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1、微生物病理技能训练教程目录第一部分分微生物物病理基基础知识识111 鞭鞭毛菌亚亚门及其其所致病病害的特特点112 接接合菌亚亚门及其其所致病病害的特特点313 子子囊菌亚亚门及其其所致病病害的特特点414 担子子菌亚门门及其所所致病害害的特点点715半半知菌亚亚门及其其所致病病害的特特点8第二部分分微生物物病理实实验基本本操作9921 植物物病理徒徒手制片片技术922 培养养基的配配制和灭灭菌11123 植物物病原菌菌的分离离和培养养1524 真菌菌孢子的的萌发11825 植物物病原物物的接种种2026植植物病原原生物绘绘图技术术21第三部分分微生物物病理技技能训练练23实训一植植物病原原细菌
2、观观察233实训二鞭鞭毛菌亚亚门真菌菌及其所所致病害害症状观观察255实训三接合菌菌亚门真真菌及其其所致病病害症状状观察229实训四子子囊菌亚亚门真菌菌及其所所致病害害症状观观30实训五担担子菌亚亚门真菌菌及其所所致病害害症状观观察355实训六半半知菌亚亚门真菌菌及其所所致病害害症状观观察388微生物病病理技能能训练教教程第一部分分微生物物病理基基础知识识11 鞭鞭毛菌亚亚门及其其所致病病害的特特点1、鞭毛毛菌亚门门的主要要特点(1)鞭鞭毛菌亚亚门真菌菌的共同同特征是是无性产产生具11-2根根鞭毛的的游动孢孢子，因因此通常常称作鞭鞭毛菌。(2)鞭鞭毛菌有有性产生生休眠孢孢子囊和和卵孢子子。(3
3、)鞭鞭毛菌营营养体从从原质团团到无隔隔菌丝体体，属低低等真菌菌。(4)鞭鞭毛菌大大多具有有水生习习性，因因此只有有在高湿湿、多雨雨、低洼洼积水和和通风透透光不好好的条件件下，侵侵染植物物导致病病害。(5)鞭鞭毛菌繁繁殖时，有有的整个个营养体体全部转转变为繁繁殖体，称称为整体体产果，如如壶菌；有的只只是营养养体的一一部分转转变为营营养体，称称为分体体产果。(6)游游动孢子子囊形态态多样，均均可释放放游动孢孢子。(7)游游动孢子子具1-2根鞭鞭毛。鞭鞭毛有茸茸鞭和尾尾鞭两种种。每个个游动孢孢子具单单鞭或双双鞭两种种类型。(8)鞭鞭毛(FFlaggelllum)的结构构是9+2型。既既鞭杆是是由9根
4、根纤丝组组成一个个圆筒型型体，圆圆筒型体体中心还还有2根根纤丝。纤纤丝之间间填充有有胶质鞘鞘。共331条亚亚纤丝。2、鞭毛毛菌亚门门的致病病特点(1)常常见症状状：腐烂烂、斑点点、猝倒倒、流胶胶。(2)果果实上腐腐烂使果果变褐色色、呈软软腐状，病病部长出出白色绵绵毛状或或灰白色色霜状霉霉层。(3)茎茎基和根根部被害害使皮层层变褐色色腐烂。(4)叶叶上斑点点，若由由疫霉引引起，病病斑较大大，暗褐褐色圆形形水渍病病斑；若若由霜霉霉引起，病病斑较小小，黄色色至褐色色，边缘缘不明显显，病斑斑受叶脉脉限制呈呈多角形形，后期期在病斑斑上长出出白色至至灰白色色霜状霉霉层。(5)病病菌以卵卵孢子越越冬，由由孢
5、子囊囊和游动动孢子引引起初侵侵染和再再侵染，借借雨水和和气流传传播。(6)潜潜伏期短短，可多多次再侵侵染，一一般在低低温多雨雨潮湿多多雾、昼昼夜温差差大的气气候条件件下，病病害容易易发生。3、与园园艺植物物有关的的鞭毛菌菌(1)根根肿菌属属（Pllasmmodiiophhoraa）由根肿菌菌属的病病菌引起起的，在在病组织织内这些些呈鱼卵卵状排列列的是病病菌的休休眠孢子子囊。休休眠孢子子囊在寄寄主细胞胞内分散散呈鱼卵卵块状，萌萌发时产产生前端端有2根根鞭毛长长短不一一的游动动孢子。休休眠孢子子囊对不不适宜的的环境适适应性强强，能在在土中存存活多年年，是病病菌的初初侵染源源。（2）腐腐霉属（PPy
