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1、生物质谱Conventionalmassspectrometersusedforlowvolatilemolecularweightsamplesthatareintroducedinthevaporphasearecalledsingle-focusingmassspectrometers.2020世纪世纪6060年代年代 质谱技术在质谱技术在有机化合物小分子有机化合物小分子的结构测定中得的结构测定中得到应用，而对于大分子到应用，而对于大分子(分子量超过分子量超过1000Da)1000Da)、极性、极性分子和难气化的分子，则显得无能为力。分子和难气化的分子，则显得无能为力。7070年代年代
2、MacfarlaneMacfarlane等人发明了一种被称作等离子体解吸等人发明了一种被称作等离子体解吸(Plasma desorption,PD)(Plasma desorption,PD)的离子化技术，使得质谱的离子化技术，使得质谱测定分子量范围测定分子量范围扩大到几千道尔顿扩大到几千道尔顿。8080年代初年代初 BarberBarber等人又引入了快原子轰击等人又引入了快原子轰击(fast atom (fast atom bombardmentbombardment，简称，简称FAB)FAB)电离技术，并成功地测定了一电离技术，并成功地测定了一个个2626肽的结构，从而使得质谱技术肽的结
3、构，从而使得质谱技术应用于蛋白质和肽应用于蛋白质和肽的结构测定这一设想变为现实。的结构测定这一设想变为现实。8080年代末年代末 John Fenn John Fenn 发明的电喷雾电离发明的电喷雾电离(electrospray(electrospray ionizationionization，ESIESI)和和HillenkampHillenkamp等人发明的基质辅助激等人发明的基质辅助激光解吸电离光解吸电离(matrix assisted laser desorption(matrix assisted laser desorption ionization,ionization,MAL
4、DIMALDI)。使质谱分析生物大分子成为可能。使质谱分析生物大分子成为可能。第二节第二节 生物生物质谱仪及其相关技术质谱仪及其相关技术 2.1 2.1 质谱仪组成质谱仪组成 质谱仪由以下四部分组成质谱仪由以下四部分组成：进样系统进样系统按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位；位；离子源离子源用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束；聚成有一定能量和几何形状的离子束；质量分析器质量分析器利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高
5、频电场和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中高频电场和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离；等形式进行分离；检测器检测器用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。2.2 2.2 离子源离子源 离子源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转离子源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解异很大，因此
6、，对于不同的分子应选择不同的离解方法。方法。给样品较大能量的电离方法为给样品较大能量的电离方法为硬电离方法硬电离方法，而给样，而给样品较小能量的电离方法为品较小能量的电离方法为软电离方法软电离方法，后一种方法，后一种方法适用于不稳定或易电离的样品。适用于不稳定或易电离的样品。2.2.1 2.2.1 离子源类型离子源类型电子轰击电离电子轰击电离(Electron Impact Ionization(Electron Impact Ionization，EI)EI)化学离子化化学离子化(Chemical Ionization(Chemical Ionization，CI)CI)场电离，场解吸场电离
7、，场解吸(Field Ionization FD(Field Ionization FD，Field Field Desorption FD)Desorption FD)快原子轰击快原子轰击(Fast Atom Bombardment(Fast Atom Bombardment，FAB)FAB)电喷雾电离电喷雾电离(Electrospray Ionization(Electrospray Ionization，ESI)ESI)基质辅助激光解析电离基质辅助激光解析电离(Matrix-Assisted Laser(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionizatio
