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1、。论著。 粪便 p53基因突变检测在结直肠癌 诊断 的应用 占 强 严 洁 蒋 志 阳 司 进 陈 涛 郭 继 中 陶 国 清 【摘要】目的探讨粪便 p53基因突变检测对结直肠癌的诊断价值，旨在建立一种非侵入性的 结直肠癌筛检的方法。方法应用 PCR-单链构象多态性分析 -溴乙锭染色方法，检测 40例结直肠 癌、 20例结直肠腺瘤及 15例胃癌患者肿瘤组织和粪便标本 p53基因突变。结果 40例结直肠癌患 者粪便 p53相应外显子 DNA片段扩增率为 90%， 20例结直肠腺瘤为 85%， 15例胃癌为 93 %。所有 标本总的扩增率为 89%。 40例结直肠癌患者组织标本中 29例存在 p5
2、3突变 (72. 5%_)，其中 23例粪 便测及 p53突变，检测敏感性为 57. 5%，明显高于粪便隐血及血癌胚抗原检测的阳性率 （ PC 0. 05) for the diagnosis of CRC. 3 of 20 colorectal adenoma had p53 mutation both in tumor tissues and fecal specimens. 10 of 15 gastrocarcinoma had p53 mutation in tumor tissues but none in fecal specimens. Conclusions Analysis
3、 of fecal p53 gene mutation has relatively higher diagnostic sensitivity rate for diagnosis of CRC and is expected to be a relatively sensitive, specific and effective method for early diagnosis of CRC, especially for CRC screening in large scale of the population. 【 Keywords】 Intestinal neoplasms；
4、Genes, p53； Feces 作者单位： 214002江苏省无锡市第一人民医院消化科（占强、严 洁、陈涛、郭继中 ） ,普外科（蒋志阳、陶国清 ） ;江苏省 13 5重点学科及 江苏省寄生虫分子生物学重点实验室（司进 ） 通信作者：占强， Email: zhanqangCaJpublicl. 1 .对象 :40例结直肠癌、 20例结直肠腺瘤及 15 不高，故我们应用 PCR _单链构象多态性分析 (SSCP )_溴乙锭 (EB )染色方法检测结直肠癌患者粪 便中 p53基因突变，旨在建立一种非侵入性的结直 肠癌筛检的方法。 对象和方法 例胃癌患者为 2002年 4月至 2003年 8月
5、无锡市第 一人民医院普外科住院手术和消化内科住院及门诊 行内镜检查的病人，均经手术或内镜病理证实。 40 例结直肠癌患者中，男 25例，女 15例，年龄 42 73 岁，平均年龄59岁，其中腺癌 32例（高、中、低分化 者分别为 10、15、 7例），黏液腺癌 8例； Dukes分期： A期 6例， B期14例， C期 20例；区域淋巴结转移 20例，无淋巴结转移 20例；病灶直径 2 7 cm,平均 (3. 9 士 1. 5 ) cm;位于直肠 12例，乙状结肠 12例，降 结肠 7例，横结肠 3例，升结肠 6例。 20例结直肠 腺瘤患者中，男 12例，女 8例，年龄 40 61岁，平均 年
6、龄 47岁。 肠镜检查 1个腺瘤患者 7例， 2个腺瘤 患者 8例， 3个腺瘤患者 5例；其中管状腺瘤 24个， 绒毛状腺瘤 9个，混合型腺瘤 5个 ;病灶直径 0. 5 2. 5 cm不等，平均 （ 1.3 士 0.7) cm。 15例胃癌患者 中，男 9例，女 6例，年龄 45 65岁，平均年龄 52 岁，其中印戒细胞癌 3例，低分化腺癌 3例，中高分 化腺癌 9例 ;贲门癌 6例，胃体癌 6例，胃窦癌 3例 ; 病灶直径 2 6 cm不等，平均 （ 3. 6 士 1. 9 ) cm。 2. 主要试剂及仪器 :P53基因第 5 8外显子引 物序列参考文献 1设计，由上海生工生物工 程技术
7、服务有限公司合成。 Wizard8基因组 DNA纯化试 剂盒 (Promega)、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs等均为华 美生物工程公司进口分装。丙烯酰胺和甲叉丙烯酰 胺为上海生工生物工程技术服务有限公司进口分 装。 PCR扩增仪、 DCode突变检测仪和凝胶扫描 仪为 Bio-Rad公司产品。 3. 标本采集 :所有结直肠癌患者于入院或门诊 时均检测粪便隐血和血清癌胚抗原。取所有试验对 象手术前或内镜检查后粪便标本、手术切除或内镜 活检肿瘤和相应周围正常黏膜标本一 80 C保存备 用，并采集同一患者抗凝静脉血标本 4 C保存备用。 4. DNA提取： （ 1)粪便 DNA提取 :0.
