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1、生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武生物竞赛-生物化学-36DNA转录-顶级资源生物化学原理(第二版)(三)(62张PPT)提纲提纲1DNA转录的一般特征2依赖DNA的RNA聚合酶3细菌的DNA转录1.转录的起始2.转录的延伸3.转录的终止4真核生物的DNA转录1.真核细胞核转录系统与细菌转录系统的异同2.真核细胞核DNA的转录5古菌的DNA转录中心法则中心法则-“一个中心（DNA），两个基本点（RNA和蛋白质”DNA 转录与转录与DNA复制的比较复制的比较与DNA复制的共同性质 1)需要模板、解链和解除转录过程中形成的正超螺旋 2)只能按照53的方向进行 虫草素可以证明此。与DN
2、A复制不同的性质 1)不需要引物 2)NTPs 代替dNTPs;UTP代谢dTTP 3)缺乏校对活性（错误率在1/104 1/105 nts）4)发生在特定的区域（不是所有的DNA序列）5)对于一个特定的基因而言，只有一条链转录 记住一些名称模板链（无意义链，Watson链）和编码链（有意义链，Crick链）证明证明DNA复制从复制从53的实验的实验编码链，有意义链，编码链，有意义链，Crick 链链模板链，无意义链，模板链，无意义链，Watson 链链转录转录翻译翻译细菌细菌RNA聚合酶聚合酶*第一种被发现的合成核酸的酶是第一种被发现的合成核酸的酶是多聚核苷酸磷多聚核苷酸磷酸化酶酸化酶（PN
3、P）1955年，Marianne Grunberg-Manago和Severo Ochoa 首先报道一种催化RNA合成的酶。Ochoa因此和Arthur Kornberg荣获1959年的诺贝尔医学、生理学奖*真正的大肠杆菌真正的大肠杆菌RNA聚合酶聚合酶 1960年，由四个独立的研究小组（Sam Weiss，Jerard Hurwitz，A.Stevens 和J.Bonner）几乎同时从大肠杆菌中得到。此酶需要模板，使用4种 rNTPs为底物，合成和模板链互补的序列，需要Mg2+.RNA聚合酶聚合酶*共同的性质 -DNA模板：一条链被转录 -底物：GTP,CTP,UTP,ATP -二价金属离子
4、：Mg2+*与DNA聚合酶之间的主要差别 RNA聚合酶与聚合酶与DNA聚合酶的差别聚合酶的差别RNA聚合酶只有 53的聚合酶活性，无5-外切酶或3-外切酶的活性。RNA聚合酶缺乏 3-外切酶的活性是转录忠实性不如复制的主要原因；RNA聚合酶本身就能促进DNA双链解链；RNA聚合酶催化转录的从头合成，不需要引物；RNA聚合酶与进入的NTP上的2-OH有多重接触位点；RNA聚合酶在转录的起始阶段，DNA分子会形成皱褶，以使在发生无效转录时，仍然能与启动子结合；在转录过程中，转录物与模板解离，而在复制中，DNA聚合酶上开放的裂缝允许DNA双链从酶分子上伸展出来；RNA聚合酶在转录的起始阶段受到多种调
5、节蛋白的调控；RNA聚合酶的底物是NTP，而不是dNTP，由UTP代替dTTP；RNA聚合酶启动转录需要识别启动子；RNA聚合酶的反应速度低，平均值只有50nt/秒。细菌细菌RNA聚合酶的结构与功能聚合酶的结构与功能C所有的三类RNA由同一种RNA聚合酶催化 大肠杆菌的RNA聚合酶大小为465 k，含有2,1,1,1,1亚基*全酶*核心酶：2,1,1,1*抑制剂：利福霉素和利链霉素大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶全酶的组成及其功能分工聚合酶全酶的组成及其功能分工亚基基因大小（k）每一个酶分子中的数目功能亚基亚基亚基亚基70因子RopARopBRopCRopZRopD3615115511702111
