《骨髓间充质干细胞提取.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓间充质干细胞提取.docx（5页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、 骨髓间充质干细胞提取 摘 要 目的：探讨体外培育的羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）、一般细胞的生物学特性。方法：应用免疫组化学方法，对培育的骨髓基质的间充质干细胞（MSCs）进行细胞生长测定。结果：培育的MSCs粘附贴壁、呈纺锤状，并有多个突起；传代培育MSCs的潜藏期为24小时，对数增殖期36天，接种后第8天MSCs生长渐渐缓慢，进入平台期；免疫细胞化学染色后显示所培育细胞的细胞膜抗原CD44阳性。结论：培育的间充质干细胞，具有独特的增殖和表型特征。 关键词 羊 骨髓间充质干细胞 体外培育 鉴定分析 资料与方法 采纳健康中国山羊，月龄10个月。主要试剂为水合氯醛、安定、肝素、粉剂DMEM培
2、育基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、淋巴分别液、多聚甲醛（PFA）、小鼠抗山羊CD44、免疫组化学试剂盒等。 其主要仪器包括细胞培育瓶、24孔细胞培育板、1ml冻存管、超净工作台、离心机、CO2培育箱、倒置相差显微镜、振荡器等。 试验方法：羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）13的分别和培育。把10个月龄的山羊，用水合氯醛和安定各1ml肌肉注射麻醉，固定四肢，术区剃毛，常规消毒铺巾。于髂后上棘处骨髓腔穿刺，抽取骨髓5ml，与等量的DMEM培育液充分混匀。将骨髓1000转/分别心5分钟，弃含油脂的上清，加入DMEM液吹匀至15ml，见离心管分为清楚的5层，即脂肪层、血小板DMEM培育液层、单核细胞层
3、、淋巴细胞分别液、红细胞和巨噬细胞层。吸取中间含有BMSCs的单核细胞层有核细胞层，再加入DMEM 5ml吹打漂洗，1500转/分别心5分钟，去上清，重复3次，在沉淀中加入原代培育液10ml，反复吹打制成单细胞悬液，接种到50ml培育瓶，置37、5%CO2、饱和湿度孵箱内孵育，3 天后首次全量换液，以后每34天换液1次，倒置显微镜下视察细胞改变。待85%左右的瓶底细胞融合成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集，洗涤后再以5104个/ml的密度接种，称为第一继代（P1），待细胞再次长至90%汇合时，同法传代，称为P2、P3等。羊BMSCs的生长曲线测定。选择好P3、P5、P7细胞悬液，接种
4、于24孔培育板，每孔1ml，每天各取3孔消化贴壁细胞并计数，计算均值连续8天。以培育时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘细胞传代后生长曲线。羊BMSCs的免疫组化学鉴定。取P3代的羊BMSCs的细胞悬液接种到加有盖玻片经多聚赖氨酸涂片的24孔板，当盖玻片上的细胞密度达 1105 /ml时，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定过夜，PBS振洗，3%双氧水灭活内源性活性酶，滴加正常兔血清，室温封闭20分钟；滴加一抗工作液（小鼠抗山羊CD44），4过夜，PBS振洗；用 DAB室温显色25分钟，脱水、透亮、中性树胶封片，光学显微镜下视察记录。羊BMSCs的冻存。取P3代对数生长期的羊BMSCs细胞（冻存前全量换液）
5、，用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集，加入等量的冻存液，吹打匀称，以1ml/支移入无菌冻存管密封。-202小时后，移至-80深低温冰箱中冻存810个小时，然后移入-196的液氮中。 冻存羊BMSCs的复苏。取出冻存管后，快速投入加有37温水的烧杯中移入超净操作台，然后将溶化的细胞悬液移入离心管，加入完全培育液1015ml，吹打匀称，加入完全培育基以1105个/ml接种于50ml培育瓶中，24小时后全量换液1次，以后常规培育。 结 果 羊BMSCs的形态学特征：原代细胞在培育瓶底散在分布，呈圆形，胞体透亮，折光性好，细胞核呈卵圆形，有较多的骨髓造血系细胞混杂。3天后换液可去掉大部分悬浮细胞，9天
6、换液后悬浮细胞基本去除，瓶底聚集生长的细胞形态多不规则，15天可见多处聚集生长的细胞群脱落，中心细胞为梭形，可见23个突起。依据生长状况每47天进行1次传代，传代细胞接种后24小时即快速贴壁、伸展，610小时活细胞基本完成贴壁；25天细胞呈梭形或不规则的三角形，也有扁平形带突起的细胞，胞内可见24个核匀称分布。传代细胞的生长较原代较快，接种后7天即可铺满整个培育瓶底。 冻存复苏的活细胞率为95.6%，细胞贴壁较传代细胞稍慢，24小时后仍有部分细胞未贴壁，8天即可铺满培育瓶底。 羊BMSCs的生长曲线测定：三代细胞生长周期基本一样，接种培育后前23天，生长较缓慢，为生长迟滞期；3天后细胞生长加速
7、，达到对数生长期；78天细胞数达最高值，为生长平台期，其后生长速度减缓。光镜下视察显示免疫细胞化学染色后的细胞膜抗原CD44有阳性表达。 讨 论 本组试验采纳梯度密度离心法，操作简便，成本低。但MSCs体外培育时具有底物粘附性，造血细胞等因无法贴壁而 随换液被清除。结果显示，所培育细胞的干细胞P3、P5、P7三代细胞的生长曲线基本一样，培育时间基本同步，表明为同一干细胞的来源。因为所培育细胞的细胞膜抗原CD44阳性，而这些抗原是造血干细胞表面没有的，这说明培育的细胞不是骨髓中的造血干细胞。综上所述，本组试验证明，我们所培育的细胞不是骨髓造血干/祖细胞和成纤维细胞，而是处于未分化阶段的均一的骨髓
8、间充质干细胞，具有较强的遗传稳定性和增殖实力，可随冻随取，适于建立种子细胞库，是作为骨组织工程种子细胞的合适选择。 参考文献 1 Oyajobi BO，LDmri A，Hott M，Marie PJ.Isolation and characterization of human clonogenic osteoblast progenitors immunoselected from fetal bone marrow stroma using STRO-1 monoclonal antibody.J Boneer Res，1999，14(3):351-61. 2 Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.Science，1997，276:71-74. 3 Haynesworth SE，Baber MA，Caplan AI.Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies.Bone，1992，13:69-80.