：染色体体DNAA的切断断：超声声波处理理片段段长度均均一，大大小可控控，平头头末端；全酶切切片段段长度不不均一，粘粘性末端端便于连连接，但但有可能能使目的的基因断断开，大大小不可可控；部部分酶切切片段段长度可可控，含含有粘性性
32、末端，目目的基因因完整。与载体体连接：如果转转化子采采用菌落落原位杂杂交法或或限制性性酶切图图谱法筛筛选，则则选择多多拷贝克克隆载体体；如果果转化子子采用基基因产物物功能检检测法筛筛选，则则选择表表达型载载体。转化受受体细胞胞如果果转化子子采用菌菌落原位位杂交法法或限制制性酶切切图谱法法筛选，则则选择大大肠杆菌菌作为受受体细胞胞；如果果转化子子采用基基因产物物功能检检测法筛筛选，则则选择能能使目的的基因表表达的受受体细胞胞。筛选含含有目的的基因的的目的重重组子：菌落原原位杂交交法、基基因产物物功能检检测法（筛筛选模型型的建立立）。cDNNA法基本策略略：【cDDNA第第一链的的合成cDNNA第
33、二二链的合合成（自自身引导导法、置置换合成成法、引引导合成成法、）】/双链ccDNAA的克隆隆离目的的基因（完完备分离离程序、特异分分离程序序、差异异分离程程序）PCRR法使用PCCR法克克隆目的的基因的的前提条条件是：已知待待扩增目目的基因因或DNNA片段段两侧的的序列，根根据该序序列化学学合成聚聚合反应应必需的的双引物物基本策略略：由Taaq DDNA聚聚合酶扩扩增的PPCR产产物中，其其3末端总总是会带带有一个个非模板板依赖型型的突出出碱基，而而且这个个碱基几几乎总是是A，因因为Taaq DDNA聚聚合酶对对dATTP具有有优先聚聚合活性性。由于于该突出出碱基的的存在，克克隆时即即可以采
34、采取TddT末端端加同聚聚尾的方方法与载载体拼接接，也可可以使用用专门的的T载体体克隆。化学合合成法（全全基因合合成）基因文库库的完备备性是指指：在构构建的基基因文库库中任一一基因存存在的概概率，它它与基因因文库最最低所含含克隆数数N之间间的关系系可用下下式表示示：N = lln ( 1 P ) / lnn ( 1 f )其中： P = 任一一基因被被克隆（或或存在于于基因文文库中）的的概率，ff = 克隆片片段的平平均大小小 / 生物基基因组的的大小。基因文库库的构建建程序1.基因因组DNNA的制制备：2.基因因组DNNA的切切割：用用于基因因组文库库构建的的DNAA片段的的切割一一般采用用
35、超声波波处理和和制性内内限切酶酶部分酶酶切两种种方法，其其目的是是：第一一，保证证DNAA片段之之间存在在部分重重叠区；第二，保保证DNNA片段段大小均均一。连连接前，上上述处理理的DNNA片段段必须根根据载体体的装载载量进行行分级分分离，以以杜绝不不相干的的DNAA片段随随机连为为一体3.载体体和受体体的选择择：出于于压缩重重组克隆隆的数量量，用于于基因组组文库构构建的载载体通常常选装载载量较大大的-DNNA或考考斯质粒粒；对于于大型基基因组（如如动植物物和人类类）需使使用YAAC或BBAC载载体。ccDNAA文库构构建的载载体通常常选质粒粒；用于于基因文文库构建建的受体体则根据据载体使使用
36、大肠肠杆菌或或酵母菌菌。4.从基基因文库库中筛选选目的基基因：可可以采用用特殊的的正选择择筛选程程序（如如抗药性性筛选法法、酵母母双杂交交技术等等）直接接筛选外外，一般般的基因因组文库库筛选均均需多轮轮操作步步骤。原原位杂交交法。第三章 大肠杆杆菌基因因工程一、大肠肠杆菌表表达（生生产）系系统的优优缺点大肠杆菌菌表达系系统的优优点1.遗传传背景清清楚（444055个ORRF），便便于基因因操作 2.表表达水平平高，遗遗传较稳稳定3.优良良的工业业性能：繁殖迅迅速、培培养简单单、操作作方便 4.被被美国FFDA认认定为安安全的重重组药物物生产系系统大肠杆菌菌表达系系统的缺缺点1. 缺乏翻译译后修