8、n Desorption Ionization，MALDI)MALDI)大气压化学电离大气压化学电离 (Atmospheric Pressure Chemical(Atmospheric Pressure Chemical IonizationIonization，APCI)APCI)常用的适用于生物大分子研究的质谱技术方法常用的适用于生物大分子研究的质谱技术方法包括包括FAB-MSFAB-MS、ESI-MSESI-MS、MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS等，而其中又等，而其中又以以ESI-MSESI-MS和和MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS应用最为广泛，这两个新
9、应用最为广泛，这两个新技术明显增加了质谱范围和敏感度，从而导致了新技术明显增加了质谱范围和敏感度，从而导致了新的软件和检测器的发展。的软件和检测器的发展。电喷雾离子化技术电喷雾离子化技术（electrospray ionizationelectrospray ionization，ESIESI）原理：原理：在一个金属喷嘴的尖上加有在一个金属喷嘴的尖上加有2.52.56 kV6 kV高电压高电压，经强电场作用，样品溶液从针尖小孔喷出，成为一个经强电场作用，样品溶液从针尖小孔喷出，成为一个个带正电的液滴。在迎面吹来的热氮气流的作用下，个带正电的液滴。在迎面吹来的热氮气流的作用下，液滴表面溶剂蒸发，
10、液滴表面溶剂蒸发，液滴变小，液滴的电荷密度骤增。液滴变小，液滴的电荷密度骤增。当静电排斥力等于液滴的表面张力时，液滴便发生当静电排斥力等于液滴的表面张力时，液滴便发生崩崩解解(库仑爆炸库仑爆炸)，形成更小的液滴。如此形成的小液滴，形成更小的液滴。如此形成的小液滴以类似的方式继续崩解，于是，液滴中的溶剂迅速蒸以类似的方式继续崩解，于是，液滴中的溶剂迅速蒸干，产生多电荷正离子，在质谱仪内被分析纪录。干，产生多电荷正离子，在质谱仪内被分析纪录。RayleighLimitReached+-+-+-+-Evaporation+Charged Droplets 试样离子准分子离子+-其他离子ESI-MSE
11、SI-MSThehollowstainlesssteelneedleismaintainedatafewkilovolts(kV)relativetothechamberwallsandthecylindricalcathodesurroundingit.Theliquidsampleentersatarateof120L/minthroughtheneedle,butlowerflowrates(10100nL/min)arebecomingmorecommoninmoderninstrumentation.Theelectricfieldattheneedletipdispersesthe
12、liquidbyCoulombicforcesintoafinesprayofchargeddroplets.Thesedropletsmigrateinthefieldtowardtheglasscapillaryinlet.Aflowofdryinggas(typicallyN2at100mL/s)evaporatesthesolventfromthedroplets,sothattheirdiameterdecreases,andthesurfacechargedensityoneachdropletincreases.Whenthissurfacechargedensityreache
13、stheRayleighlimit,theCoulombicrepulsionisapproximatelyequaltothesurfacetension,andthedropletexplodesintosmallerdroplets.这种分子离子特点是这种分子离子特点是带多个电荷带多个电荷。这些离子的形成是。这些离子的形成是靠吸附上或失去若干个质子而形成，所以在正离子或负离靠吸附上或失去若干个质子而形成，所以在正离子或负离子谱上会观察到子谱上会观察到(M+nH)(M+nH)n+n+或或(M-nH)(M-nH)n-n-的峰的峰。对于生物大分。对于生物大分子，在子，在ESIESI谱上出来的往
14、往是一组带不同电荷的分子离子谱上出来的往往是一组带不同电荷的分子离子峰，根据仪器上记录下来的每个峰的质荷比及电荷数即可峰，根据仪器上记录下来的每个峰的质荷比及电荷数即可算出分子量值。算出分子量值。ESI-MSESI-MS优缺点优缺点优点：优点：解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多肽分解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多肽分子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位点的测定问题。点的测定问题。缺点：缺点：样品中的盐类对样品结果影响很大，而且单样品中的盐类对样品结果影响很大，而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分子峰（重叠峰）个分子带电荷不同可形成多种离子