8、5g粪便中 加入抽提液 （ 0. 5 mol/L Tris-HCl， 0. 1% SDS, 16mmol/L EDTA， 15 mmol/L NaCl， 100 mg/L 蛋白 酶 K， pH 9. 0)至总体积 2. 0 ml,充分混匀， 10 000 r/ min离心 5 min,转移上清。沉淀物中加入粪便抽提 液至 2. 0 ml,混勾，37 C 反应过夜， 10 r/min， 离 心 15 min,转移上清。加入等体积平衡酚，充分混 勾， 10 000 r/min，离心 10 min， 转移上清。重复酉分 抽提 3次，转移上清。加入等体积氯仿 -异戊醇 (241:)，充分混勾， 10
9、000 r/min， 离心 10 min， 转移 上 清 。 加 入 1 八 0 体积 3 mol/L pH 5.2的 HAC-NaAC缓冲液及 2. 5倍过量预冷无水乙醇，一 30 C静置 1 h， 10 000 r/min， 离心 15 min， 弃上清。 沉淀物用 70 %预冷乙醇冲洗 2次，自然晾干后加入 DDH20溶解， 12 000 r/min， 离心 20 min， 弃沉淀，上 清一 20 C备用。 （ 2)组织及静脉血标本 DNA提取： 按Wizard6基因组 DNA纯化试剂盒 (Promega)说明 书操作。 5. p53基因第 5 8外显子扩增： PCR扩增反 应液总体积
10、50 W， 包括 :4 /4粪便 DNA提取液或 1 /4组织或静脉血 DNA提取液， 50 mmol/L氯化钾， 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 4)， 1.5 mmol/L 氯化 镁， 100 mg/L 明胶， 0. 2 mmol/L dNTPs, 0. 5 / mol/ L引物， 1. 25uTaqDNA聚合酶。扩增过程在 PCR 扩增仪中进行。首先 94 C变性 3 min， 再按如下不 同温度循环 30 次 （ 94 C、 30 s， 55 C、 1 min， 72 C、 1 min )， 最后 72 C延伸 5 min。 扩增产物经 2 %琼脂糖 凝胶电泳鉴定。
11、6.SSCP:取 PCR扩增产物 5 W加变性液 (95 % 甲酰胺，20 mmol/L EDTA， 0. 05 %溴酚蓝， 0. 05% 二甲苯蓝 )5 /4混勾，置 100 C水浴 5 min， 取出后立 即放入冰浴中骤冷，然后上样于 5%聚丙烯酰胺凝 胶 (含 10%甘油，八 38丨 8=291:)，功率 30电泳 4 5 h。 电泳完毕后，凝胶用 EB染色 10 min,于凝胶 扫描仪上观察结果并拍照。 7.统计学方法 :采用检验、卡方检验及率比较 的w检验。 结 果 1. 粪便 PCR扩增结果：见表 1。粪便中扩增到 p53相应外显子 DNA片段的扩增率在结直肠癌、结 直肠腺瘤及胃癌
12、患者中分别为 90%、 85%及 93%， 所有标本总的扩增率为 89%。 2. 结直肠癌、结直肠腺瘤和胃癌患者肿瘤组织 及静脉血标本 p53基因突变情况： 40例结直肠癌患 者组织标本中 29例存在 p53突变 （ 72. 5%)，其中 36例粪便p53基因扩增阳性患者中 28例组织标本 存在 p53突变(高分化 7例，中分化 11例，低分化 5 例，黏液腺癌 5例 ） 。20例结直肠腺瘤患者组织标 本中 3例存在 p53突变（ 15.0%)，此 3例粪便 p53 基因扩增均阳性。 15例胃癌患者组织标本中 10例 存在 p53突变 (67. 7%)，其中 14例粪便 p53基因扩 增阳性患
13、者中 9例组织标本存在 p53突变 （ 印戒细 胞癌 3例，低分化腺癌 3例，中高分化腺癌3例）。 表 1 不同患者的粪便 PCR扩增结果 分类 例数 p53扩增结果 阳性 阴性 结直肠癌 40 36 4 病理类型 高分化 10 9 1 中分化 15 13 2 低分化 7 7 0 黏液腺癌 8 7 1 Dukes分期 A 6 6 0 B 14 14 0 C 20 16 4 区域淋巴结转移 阳性 20 16 4 阴性 20 20 0 病灶部位 直肠 12 11 1 乙状结肠 12 12 0 降结肠 7 6 1 横结肠 3 3 0 升结肠 6 4 2 结直肠腺瘤 20 17 3 胃癌 15 14
14、1 印戒细胞癌 3 2 1 低分化腺癌 3 3 0 中高分化腺癌 9 9 0 所有患者静脉血标本均未测及 p53突变。 1. 结直肠癌、结直肠腺瘤和胃癌患者粪便标本 p53基因突变检测情况 :36例粪便 p53基因扩增阳 性的结直肠癌患者中 23例粪便测及 p53突变，且和 相应肿瘤组织 p53突变电泳条带一致，诊断敏感性 为 63. 9%，特异性为 100%。若将 4例粪便 p53基 因扩增阴性患者纳入分析，则诊断敏感性为 57. 5%。 20例结直肠腺瘤患者中 3例粪便测及 p53 突变，并和相应肿瘤组织 p53突变电泳条带一致，诊 断敏感性为 15. 0%，特异性为100%。所有 15例