6、thhiumm）腐霉是是低等的的鞭毛菌菌，无性性繁殖在在菌丝顶顶端形成成孢子囊囊，孢子子囊近球球形或不不规则形形，成熟熟后一般般不脱落落，萌发发时产生生游动孢孢子。有性繁繁殖在藏藏卵器内内形成一一个卵孢孢子。如引起起黄瓜、茄茄子等幼幼苗瘁倒倒病的病病菌，都都属于腐腐霉属。(3)疫疫霉属（PPhyttophhthoora）孢子囊囊在孢囊囊梗上，孢孢囊梗无无限生长长。孢子囊囊卵圆形形，成熟熟时脱落落，萌发发时产生生游动孢孢子，或或直接萌萌发长出出芽管。有性生生殖在藏藏卵器内内形成一一个卵孢孢子。(4)霜霜霉科（PPeroonossporraacceaee） 高等的的鞭毛菌菌，都是是植物体体上的活活
7、体寄生生菌，菌菌丝蔓延延在寄生生的细胞胞间，以以吸器伸伸入寄主主的细胞胞内吸收收养分。孢囊梗梗有限生生长，呈呈树枝状状分枝。孢子囊囊在孢囊囊梗上形形成，孢孢子囊卵卵圆形，顶顶端乳头头状突起起，萌发发产生游游动孢子子，或直直接长出出芽管。有性生生殖形成成卵孢子子。(5)白白锈菌属属(Allbuggo)活体寄寄生物，菌菌丝在寄寄主细胞胞间蔓延延，以吸吸器伸入入寄主细细胞内吸吸收营养养。孢囊梗梗 不分分枝，短短棍棒状状，密集集在寄主主表下，排排列成栅栅栏状，每每一孢囊囊梗 顶顶端串生生孢子囊囊。孢子囊囊椭圆形形，成熟熟后寄主主表皮散散出如白白锈粉。卵孢子子壁厚，表表面有瘤瘤状突起起。12 接接合菌亚
8、亚门及其其所致病病害的特特点1、接合合菌亚门门的主要要特点（1）菌菌丝体无无隔多核核，细胞胞壁由甲甲壳质组组成。（2）无无性生殖殖形成孢孢子囊，产产生不能能游动的的孢囊孢孢子。（3）有有性生殖殖形成接接合孢子子。2、接合合菌亚门门的致病病特点其多为腐腐生菌，广广泛分布布于土壤壤和粪肥肥中，少少数为弱弱寄生菌菌，可引引起果实实贮藏期期腐烂。已已知接合合菌亚门门分2个个纲、77个目、约约6000个种。与与园艺植植物病害害有关的的是接合合菌纲、毛毛霉目、根根霉属。3、与园园艺植物物有关的的接合菌菌根霉菌（RRhizzopuus）（1）菌菌丝发达达，分布布在基物物上和基基物内，有有匍匐丝丝和假根根。（
9、2）孢孢囊梗从从匍匐丝丝上长出出，顶端端形成孢孢子囊，内内生孢囊囊孢子，孢孢子囊壁壁破散出出孢囊孢孢子。（3）有有性生殖殖形成接接合孢子子（不常常见）。（4）黑黑根霉引引起贮藏藏甘薯软软腐病。13 子子囊菌亚亚门及其其所致病病害的特特点1、 子囊菌菌亚门的的主要特特点（1）营营养体全世界发发现322,0000种，占占真菌的的1/33，都是是高等真真菌，寄寄生，形形态千差差万别，但但共同点点是形成成子囊。子子囊(AAscuus)，子子囊孢子子(Asscossporre)。简简单的仅仅为单细细胞，但但大多数数有发达达的菌丝丝体，菌菌丝有隔隔，每个个细胞有有一个、二二个、多多个核，壁壁以几丁丁质为主