15、分子峰（重叠峰），所以对混合物的图谱解析比较困难。，所以对混合物的图谱解析比较困难。基质辅助激光解析电离基质辅助激光解析电离(MALDI)(MALDI)待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学化学基质基质(matrix)(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使的挥发使样品整合于格状晶体样品整合于格状晶体中，样品然后置于中，样品然后置于激激光离子发生器光离子发生器(lasersource)(lasersource)。激
16、光作用于样品混合。激光作用于样品混合物，使物，使化学基质吸收光子而被激活化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的。此激活产生的能量作用于生物大分子（多肽）能量作用于生物大分子（多肽），使之由固态样品，使之由固态样品混合物变成气态。混合物变成气态。由于多肽倾向于吸收单一光子，故多肽离子带由于多肽倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪质量分析仪(TOF mass analyzerTOF mass analyzer)。飞行时间质量。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一分
17、析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间端探测器所需要的时间。TOFTOF质量分析器被认为是质量分析器被认为是与与MALDIMALDI的最佳搭配。的最佳搭配。MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MSMALDI-MSMALDI-MS特点特点对于一些对于一些分子量较大分子量较大或疏水性强的蛋白质，或疏水性强的蛋白质，MALDIMALDI比比ESIESI更有效。更有效。MALDIMALDI能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化学能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化学性质相差较大的蛋白质混合物。只要能与所选择性质相差较大的蛋白质混合物。只要能与所选择的底物形成稳定的分散体系的样品都能用的底物形成稳
18、定的分散体系的样品都能用MALDIMALDI进进行分析。行分析。MALDIMALDI不受样品所含的添加物、缓冲液或盐的影响，不受样品所含的添加物、缓冲液或盐的影响，且灵敏度也比别的离子化方式高。且灵敏度也比别的离子化方式高。Yes0.005%-0.01%to 50 kDA0.02%-0.03%to 150 kDA150 kDALow tolerance(20 mM)for nonvolatile buffers,alkali metal salts,detergents;online LC-MS used for contaminant removal ESINo0.01%-0.05%to 2
19、5 kDA0.05%-0.3%to 300 kDA350 kDAHigh tolerance(50 mM)for alkali metalsalts,phosphate,urea,etc.;tolerant of somenonionic detergents;intolerant of SDS MALDICompatible withon-line LC/CE-MSMass assignmentaccuracyMW rangeTolerance for buffers,salts,and detergents Ionization method生物质谱两种主要电离方法比较2.3 2.3 质量
20、分析器质量分析器 质量分析器能将带电离子根据其质荷比加以分离，质量分析器能将带电离子根据其质荷比加以分离，质量分析器的主要技术参数是：质量分析器的主要技术参数是：质荷比的范围（质量范围）和分辨率。质荷比的范围（质量范围）和分辨率。质量分析器类型：质量分析器类型：扇形磁分析器，扇形磁分析器，四极杆分析器四极杆分析器 离子阱分析器，飞行时间分析器离子阱分析器，飞行时间分析器 傅里叶变换分析器傅里叶变换分析器四极杆分析器四极杆分析器离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦，一个直流离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦，一个直流固定电压（固定电压（DCDC）和一个射频电压（）和一个射频电压（RFRF）作用在棒）作
21、用在棒状电极上，两对电极之间的电位相反。对于给定状电极上，两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压，特定质荷比的离子在轴向稳的直流和射频电压，特定质荷比的离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。The quadrupole analyzer(or mass filter)is formed by four metal rods(usually high-grade steel),positioned precisely in each corner of an imaginary square.Between diagonally