37、饰饰加工系系统（不不能表达达糖基化化蛋白、结构复复杂的蛋蛋白等）22.胞内内缺乏高高效的表表达产物物折叠机机制（形形成包涵涵体），分分泌机制制不完善善 3.细胞周周质内含含有种类类繁多的的内毒素素二、大肠肠杆菌系系统高效效表达原原理大肠杆杆菌系统统表达载载体的基基本元件件A、目的的基因：编码外外源蛋白白的结构构基因 B、转转录元件件：启动动子、终终止子C、翻译译元件：核糖体体结合位位点、翻翻译起始始位点D、克隆隆元件：克隆位位点、复复制原点点、标记记基因E、翻译译后元件件（非必必须） ：信号号肽、融融合肽外源基基因在大大肠杆菌菌中高效效表达原原理A、启动动子 (Proomotter)是DNAA
38、链上一一段能与与RNAA聚合酶酶结合并并能起始始RNAA合成的的序列。是基因因表达最最关键和和最强的的表达调调控元件件，启动动子的强强弱对表表达水平平有决定定性影响响。（没没有启动动子，基基因就不不能转录录）。启动子有有种属特特异性（如如真核的的在原核核宿主中中无效），有有组成型型（组成型型表达系系统）和诱导导型（诱导型型表达系系统）二大类类。原核基因因启动子子是由两两段彼此此分开且且又高度度保守的的核苷酸酸序列组组成：（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游510bp，一般由68个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或10区。（2）35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称35区，
39、一般由10个碱基组成。常用原核核基因启启动子：【laac (乳糖启启动子)；trpp (色色氨酸启启动子)；tacc（乳糖糖和色氨氨酸的杂杂合启动动子Ptacc = Ptrpp 的-35区区+ PPlacc的-110区）；T7启启动子】IPPTG诱诱导；PL和PR(噬菌体体的左向向和右向向启动子子)温控控（热诱诱导），30/37培养， 42诱导。T7启动动子最成功功的启动动子 A.强大大的 TT7 启动动子完全全专一受受控于 T7 RNNA 聚聚合酶，B.T77 RNNA 聚聚合酶合合成 mmRNAA 的速速度比大大肠杆菌菌RNAA 聚合合酶的快快 5 倍 C.由于于大肠杆杆菌本身身不含 T7
40、 RNNA 聚聚合酶 ，需要要将外源源的 T7 RNNA 聚聚 合酶酶引入宿宿主菌（采采用DEE3溶源源菌，TT7RNAA聚合酶酶置于LLacUUV5启启动子控控制下，IIPTGG间接诱诱导）。B、终止止子转录过头头现象：A.RRNA聚聚合酶滑滑过终止止子结构构继续转转录质粒粒上邻近近的 BB.DNNA序列列，形成成长短不不一的mmRNAA混合物物。防止转录录过头策策略：A、采用用强终止止子大肠杆杆菌rRRNA操操纵子上上的rrrnT11T2TT7&噬噬菌体DDNA上上的TB、二聚聚体终止止子串联联的特殊殊结构C、核糖糖体结合合位点（RRBS） mRNAA 5端非翻翻译序列列,包括括SD、起始
41、密密码子、SD与与起始密密码子间间的序列列、起始始密码子子下游序序列。SD序列列（Shhinee-Daalgaarnoo）：位位于翻译译起始密密码子上上游的66-8个个核苷酸酸序列（5UAAGGAGG 3），它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。D、质粒粒拷贝数数策略：较低拷拷贝质粒粒（几个个至数十十个）& 调控控重组质质粒的扩扩增E密码子子满足宿宿主对密密码子偏偏爱性的的策略:外源基基因全合合成 & 同步步表达相相关tRRNA编编码基因因三、大肠肠杆菌工工程菌的的构建策策略1、包涵涵体型异异