10、主，营养养体可以以形成厚厚垣孢子子。有的的菌丝可可以直接接形成粉粉孢子，芽芽孢子。很很多可以以形成营营养菌丝丝的组织织体。（2）子子囊菌的的无性繁繁殖产生分生生孢子或或孢子器器，非常常发达，形形状多样样，圆形形，卵形形，棒形形，丝状状，镰刀刀形(新新月形)，蜡肠肠形，有有单孢，双双孢，多多孢。有有的有色色，有的的无色。分生孢子子梗：可可以分枝枝或不分分枝，散散生，丛丛生，束束生，(孢梗束束Corremiium)，有的的分生孢孢子梗着着生在简简单的分分生孢子子痤上(Spooroddochhiumm)，有有的形成成在分生生孢子盘盘上(Aceervuuluss)，有有的形成成分生孢孢子器上上(Pyy
11、cniidiuum)。分生孢子子作用：在一个个生长季季可以反反复发生生，是再再侵染的的来源，“可以远距离传播”，有的高等子囊菌在一生中仅发生无性，无有性。（3）子子囊菌的的有性繁繁殖子囊：子囊形形状有圆圆形，椭椭圆形或或棒状。子子囊壁有有的单层层壁，有有的双层层壁,有有的囊壁壁成熟后后溶解，有有的不溶溶，有的的子囊顶顶有孔口口，有的的无孔口口。子囊囊有的单单个散生生，有的的多个并并列，有有的丛生生。子囊囊之间的的有的有有侧丝。子囊孢孢子（AAscoospoore）：形态多多种多样样，圆形形，椭圆圆形，丝丝状，单单胞，双双胞，多多胞，无无色或有有色。在子囊囊内排列列的有散散生，单单列，双双列，并
12、并列，螺螺旋形排排列。子囊果果（Asscoccarpp）：在在子囊外外部具一一菌组织织包被的的壳，这这种类型型的子实实体称子子囊果。子囊果的的类型A、 闭闭囊壳完全封封闭呈球球形。B、子囊囊壳球形或或瓶状，顶顶端有孔孔口。C、子囊囊盘盘状或或杯状，顶顶端开口口大。D、子囊囊座子囊着着生在子子座的空空腔内。2、 与园艺艺植物有有关的子子囊菌(1)外外囊菌属属（Taaphrrinaa）无子囊果果，子囊囊平行排排列在寄寄主表面面呈栅状状。无性性繁殖是是子囊孢孢子在子子囊内芽芽殖产生生芽孢子子，芽孢孢子还可可继续芽芽殖。常常见病状状：畸形形，叶片片皱缩、果果实膨大大等。(2)白白粉菌目目 (EErys
13、shipphalles) 白白粉菌目目的真菌菌一般称称作白粉粉菌，引引致各种种植物白白粉病(Powwderry milldeww)。菌菌丝白色色，大都都表生，产产生吸器器吸取植植物营养养。 主主要寄生生在叶片片上，有有的发生生在新梢梢或芽上上。在病病部形成成白粉或或小黑点点。无性世世代：非非常发达达，由菌菌丝形成成分生孢孢子梗和和分生孢孢子。分分生孢子子链生或或单生，不不断产生生。形成成白粉。有性世世代：寄寄生后期期在菌丝丝的上部部形成闭闭囊壳(小黑点点)，有有附属丝丝，便于于传播。闭闭囊壳内内有一个个或多个个子囊，子子囊内有有2-88个子囊囊孢子，子子囊孢子子单孢无无色。寄生专专化性：专性寄
14、寄生，有有生理小小种，寄寄主有884355种。有有的白粉粉菌只有有一种寄寄主，而而一种寄寄主可寄寄生多种种白粉菌菌。如：桑树有有桑表白白粉，桑桑里白粉粉。柞树树有七种种白粉病病。白粉病病发生的的条件：对温度度要求不不严格，干干旱地区区、潮湿湿地区都都可发生生，白粉粉菌的孢孢子在水水中反而而不易发发芽或破破裂，在在潮湿的的空气中中易发芽芽，该孢孢子渗透透压很高高，366-688个大气气压，因因此很易易吸收周周围的空空气中的的水分。白粉菌菌分属依依据：闭闭囊壳附附属丝的的形状和和壳内子子囊的数数目。白粉菌（闭闭壳菌）：菌丝以以吸器吸吸收营养养；子囊囊着生在在闭囊壳壳内，外外部有附附着丝；菌丝分分化