15、胃 癌患者粪便中均未测及 p53突变。 2. 结直肠癌患者粪便标本 p53基因突变和粪便 隐血及血癌胚抗原检测结果比较 :40例结直肠癌患 者中14例粪便隐血阳性（ 35%)， 12例血癌胚抗原 异常升高（ 30%)，均显著低于粪便标本 p53基因突 变检测结果 (尸值均 0.05)。 3. 结直肠癌和结直肠腺瘤患者粪便标本 p53基 因突变检测结果和临床病理参数的关系： 3例结直 肠腺瘤患者粪便标本 p53基因突变检测阳性，其中 1例为单个管状腺瘤，直径为 2. 5 cm,余 2例均存在 2个腺瘤，其中 1例有 2个管状腺瘤，最大直径 1. 8 cm, 1例为 1个绒毛状腺瘤和 1个混合型腺
16、瘤，最大 直径 1.5 cm。 结直肠癌粪便标本 p53基因突变检 测结果和临床病理参数的关系见表 2。 表 2 结直肠癌患者粪便 P53基因突变检测结果和 临床病理参数的关系 临床病理参数 粪便 p53突变检测 阳性 阴性 _尸但 病理类型 高分化 5 4 0.446 中分化 9 4 低分化 5 2 黏液腺癌 4 3 Dukes分期 A 4 2 0.097 B 7 7 C 12 4 区域淋巴结转移 阳性 12 4 0.505 阴性 11 9 病灶直径 (cm) 3.71.3 4.21.8 0.313 病灶部位 直肠 7 4 0.055 乙状结肠 7 5 降结肠 4 2 横结肠 2 1 升结肠
17、 3 1 讨 论 结直肠黏膜上皮约以每小时 1 %的速度更新， 每天有近 101()个正常上皮细胞脱落，整个黏膜上皮 约每3 4天更新 1次。 1个 1 cm3大小的肿瘤组织 如以正常速度更新，则脱落入肠道的结肠上皮细胞 总量中至少有 1%来自该肿瘤组织 2。 p53基因是 大肠癌中最常见的突变基因，突变率高达 50% 86%，主要集中在第5 8外显子，其长度大约在 100 200 bp。 PCR-SSCP 对 100 300 bp 分子大小 的 ssDNA点突变检出率可达 97%3。 本研宄中 89 %的粪便标本扩增到目标基因，并 通过 SSCP在结直肠癌患者粪便中检测出较高比例 的突变条带
18、，说明 PCR-SSCP能够比较满意地用来 检测结直肠癌患者粪便中的基因突变 4。粪便检 测 p53突变对诊断结直肠癌的敏感性为 57. 5 %，特 异性为 100%，显著高于血清癌胚抗原和粪便隐血 试验。结直肠癌患者粪便 p53基因突变检测的阳性 率与病理类型、 Dukes分期、肿瘤直径和部位等均无 关，这提示大部分结直肠癌患者粪便中存在足够的 目标基因以供检测。而所有胃癌患者粪便中均未能 检出 P53基因突变，这可能和组织细胞被消化有关。 虽然结肠镜检是早期诊断大肠癌的金标准，但目前 尚难用于大范围的人群筛选。因此，粪便 P53基因 突变检测有望成为早期诊断大肠癌的一个相对敏 感、特异且有
19、效的指标，尤其在大范围人群筛 检时。 结直肠癌血行转移多发生于较晚阶段，本研宄 中40例结直肠癌患者血液标本中均未测到 p53突 变，故应用粪便基因突变检测进行早期诊断或大范 围人群筛检结直肠癌时，可采用同一患者血液标本 作 SSCP电泳图谱中的正常对照。 结直肠腺瘤粪便和组织中 p53基因突变检测的 阳性率较低，可能与其主要发生在结直肠腺瘤恶性 转化时 5有关。我们发现 3例检出粪便 p53基因突 变的结直肠腺瘤存在总体积均较大的倾向，但因样 本量小，仍需进一步研宄。本组结直肠癌粪便 p53 基因突变检测存在的假阴性可能和粪便标本肿瘤细 胞脱落太少、脱落细胞破坏、 DNA降解等有关。 参考文
20、献 1 Buchman VL, Chumakov PM, Ninkina NN, et al. The variation in the structure of the protein-coding region of the human p53 gene. Gene, 1988, 70： 245-252. 2 Ratto C, Flamini G, Sofo L, et al. Detection of oncogene mutation from neoplastic colonic cells exfoliated in feces. Dis Colon Rectum, 1996, 39： 1238-1244. 3林万明，杨瑞馥，黄尚志，等 .PCR技术操作和应用指南 .北京 ： 人民军医出版社， 1995.61. 4刘三红，罗和生，谭诗云，等 .粪便中 p53基因突变检测对大肠癌 筛选的诊断价值 .中华实验外科杂志 ,2001, 18: 323-324. 5 Scott N. Quirke P. Molecular biology of colorectal neoplasia. Gut, 1993, 34;289-292. (.收稿日期 :2003-12-04) (本文编辑 :游苏宁 ）