22、 opposed rods a direct current(dc)voltage is applied,with a superimposed radio frequency(rf)alternating field.Both dc and rf voltages are scanned.Ion trajectories across the quadrupole are complicated.Under given conditions of dc and rf,ions of only one m/z value will reach the detector.All other m/
23、z ions possess unstable paths that impact on the rods.三级四极杆质量分析器三级四极杆质量分析器离子阱分析器离子阱分析器 由两个端盖电极和位于它们之间的由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压（加射频电压（RFRF），通过施加适当），通过施加适当电压就可以形成一个势能阱（离子电压就可以形成一个势能阱（离子阱）。根据阱）。根据RFRF电压的大小，离子阱电压的大小，离子阱就可捕获某一质量范围的离子。就可捕获某一质量范围的离子。离
24、离子阱可以储存离子子阱可以储存离子，待离子累积到，待离子累积到一定数量后，升高环电极上的一定数量后，升高环电极上的RFRF电电压，压，离子按质量从高到低的次序依离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱次离开离子阱，被电子倍增监测器，被电子倍增监测器检测。检测。飞行时间分析器飞行时间分析器 有相同动能，不同质量的离子，因其飞行速度不有相同动能，不同质量的离子，因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的离子的飞行时间不同飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短，质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的而首先到达检测器。各种离子的飞行
25、时间与质荷飞行时间与质荷比的平方根成正比比的平方根成正比。Time of flight analyzers(TOF)allow ions to move across a vacuum tube(usually named flight tube).Ions are generally produced by MALDI or by another technique capable of producing discrete bursts of ions.About 100500 ns after the laser pulse,a strong acceleration field is
26、switched on,and this imparts a fixed kinetic energy to the ions.As the ions travel across the vacuum tube,ions with low m/z travel faster and arrive at the detector first.TOFTOF分析器特点分析器特点TOFTOF质量分析器质量分析器结果简单，容易换算结果简单，容易换算，蛋白质离子在，蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与飞行管内的飞行速度仅与质荷比的平方根成正比质荷比的平方根成正比，因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞行时
27、因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞行时间推算出蛋白质离子的间推算出蛋白质离子的m/zm/z值。与传统质量分析器相值。与传统质量分析器相比，更易得到比，更易得到高分辨率和高测量精度；速度快高分辨率和高测量精度；速度快，离，离子飞行时间仅为几个子飞行时间仅为几个ss和约和约100s100s之间；之间；质量范围质量范围宽宽，可以直接检测到几十万道尔顿的单电荷离子。，可以直接检测到几十万道尔顿的单电荷离子。2.4 2.4 检测器检测器具有特定具有特定m/z m/z 值的离子通过质量分析器打在检测值的离子通过质量分析器打在检测器上，在检测器上产生的放大电流可以作为时间器上，在检测器上产生的放大电流
28、可以作为时间函数用来测定离子强度（丰度）和函数用来测定离子强度（丰度）和m/zm/z。离子源产生的离子的相对强度可以由检测器测量，离子源产生的离子的相对强度可以由检测器测量，其结果通常以其结果通常以m/z m/z 值值作为作为横坐标、离子相对丰度横坐标、离子相对丰度为为纵坐标纵坐标的形式表示。的形式表示。质谱一般可以用两种形式表示，一种是以归一化质谱一般可以用两种形式表示，一种是以归一化（nomalizednomalized）的或者相对丰度（）的或者相对丰度（%RA%RA）的形式来表述，）的形式来表述，另一种是以总离子流的百分数（另一种是以总离子流的百分数（%TIC%TIC）来描述。）来描述。