15、成分分生孢子子梗，顶顶端串生生分生孢孢子，呈呈白粉状状故名白白粉菌。(3)核核菌主要特特点A、这类类真菌种种类多，形形态变化化大，子子囊着生生在具有有孔口的的子囊壳壳内。B、子囊囊壳散生生或聚生生在寄主主的组织织中，子子囊内具具8个子子囊孢子子。C、病害害流行是是分生孢孢子多次次再侵染染。D、病害害症状：引起树树皮腐烂烂、溃疡疡、瘤肿肿和枝枯枯；侵害害果实引引起腐烂烂和轮纹纹等症状状。主要种种类A、小丛丛壳属 Gloomerrellla子囊壳小小，球形形，半埋埋生在子子座内；子囊棍棍棒状，无无侧丝；子囊孢孢子单孢孢无色，长长椭圆形形，稍弯弯曲。有有性世代代在自然然界很少少发生，无无性世代代为炭
16、疽疽菌属(Colllettotrrichhum)。如棉棉花炭疽疽病G.goossyypiii，苹果果梨炭疽疽病G.cinngullataa。B、黑腐腐皮壳属属 （VValssa）子囊壳埋埋生子座座基部，有有长颈伸伸出子座座；子囊囊孢子腊腊肠状，单单胞无色色或暗色色。无性性世代是是壳囊孢孢属(CCytoospoora)。只能能为害树树皮，不不能为害害绿色部部分。苹苹果树腐腐烂病。C、囊孢孢壳属（PPhyssaloospoora）无子座。子子囊壳黑黑色，埋埋生于寄寄主组织织内。子子囊较大大，棍棒棒状，子子囊孢子子单胞，无无色，长长度一般般大于220umm.引起起园艺病病害如梨梨轮纹病病等。D、间座
17、座壳属（DDiapportthe）子囊壳埋埋生在子子座基部部，梨形形或球形形，黑色色，顶端端有短喙喙状突起起。子囊囊圆柱形形，有顶顶环。子子囊孢子子线形多多胞。无无性世代代不发生生。如引引起茄褐褐纹病。（4）腔腔菌主要特特点A、子囊囊着生在在子座的的空腔内内，子囊囊间无侧侧丝，子子囊具双双层壁 。B、无性性生殖发发达，可可形成各各种形态态的分生生孢子，对对植物危危害主要要是分生生孢子侵侵染。C、病害害症状：斑点、疮疮痂和腐腐烂。主要种种类A、痂囊囊腔菌属属 Ellsinnoe子囊在子子囊腔中中不规则则散生，每每个子囊囊腔只有有一个球球形子囊囊，子囊囊孢子长长圆筒形形，3隔隔4胞、无色。为害植植
18、物主要要是无性性世代，在在分生孢孢子盘上上产生分分生孢子子。(痂痂圆孢属属Sphhaceelomma)我我国有性性世代未未发现，主主要无性性。代表表：葡萄萄黑痘病病。球座座菌属GGuiggnarrdiaaB、球座座菌属GGuiggnarrdiaa本属与上上属形态态基本一一致，本本属子囊囊孢子单单胞（假假双孢）。无无性世代代很发达达，包括括在叶点点菌属和和茎点菌菌属。葡葡萄黑腐腐病菌GG.biiwellliii，葡萄萄房枯病病菌G.bacccaee。C、球腔腔菌属 Myccospphaeerellla子囊座着着生在寄寄主叶片片表皮层层下；假假囊壳为为埋生、球球形，或或扁圆形形，孔口口扁平或或呈乳
19、头头状突起起。子囊囊孢子椭椭圆形、无无色，双双胞大小小相等。无无性世代代包括许许多属，如如叶点菌菌属Phhylllosttictta，茎茎点菌属属Phooma，尾尾孢属CCerccospporaa。代表表：禾本本科植物物黑霉病病D、黑星星菌属VVentturiia假子囊壳壳很小，表表面生有有刚毛，埋埋生或表表生。子子囊孢子子椭圆形形，双胞胞大小不不等，淡淡色，个个别褐色色，可为为害植物物叶片和和果实。无无性黑星星孢Fuusiccladdiumm代表病害害：梨黑黑星病VV.piirinna 苹苹果黑星星病V.inaaequueliis（5）盘盘菌子囊果果呈盘状状或杯状状，内生生子囊。子囊盘有些从