42、源蛋白白的表达达包涵体：胞内高高效表达达时，工工程菌因因大量合合成异源源蛋白质质所形成成的水不不溶性积积聚物。性质：致致密（密密度大于于细胞碎碎片和所所有细胞胞器）、还含有有标记蛋蛋白、RRNA聚聚合酶和和少量的的DNAA、RNNA和脂脂多糖等等非蛋白白分子。裸露或或被膜包包裹。包涵体形形成原因因：大肠肠杆菌细细胞内呈呈“还原”型环境境，不不不利于二二硫键的的形成，当当高效表表达时，新新合成肽肽形成二二硫键的的速度和和折叠效效率跟不不上合成成速度。表达产物物结构形形式：aa)部分分属于折折叠过程程中的产产物；bb)部分分为无序序卷曲与与聚集，分分子内二二硫键错错配; c)分子间间存在大大量错配
43、配二硫键键。以包涵体体形式表表达目的的蛋白的的优缺点点包涵体表表达形式式的优点点：、便于于表达产产物分离离包涵涵体的水水难溶性性及其密密度远大大于其它它细胞碎碎片和细细胞成分分，菌体体经超声声波裂解解后，直直接通过过高速离离心即可可将重组组异源蛋蛋白从细细菌裂解解物中分分离出来来、利于于表达产产物在宿宿主细胞胞内稳定定存在在形形成包涵涵体之后后，大肠肠杆菌的的蛋白酶酶降解作作用基本本上对异异源重组组蛋白的的稳定性性已构不不成威胁胁包涵体表表达形式式的缺点点：以包包涵体形形式表达达的重组组蛋白丧丧失了原原有的生生物活性性，必须须通过有有效的变变性复性性操作，才才能回收收得到具具有正确确空间构构象
44、（因因而具有有生物活活性）的的目标蛋蛋白，因因此包涵涵体变复复性操作作的效率率对目标标产物的的收率至至关重要要。然而而，这也也是一个个技术难难题，尤尤其当目目标蛋白白分子中中的Cyys残基基数目较较高时，体体外复性性蛋白质质的成功功率相当当低，一一般不超超过300%。包涵体的的溶解与与变性包涵体的的溶解与与变性的的主要任任务是拆拆开错配配的二硫硫键和次次级键在在人工条条件下，使使包涵体体溶解并并重新进进入复性性途径中中。常采采用高浓浓度变性性剂：88M尿素素、6MMGuCC打开各各种次级级键，以以DTTT等巯基基试剂打打开二硫硫键。能有效促促进包涵涵体溶解解变性的的试剂和和条件包包括：促溶剂最
45、最常用, 盐酸酸胍、尿尿素，前前者昂贵贵，尿素素便宜，但但常被自自发形成成的氰酸酸盐污染染，后者者能与多多肽链中中的氨基基反应表面活性性剂SDDS、正正十二醇醇肌氨酸酸，廉价价，但影影响复性性和纯化化混合溶剂剂 如尿尿素与醋醋酸、二二甲基砜砜等联合合使用，溶溶解力增增强极端pHH 廉价，但但许多蛋蛋白质在在极端ppH条件件下发生生修饰反反应包涵体的的复性与与重折叠叠：二硫硫键形成成（将多多肽链中中被拆开开的游离离巯基氧氧化重新新形成二二硫键（关键）；通过次级键的形成使蛋白质重折叠形成二硫硫键的方方式主要要有：AA化学氧氧化法需要要电子受受体，最最廉价的的电子受受体为空空气，二二硫键形形成是随随
46、机的，仅仅适用于于那些不不含游离离半胱氨氨酸残基基的蛋白白质的重重折叠 B二硫键键交换需要要还原型型和氧化化型谷胱胱甘肽（GGSH和和GSSSG），二二硫键形形成相对对特异，因因此适用用性较广广，重折折叠效果果好包涵体复复性操作作的方法法：缓慢降降低变性性剂浓度度，并尽尽量减低低蛋白浓浓度。详详见老师师pptt。包涵体的的复性与与重折叠叠的主要要挑战是是：聚集集沉淀2、融合合型异源源蛋白的的表达以融合形形式表达达目的蛋蛋白的优优缺点目的蛋蛋白稳定定性高 尤其其对分子子量较小小的多肽肽效果更更佳目的蛋蛋白易于于分离 利用用受体蛋蛋白成熟熟的抗体体、配体体、底物物进行亲亲和层析析，可以以快速获获得纯度度较高的的融合蛋蛋白目的蛋蛋白表达达率高 与受受体蛋白白共用一一套完善善的表达达元件目的蛋蛋白溶解解性好 由于于受体蛋蛋白的存存在，融融