29、在归一化的质谱中，最高的峰（在归一化的质谱中，最高的峰（largest peaklargest peak）（例如）（例如最丰富的离子，并不一定是所要研究的分析物）被称为最丰富的离子，并不一定是所要研究的分析物）被称为基峰基峰（base peakbase peak），其高度规定为），其高度规定为100100单位，谱中的其单位，谱中的其他峰的相对高度都根据这个峰进行规一化，一次它们的他峰的相对高度都根据这个峰进行规一化，一次它们的相对高度就介于相对高度就介于0 0100100单位之间。单位之间。2.5 2.5 串联质谱串联质谱两个或更多的质谱连接在一起，称为串联质谱。两个或更多的质谱连接在一起，称
30、为串联质谱。最简单的串联质谱（最简单的串联质谱（MS/MSMS/MS）由两个质谱串联而成，）由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器（其中第一个质量分析器（MS1MS1）将离子预分离或加）将离子预分离或加能量修饰，由第二级质量分析器（能量修饰，由第二级质量分析器（MS2MS2）分析结果。）分析结果。Tandem MS or MS/MS has 2 mass Tandem MS or MS/MS has 2 mass spectrometers in seriesspectrometers in seriesMS1MS2MS/MSMS/MS最基本的功能包括能说明最基本的功能包括能说明MS1MS1
31、中的母离子和中的母离子和MS2MS2中中的子离子间的联系。根据的子离子间的联系。根据MS1MS1和和MS2MS2的扫描模式，如的扫描模式，如子离子离子扫描、母离子扫描和中性碎片丢失扫描子扫描、母离子扫描和中性碎片丢失扫描，可以查明不，可以查明不同质量数离子间的关系。同质量数离子间的关系。最常用的就是将一级质谱的分子离子最常用的就是将一级质谱的分子离子(图谱称图谱称MS1)MS1)和惰和惰性原子再一次轰击性原子再一次轰击低能碰撞诱导断裂（低能碰撞诱导断裂（low-energy low-energy collision-induced dissociationcollision-induced d
32、issociation，CIDCID或称碰撞辅助或称碰撞辅助断裂，断裂，collisionally assisted dissociationcollisionally assisted dissociation，CAD)CAD)，从而获得一张碎片图谱，从而获得一张碎片图谱(MS2)(MS2)。2.6 2.6 联用技术联用技术 色谱可作为质谱的色谱可作为质谱的样品导入装置样品导入装置，并对样品进行，并对样品进行初步分离纯化初步分离纯化，因此色谱，因此色谱/质谱联用技术可对复杂质谱联用技术可对复杂体系进行分离分析。因为色谱可得到化合物的保体系进行分离分析。因为色谱可得到化合物的保留时间，质谱可给
33、出化合物的分子量和结构信息，留时间，质谱可给出化合物的分子量和结构信息，故对复杂体系或混合物中化合物的鉴别和测定非故对复杂体系或混合物中化合物的鉴别和测定非常有效。常有效。气相色谱气相色谱/质谱联用（质谱联用（GC/MSGC/MS）气相色谱的流出物已经是气相状态，可直接导入质谱。气相色谱的流出物已经是气相状态，可直接导入质谱。由于气相色谱与质谱的工作压力相差几个数量级，开由于气相色谱与质谱的工作压力相差几个数量级，开始联用时在它们之间使用了各种气体分离器以解决工始联用时在它们之间使用了各种气体分离器以解决工作压力的差异。随着毛细管气相色谱的应用和高速真作压力的差异。随着毛细管气相色谱的应用和高
34、速真空泵的使用，现在气相色谱流出物已可直接导入质谱。空泵的使用，现在气相色谱流出物已可直接导入质谱。液相色谱质谱联用（液相色谱质谱联用（LC/MSLC/MS）液相色谱液相色谱/质谱联用主要用于分析质谱联用主要用于分析GC/MSGC/MS不能分析，不能分析，或热稳定性差，强极性和高分子量的物质，如生物或热稳定性差，强极性和高分子量的物质，如生物样品（药物与其代谢产物）和生物大分子（肽、蛋样品（药物与其代谢产物）和生物大分子（肽、蛋白、核酸和多糖）。白、核酸和多糖）。在蛋白测序方面，在蛋白测序方面，LC-MS/MSLC-MS/MS得到了广泛的应用。得到了广泛的应用。LC-MS/MSLC-MS/MS
35、其他联用技术其他联用技术毛细管电泳毛细管电泳/质谱联用（质谱联用（CE/MSCE/MS）芯片芯片/质谱联用（质谱联用（Chip/MSChip/MS）超临界流体色谱超临界流体色谱/质谱联用（质谱联用（SFC/MSSFC/MS）等离子体发射光谱等离子体发射光谱/质谱联用（质谱联用（ICP/MSICP/MS）第三节第三节 生物质谱的应用生物质谱的应用 1 1分子量的测定分子量的测定2 2蛋白质、多肽纯度的鉴定蛋白质、多肽纯度的鉴定3 3肽质量指纹谱肽质量指纹谱4 4肽序列测定技术肽序列测定技术 5 5蛋白质的翻译后修饰鉴定蛋白质的翻译后修饰鉴定蛋白质鉴定INTERPRETATION OF MASS