20、菌核或假根菌核上长出，盘菌一一般很多多不产生生分生孢孢子。盘菌引引起植物物病害大大多腐生生，少数数寄生。核盘菌属属 Scclerrotiiniaa菌丝体可可以形成成菌核（真真菌核和和假菌核核），菌菌核萌发发后可形形成长柄柄子囊盘盘，子囊囊棍棒状状，平行行排列，有有拟侧丝丝。子囊囊孢子椭椭圆形或或仿缍形形，单胞胞无色。无无性世代代不发生生。寄主范围围很广，可可侵染332科1160多多种植物物。代表表：油菜菜、向向日葵菌菌核病14 担子子菌亚门门及其所所致病害害的特点点 11 锈菌菌胶锈菌菌属（GGymnnospporaangiium）冬孢子双双细胞，有有可以胶胶化的长长柄。没没有夏孢孢子阶段段。
21、梨锈锈病（GG. hharaaeannum ）冬孢孢子阶段段在桧柏柏上，性性孢子和和锈孢子子在梨树树上引起起梨锈病病。柄锈菌菌属(PPuccciniia)孢子双细细胞、有有柄，夏夏孢子单单细胞，小小麦锈病病：小麦麦秆锈病病( PP. ggramminiis )；小麦麦条锈病病(P. sttriiiforrmiss )；小麦叶叶锈病( P. reeconnditte ff.spp trritiici)。层锈菌菌属（PPhakkopssoraa）冬孢子单单细胞，无无柄，不不整齐地地排列成成数层；夏孢子子表面有有刺。枣层锈锈菌（PP. zziziiphii-vuulgaariss ）引引起枣树树锈病
22、。多胞锈锈菌属（PPhraagmiidiuum ）冬孢子33至多细细胞，壁壁厚，表表面光滑滑或有瘤瘤状突起起，柄的的基部膨膨大。玫瑰多多胞锈菌菌（P. roosaee-muultiiflooraee ）引引起玫瑰瑰锈病。单胞锈锈菌属（UUrommycees ）冬孢子单单细胞，有有柄，顶顶壁较厚厚；夏孢孢子单细细胞，有有刺或瘤瘤状突起起。瘤瘤顶单胞胞锈菌（UU.apppenndicculaatuss）引起起菜豆锈锈病。栅锈菌菌属（MMelaampssoraa）冬孢子单单细胞，无无柄，排排列成整整齐的一一层；夏夏孢子表表面有疣疣或刺。亚麻栅栅锈菌（MM.liini）引引起亚麻麻锈菌病病。（2）黑黑
23、粉菌目目（Usstillagiinalles）以双核菌菌丝在寄寄主的细细胞间寄寄生，有有吸器伸伸入寄主主细胞内内。典型型特征是是形成黑黑色粉状状的冬孢孢子。黑黑粉菌分分类主要要以冬孢孢子的形形状、大大小、有有无不孕孕细胞、萌萌发的方方式及冬冬孢子球球的形态态等。引引起园艺艺植物的的病害有有：茭白白黑粉病病、慈。（3）层层菌病原菌特特征：具具较发达达的担子子果，大大多腐生生，少数数是植物物病原菌菌。担子子果如膏膏药状、马马蹄状、伞伞状。层层菌常产产生有性性孢子，很很少产生生无性孢孢子。病病害主要要通过土土壤中的的菌核、菌菌丝或菌菌索进行行传播和和蔓延。层层菌是弱弱寄生菌菌，经伤伤口侵入入到果树树