6、1聚合酶的组装，转录的起始，与调节蛋白的相互作用转录的起始和延伸DNA结合在体外为变性的RNA聚合酶成功复性所必需启动子的识别a aa a2 2 a a2 2b b a a2 2bbbb=核心酶核心酶12核心酶核心酶无序列特异性无序列特异性,非特异性转录起始非特异性转录起始+正常生长正常生长(主要的条件下主要的条件下)s s7070热休克热休克(应急条件下应急条件下)s s3232N N饥饿饥饿(应急条件下应急条件下)s s6060 因子因子可以互换的可以互换的,启动子识别启动子识别核心酶的组装核心酶的组装(w(w亚基是组装效率提高亚基是组装效率提高)12s s7070RNARNA聚合酶全酶聚
7、合酶全酶启动子特异性启动子特异性的转录起始的转录起始抗抗因子因子C抗因子能够与内源的因子形成复合物，而抑制因子的功能.CRsd是一种抗70 因子。它并不存在于对数生长期的大肠杆菌细胞.然而，如果大肠杆菌进入稳定期，Rsd合成 以后，阻断 70 的活性，从而使S 与核心酶结合，启动稳定期阶段的基因表达。C枯草杆菌孢子发生的控制涉及抗因子和抗抗因子！Taq RNA聚合酶核心酶的三维结构聚合酶核心酶的三维结构真核细胞的真核细胞的RNA聚合酶聚合酶真核细胞的RNA聚合酶出现了功能分工，不同性质的RNA由不同的RNA聚合酶催化转录，其细胞核具有三种RNA聚合酶，即RNA聚合酶I、II、和III，三者也分
8、别被称为RNA聚合酶A、B和C，它们分别催化细胞核内的rRNA（5S rRNA除外）、mRNA和小RNA（tRNA和5SrRNA）的转录。除此以外，线粒体和叶绿体也含有RNA聚合酶。原核生物与真核生物的原核生物与真核生物的RNA 聚合酶在三维结构上的比较聚合酶在三维结构上的比较RNA聚合酶聚合酶 II 抑制剂抑制剂N白毒伞含有有毒的环状十肽鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱E这种蘑菇口味不错，但却是致命的！E 食用6 24小时之后，开始出现强筋挛和腹泻E第3天出现假恢复E第4或第5天，死亡随时发生，除非进行肝移植鹅膏蕈碱的化学结构鹅膏蕈碱的化学结构真核细胞核真核细胞核RNA聚合酶共同的性质聚合酶共同的性质*都是
9、大的多亚基蛋白质（500-700 k）*都有两个大的与大肠杆菌RNA聚合酶和亚基同源的亚基，因此活性中心是保守的*都有与大肠杆菌a亚基同源的亚基*然而，真核RNA聚合酶没有与大肠杆菌因子同源的亚基*这些性质是所有真核生物RNA聚合酶共同的酵母细胞酵母细胞RNA聚合酶聚合酶II的亚基组成及功能的亚基组成及功能羧基端结构域羧基端结构域CTD所有的真核细胞RNA聚合酶II最大亚基的CTD都含有一段由7个氨基酸残基组成的高度保守的重复序列，其一致序列是富含羟基氨基酸的YSTPSPS，因此能够被磷酸化修饰。在酵母细胞，该序列重复了26次，哺乳动物则重复56次。该重复序列是RNA聚合酶II的活性所必需的。
10、缺失突变实验表明，酵母的CTD至少需要13段重复序列它才能保证酵母细胞能够生存。其它研究还表明，CTD没被磷酸化的RNA聚合酶II参与转录的起始，CTD被磷酸化以后，转录才从起始阶段进入延伸阶段，而且磷酸化的CTD对于转录的后加工（带帽和加尾）也是必需的。转录的详细机制转录的详细机制*三步骤反应 1)起始 2)延伸 3)终止细菌的细菌的DNA转录转录*起始 1)什么是启动子？2)如何决定启动子序列？DNA酶I足印法 3)启动子一致序列 4)转录复合物的形成*延伸*终止放射性同位素标记放射性同位素标记DNA酶酶I足印法足印法实验组实验组对照组对照组DNA酶酶I部分消化部分消化缺少的片段缺少的片段