36、SPECTRA关于同位素High-resolution MS of low molecular weight compounds results in a series of isotopic同位素peaks for the parent ion and each detectable fragment.The intensity of each peak in the series depends on the relative abundance of a given isotope as well as the number of atoms of a given identity in
37、 the detected fragment.三种质量表示法：Themassofagivenchemicalspeciesmaybecalculatedinthreedifferentways.Thesimplestoftheseusestheinteger整数massofthemostabundantisotopeofeachelement,andresultsinthenominal标称massofthespecies;thisvalueisnotparticularlyusefulinMS.Themonoisotopicmass,calculatedusingtheexactmassof
38、themostabundantisotopeofeachelement,ismoreuseful,especiallyforhigh-resolutionMSoflowmolecularweightspecies.Forbiomoleculesandtheirfragmentions,themostusefulvalueistheaveragemass.Theaveragemassiscalculatedusingelementalatomicweightvaluesthatareaveragedoverallisotopes;thisvalueallowsthepositionoftheen
39、velopepeaktobepredicted.Table15.5showsexamplesofnominal,monoisotopic,andaveragemassvalues.3.1 3.1 分子量的测定分子量的测定Eggwhitelysozyme,forexample,yieldsESImassspectrawithfineparentpeaksbetweenm/zvaluesof1194and1791;thecorrespondingzvaluesare128用用ESI-MSESI-MS和和MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS测定蛋白质和多肽的分子测定蛋白质和多肽的分子量，
40、精确度可达量，精确度可达0.10.10.010.01，这远比其它方法，这远比其它方法(如如SDS-PAGESDS-PAGE、凝胶过滤、超离心等）精确。、凝胶过滤、超离心等）精确。蛇毒类凝血酶活性分子量测定蛇毒类凝血酶活性分子量测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效凝胶过滤色谱以及电高效凝胶过滤色谱以及电喷雾离子化质谱三种方法喷雾离子化质谱三种方法对新发现的一种蛋白质对新发现的一种蛋白质（来源于福建尖吻蝮蛇蛇（来源于福建尖吻蝮蛇蛇毒毒,是一种具有类凝血酶是一种具有类凝血酶活性的弱酸性蛋白质）的活性的弱酸性蛋白质）的分子量进行了测定。分子量进行了测定。测定方法分子量非还原 SDS
41、-PAGE26.2kDa (二硫键未打开)还原 SDS-PAGE29kDa (二硫键被还原)HPGFC24.5kDa ESI-MS30298Da 3.2 3.2 蛋白质、多肽纯度的鉴定蛋白质、多肽纯度的鉴定 根据质谱测定分子量的作用，质谱还可用来作蛋根据质谱测定分子量的作用，质谱还可用来作蛋白质、多肽纯度的鉴定。白质、多肽纯度的鉴定。只要质量有差异的杂质都可以被检出，此方法灵只要质量有差异的杂质都可以被检出，此方法灵敏度高，用量少敏度高，用量少(pmol(pmol水平水平)、速度快，并有独到、速度快，并有独到之处。之处。实例实例1 1：天花粉蛋白天花粉蛋白C-C-端微观不均一，即有二个端微观不
42、均一，即有二个C C末端，一末端，一个多一个个多一个Ala(Ala(即即247247个氨基酸残基个氨基酸残基)，一个少一个，一个少一个Ala(Ala(即即246246个氨基酸残基个氨基酸残基)，用，用ESI-MSESI-MS完全能够分完全能够分辨出来辨出来 实例实例2 2：如猪胰岛素和人胰岛素混在一起，用如猪胰岛素和人胰岛素混在一起，用MALDI-MALDI-TOF-MSTOF-MS也能够清楚地分出二个峰。两者的差异仅在也能够清楚地分出二个峰。两者的差异仅在猪胰岛素猪胰岛素B B链的第链的第3030位为位为Ala(89.09Da)Ala(89.09Da)，而人胰岛素，而人胰岛素相应的位置为相应
