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1、3.2基因工程的基本操作程序1.培育转基因抗虫棉的四个步骤：（1）目的基因的筛选与获取 （2）基因表达载体的构建（3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定2.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因，它主要是指编码蛋白质的基因。第一步：目的基因的筛选与获取1.筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一， 如Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。2.利用PCR获取和扩增目的基因（1）获取目的基因的方法 a.人工合成（基因碱基序列是已知的）b.PCR技术扩增（已知基因两侧的碱基序列）
2、c.从基因文库中获取（原核生物）（2）PCR技术PCR的含义：是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。基本条件 场所：需要在一定的缓冲溶液中进行，其中一般要添加Mg2+模板：已知两侧碱基序列的DNA母链原料：4种脱氧核苷酸 酶：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）引物：是2种与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸反应过程 变性：加热超过90，双链DNA解旋为单链 复性：温度下降至50左右，两种引物与互补单链DNA结合 延伸：温度上升到72左右，四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下
3、合成子链DNA结果：两引物间固定长度的DNA序列呈指数扩增（即2n）鉴定PCR产物：用琼脂糖凝胶电泳来鉴定注：1.含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数为 2n-2n 2.第三轮出现两条链等长的DNA片段 3.两种引物之间需要满足的是：不能碱基互补配对，是防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率。第二步：基因表达载体的构建（核心工作）1.构建基因表达载体的目的 a.让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代b.使目的基因能够表达和发挥作用2.基因表达载体的构成：目的基因+标记基因+启动子+终止子 启动子：位于DNA上.在基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，躯动基因转录出
4、mRNA，有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子：也位于DNA上在基因的下游，终止转录起始密码子和终止密码子：位于mRNA上，决定翻译的开始和结束3.基因表达载体的构建过程（P80-图3-6）（1）首先用一定的限制酶切割载体（2）然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段（3） 再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段 拼接到载体的切口处注意：选择限制酶的三大原则一大要求（题干特定要求）（1） 不能破坏目的基因 如图甲，可选择Pst而不选择Sma（2） 不能破坏质粒中的重要元件（如复制原点.启动子.终
5、止子.标记基因（至少保留一个）（3） 质粒与目的基因形成相同的黏性末端（一般使用双酶切，优点是可以防止质粒和目的基因的 自身环化以及目的基因与载体的反向连接）第三步：将目的基因导入受体细胞1.转化的概念（重点）：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法导入植物细胞 农杆菌转化法（最常用） 受体是体细胞或受精卵 花粉管通道法（我国独创）如抗虫棉导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术 受体细胞多是受精卵导入微生物细胞：常以大肠杆菌作为受体细胞一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（即感受态），然后再将重组的基
6、因表达载体导入其中。3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是 标记基因是否表达农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。第四步：目的基因的检查与鉴定1.分子水平的检测 1）通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因2）利用PCR技术检测目的基因是否转录出了mRNA3）用相应抗体进行抗原抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质等2.个体生物学水平的鉴定：抗虫.抗病接种试验等总结-基因工程的基本操作流程（P82-图3-7）实验：DNA片段的扩
7、增及电泳鉴定步骤（利用PCR仪扩增DNA片段，电泳鉴定PCR产物）实验原理：1.DNA片段的扩增：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解旋与结合。2.琼脂糖凝胶电泳 P54（1）带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基因可以带上正电荷或负电荷。（2）电泳：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（3）迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度.DNA分子的大小和构象有关。（4）检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来3.操作提示 P85注意（1）为避免外源DNA等因素的
8、污染，PCR试验中使用的微量离心管.枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。（2）缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前所需试剂从冰箱拿出放在冰块上缓慢融化。（3）添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。（4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。4.结果分析与评价（1）未出现扩增条带的原因a.TaqDNA聚合酶失活 b.引物出现质量问题 c.Mg2+浓度过低 d.变性时的温度低，变性时间短（2）出现非特异性扩增条带的主要原因a.模板DNA出现污染 b.引物特异性不强（过短）或形成引物二聚体 c.Mg2+浓度过高d.复性时的温度过高附图：63.2基因工程的基本操作程序学科网（北京）股份有限公司