11、电泳电泳 放射自显影放射自显影足印足印细菌启动子的性质细菌启动子的性质*启动子通常由转录起始点上游40bp长的序列组成*包括两段一致序列：“-35 区区”一致序列是TTGACA Pribnow盒盒或或“-10 区区”一致序列是TATAAT*“35”区区和“10区区”之间的间隔序序列的性质不重要，但长度重要，一般为171bp。*“增效元件增效元件”发现在某些转录活性超强的rRNA基因的上游40和60之间的区域，富含AT的启动子序列，可将转录活性提高30倍。*如果一个基因的启动子序列与一致序列越相近，则该启动子的效率就越高，为强启动子；反之，就是一个弱启动子。细菌几种基因的启动子序列细菌几种基因的
12、启动子序列大肠杆菌不同大肠杆菌不同因子识别的启动子的一致序列因子识别的启动子的一致序列细菌启动子细菌启动子35区和区和10区之间的距区之间的距离对离对RNA聚合酶识别和结合的影响聚合酶识别和结合的影响 转录的起始转录的起始1.RNA聚合酶与dsDNA非特异性结合2.RNA 聚合酶全酶与启动子形成封闭复合物3.封闭复合物异构化，转变成开放复合物4.第一个磷酸二酯键形成 5.启动子清空 细菌基因转录从起始阶段向延伸阶段的转变细菌基因转录从起始阶段向延伸阶段的转变RNA聚合酶催化磷酸二酯键形成的反应机制聚合酶催化磷酸二酯键形成的反应机制 RNA聚合酶催化聚合酶催化1个磷酸二酯键形成以后面临的个磷酸二
13、酯键形成以后面临的3种选择种选择转录的延伸转录的延伸一旦因子释放，转录就进入延伸。失去因子的核心酶通过松散的“滑动钳”构象握住DNA，以更快的速度前进。转录泡则随着核心酶的移动而移动，其大小维持在17 bp左右。解链形成的超螺旋可被结合在转录泡前面的拓扑异构酶解除。由于转录的方向始终是从53，新参入的核苷酸总是被添加在RNA链的3-OH端。每参入一个新的核苷酸，RNA-DNA杂交双链必须发生旋转。在延伸阶段，RNA链3端大约有9 bp长的片段与模板链形成A型杂交双螺旋。延伸的平均速度约为50nt/秒。但延伸速度并不是恒定的，有时聚合酶的移动速度趋缓，甚至发生暂停。如果发生这种情形，重新启动转录
14、需要GreA和GreB来解除暂停状态：先是RNA聚合酶倒退，然后，GreA和GreB切除 3端几个核苷酸，以便让RNA的3-OH能重新回到活性中心。转录延伸和转录泡的结构转录延伸和转录泡的结构两种机制 C依赖于因子的终止C不需要因子，但需要RNA转录物3-端一段被称为终止子的序列。转录的终止转录的终止不需要不需要因子的终止机制因子的终止机制依赖依赖因子的转录终止因子的转录终止细菌和真核生物在转录上的差别细菌和真核生物在转录上的差别$染色质和核小体结构对转录有深刻的影响$真核细胞RNA聚合酶高度分工$转录还需要许多被称为转录因子的蛋白质的参与$启动子以外的序列参与调节基因的转录$转录与翻译不存在
15、偶联关系$转录的产物多为单顺反子，而原核基因的转录产物多为多顺反子增强子的性质增强子的性质增强子作用的环出模型增强子作用的环出模型 其他顺式作用元件其他顺式作用元件*ERE雌激素反应元件*HSE热激元件*MRE金属反应元件*GRE 糖皮质激素反应元件*CREcAMP反应元件*SRE血清反应元件RNA聚合酶聚合酶I所负责的基因的转录所负责的基因的转录*启动子 1)核心启动子(-45 to+20)2)上游控制元件(UCE;-180 to-107)UCE和核心启动子之间的距离十分重要；具有物种特异性*转录因子 1)SL1:TBF+TAF 2)UBF*转录的起始、延伸*转录终止需要一种特异性的DNA结
16、合终止因子 RNA聚合酶聚合酶I负责的基因的启动子结构以及与转录因子的结合负责的基因的启动子结构以及与转录因子的结合RNA聚合酶聚合酶III所负责的基因转录所负责的基因转录该酶负责小RNA的转录，如tRNA、5S rRNA、7S RNA、snoRNA和无帽子结构的snRNA和某些病毒的mRNA等。启动子分为两类：一类与RNA聚合酶II相似，也位于基因的上游；另一类为内部启动子。转录因子有TFIIIA、B和C。其中TFIIIC为组装因子，负责与A盒和B盒结合。TFIIIB是定位因子，结合于A盒的上游约50bp的位置，但结合无序列特异性。TFIIIA仅为5S rRNA基因的转录所必需的组装因子。转