43、的位置为Thr(119.12Da)Thr(119.12Da)，两者相差，两者相差30Da30Da。这些。这些差异用其他方法是很难检出的。差异用其他方法是很难检出的。3.33.3蛋白质鉴定蛋白质鉴定 由于各种蛋白质的氨基酸序列由于各种蛋白质的氨基酸序列(一级结构一级结构)不同，不同，蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异，蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异，肽混合物肽混合物质量数亦具特征性，质量数亦具特征性，称为称为肽质量指纹谱肽质量指纹谱(peptide(peptide mass fingerprint,PMF)mass fingerprint,PMF)，可用于蛋白质的鉴定。，可用于蛋白质的鉴定。
44、PMF 流程3.43.4蛋白质及多肽序列测定技术蛋白质及多肽序列测定技术两种经典测序方法：两种经典测序方法：DNADNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰的问题；酸残基的修饰的问题；Edman Edman 降解不能解决降解不能解决N N端封闭的测序的问题。端封闭的测序的问题。A typical procedure for protein sequencing begins by digestion with a protease such as trypsin in order to obtain a collection of trypt
45、ic peptides.Other enzymes and their cleavage sites are described elsewhere.This peptide collection can be ionized using ESI,separated by the first quadrupole according to m/z ratios,and then fragmented(CID),with the resulting fragments analyzed in the third quadrupole.Themassspectrumcanbeanalyzedtoe
46、stablishthepeptidesequence,orcompareddirectlywithapeptidedatabase.Figure15.12depicts描述thistypicalprotocol.TheCIDprocedurecausesmoreorlessrandompeptidebondcleavage.肽段匹配法：肽段匹配法：直接用所得肽段信息或前体直接用所得肽段信息或前体离子产生的未解析的离子产生的未解析的CID CID 图谱与数据库中图谱与数据库中的的CID CID 图谱比较，如图谱比较，如SequestSequest、MascotMascot、Sonat Sonat
47、 等算法；等算法；从头测序法（从头测序法（de novo sequencede novo sequence）:通过直接解释通过直接解释MS/MS MS/MS 数据识别肽序列，这类系数据识别肽序列，这类系统和算法有统和算法有LutefiskLutefisk、SHERENGSHERENG、PEAKSPEAKS、AuDeNSAuDeNS等等,有时还要结合手工解析。有时还要结合手工解析。用特定蛋白水解酶作用于蛋白质，将得到用特定蛋白水解酶作用于蛋白质，将得到的肽段送入一级质谱，产生前体离子，经的肽段送入一级质谱，产生前体离子，经过一定选择的前体离子在碰撞室发生过一定选择的前体离子在碰撞室发生CIDCI
48、D。结果是前体离子肽骨架酰胺键的特异性断结果是前体离子肽骨架酰胺键的特异性断裂，并产生了一系列可用于确定氨基酸序裂，并产生了一系列可用于确定氨基酸序列的列的y y 型和型和b b 型型等离子。获得等离子。获得CIDCID二级质谱二级质谱图后可算出肽序列。图后可算出肽序列。经过经过MS/MS分析的多肽片段分析的多肽片段 literatureKatalin F.Medzihradszky and Robert J.ChalkleyLESSONS IN DE NOVO PEPTIDE SEQUENCING BY TANDEM MASS SPECTROMETRYMass Spectrometry Re
49、views 2015,34,4363胸腺肽胸腺肽11中文名：胸腺肽中文名：胸腺肽11英文名：英文名：Thymosin 1Thymosin 1结构式：结构式：Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-AspSer-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OHAla
50、-Glu-Asn-OH(HOAc)n(HOAc)n 仪器：仪器：4700 ABI Proteomics Analyzer4700 ABI Proteomics Analyzer测试条件：离子化方式：测试条件：离子化方式：MALDIMALDITOFTOFTOFTOF 检测方式：正离子检测方式：正离子 质量扫描范围：质量扫描范围：m/z 50-5000m/z 50-5000 MATRIX MATRIX：CHCA CHCA 3.53.5蛋白质的翻译后修饰鉴定蛋白质的翻译后修饰鉴定磷酸化修饰磷酸化修饰 糖基化修饰糖基化修饰巯基和二硫键定位巯基和二硫键定位 氨基的乙酰化氨基的乙酰化 泛素化修饰泛素化修饰