17、录的起始和延伸转录的终止与细菌不依赖于因子的终止机制有点相似，需要1段富含GC的序列和1小串U，但U的长度短于细菌，且富含GC区域也不需要形成茎环结构由由RNA 聚合酶聚合酶催化转录的基因的启动子结构催化转录的基因的启动子结构tRNA 基因转录的起始和延伸基因转录的起始和延伸RNA聚合酶聚合酶II所负责的基因转录所负责的基因转录催化mRNA、miRNA、具有帽子结构的snRNA和某些病毒RNA的基因转录。mRNA的基因转录受到多种顺式作用元件的控制，包括核心启动子、调控元件、增强子和沉默子。核心启动子功能与细菌的启动子相当，负责招募和定位聚合酶II到转录起始点，以正确地起动基因的转录，也可能通
18、过促进转录复合物的装配或稳定转录因子的结合而提高转录的效率。核心启动子包括：TATA盒、起始子（Inr）、TFIIB识别元件（BRE）、下游启动子元件（DPE）和GC盒。调控元件所起的作用是调节基因的转录效率，包括上游临近元件（UPE）和上游诱导元件（UIE），两者的作用都需要结合特殊的反式作用因子。参与蛋白质基因转录的转录因子有两类，一类为基础转录因子，另一类属于特异性转录因子。前者为所有的蛋白质基因表达所必需，后者为特定的基因表达所必需 转录的起始是各转录因子和RNA聚合酶II按照一定次序，通过招募的方式形成PIC。转录因子和聚合酶II与启动子结合的前后次序可能是：TFIIDTFIIATF
19、IIB(TFIIF+RNAP II)TFIIETFIIH。转录终止于一段终止子区域，但终止子的性质以及它如何影响终止的尚不知晓 真核生物真核生物RNA聚合酶聚合酶II的启动子序列的启动子序列RNA聚合酶聚合酶II的基础转录因子的基础转录因子转录因子亚基数目功能TFIID1TBP12TAFs与TATA盒结合调节功能，有1个与Inr结合TFIIA3稳定TBP与启动子的结合TFIIB1招募RNAPII，确定转录起始点TFIIF2与RNAPII结合，去稳定聚合酶与DNA的非特异性结合，确定转录起始过程中模板的位置。TFIIE2协助招募TFIIH，激活TFIIH，促进启动子的解链。TFIIH9具有ATP
20、酶、解链酶、CTD激酶活性，促进启动子解链和清空。TFIIS1刺激RNAPII的剪切活性（切掉错误参入的核苷酸），提高转录的忠实性。预起始复合物的形成预起始复合物的形成TBP(TFIID)与核心启动子结合与核心启动子结合(TATA+Inr)招募招募TFIIB招募招募RNAP II+TFIIF招募招募TFIIE招募和刺激招募和刺激TFIIH解链酶活性解开靠近转录起始点的解链酶活性解开靠近转录起始点的DNA序列序列激酶活性磷酸化激酶活性磷酸化CTDRNA聚合酶聚合酶II催化的基因转录预起始复合物的形成催化的基因转录预起始复合物的形成RNA聚合酶聚合酶II催化的基因转录的全过程催化的基因转录的全过程
21、RNA 聚合酶聚合酶催化的转录延伸催化的转录延伸TFIIS 诱导诱导的的mRNA 剪切剪切古菌的古菌的DNA 转录转录与复制系统相比，古菌似乎拥有简版的真核转录系统。无论是催化转录的RNA 聚合酶的结构和性质，还是启动子的结构以及转录的基本过程都与真核生物极为相似。然而，在基因表达的调控方面，古菌与细菌接近。在启动子的结构上，古菌类似于真核生物由RNA 聚合酶所负责转录的基因，一般由三个部分组成：一是位于转录起点上游的TATA 盒，它由TBP 识别；二是位于TATA 盒上游的BRE，它由TFB 识别；三是位于转录起点的起始子元件（Inr）古菌基因转录的起始古菌基因转录的起始生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