24、的根部部或枝干干的维管管束，主主要破坏坏木质部部，造成成根腐或或木腐。15半半知菌亚亚门及其其所致病病害的特特点1、半知知菌亚门门的主要要特点常见的有有4种：（1）分分生孢子子梗束（ssynnnemaa）：呈呈束状，基基部聚生生在一起起，顶部部分散，着着生孢子子。（2）分分生孢子子座（ssporrodoochiium）：很短的的分生孢孢子梗聚聚集而成成，垫状状或瘤状状，其上上产生分分生孢子子。（3）分分生孢子子器（ppycnnidiium）：分生孢孢子器（ppycnnidiium）：球形、近近球形、瓶瓶状或不不规则形形的子实实体，具具孔口，孢孢子梗聚聚生其内内。（4）分分生孢子子盘（aacer
25、rvullus）：菌丝纠纠结形成成盘状的的子实体体，有的的分生孢孢子盘中中央或四四周具深深褐色的的刚毛。3、 与园艺艺植物有有关的半半知菌(1)丛丛梗孢菌菌粉孢属属(Oiidiuum)分生孢子子梗直立立。顶部部产生菌菌键型的的分生节节孢子(粉孢子子)。分分生孢子子串生，单单胞无色色。引起起白粉病病，为白白粉菌的的无性阶阶段 橡胶粉粉孢(OO.heeveaae )引起三三叶橡胶胶树的白白粉病。轮枝孢孢属(VVertticiilliium)分生孢子子梗轮状状分枝，产产孢细胞胞基部略略膨大；分生孢孢子为内内生芽殖殖型，单单细胞，卵卵圆形至至椭圆形形，单生生或聚生生。黄黄萎轮枝枝孢(棉棉黄萎病病菌V.
26、albbo-aatruum )引起棉棉花黄萎萎病。青霉属属(Peeniccillliumm )分生孢子子梗直立立，顶端端一至多多次分枝枝，形成成扫帚状状。分枝枝顶端产产生瓶状状小梗，小小梗顶端端产生成成串的分分生孢子子，分生生孢子球球形、单单孢。指状青青霉病菌菌（P.diggitaatumm ）引引起柑桔桔绿霉病病。葡萄孢孢属(BBotrrytiis )分生孢子子梗无色色，顶端端细胞膨膨大成球球形，上上面有许许多小梗梗；分生生孢子单单胞，无无色，椭椭圆形，着着生小梗梗上聚集集成葡萄萄穗状。灰葡萄萄孢(BB.ciinerrea)引起多多种植物物灰霉病病。褐孢属属(Fuulviia )分生孢子子梗
27、黑色色，顶端端或中部部形成分分枝，分分生孢子子黑褐色色，卵圆圆形、圆圆筒形或或不规则则形。引引起的病病害如番番茄叶霉霉病、黄黄瓜黑星星病等。 尾孢属属（Ceercoospoora）分生孢子子梗屈膝膝状，青青褐色至至黑褐色色，分生生孢子多多细胞，线线形、鞭鞭形至蠕蠕虫形。如如花生褐褐斑病、菜菜豆红斑斑病、豇豇豆煤霉霉病等。 链格孢孢属(AAlteernaariaa )分生孢子子梗深色色，顶端端单生或或串生淡淡褐色至至深褐色色、砖隔隔状的分分生孢子子。分生生孢子倒倒棍棒形形、椭圆圆形或卵卵圆形，顶顶端有喙喙状细胞胞。大大孢链格格孢(AA. mmacrrospporaa )引引起棉花花轮纹斑斑病。镰
28、孢霉霉属(FFusaariuum )大型分生生孢子多多细胞，镰镰刀型；小型分分生孢子子单细胞胞，椭圆圆形至卵卵圆形。麦麦类赤霉霉病，瓜瓜类枯萎萎病。（2）黑黑盘孢菌菌黑盘孢目目真菌的的分生孢孢子梗产产生在分分生孢子子盘上。有有的分生生孢子盘盘四周或或分生孢孢子梗之之间具有有黑色的的刚毛。黑黑盘孢目目真菌引引起的病病害如苹苹果褐斑斑病、苹苹果、辣辣椒、茄茄子、黄黄瓜棉花花等的炭炭疽病等等。（3）球球壳孢菌菌分生孢子子器球形形，暗褐褐色，分分生孢子子单胞，无无色，圆圆柱形至至纺锤形形。分生生孢子着着生在分分生孢子子器内。引引起的病病害如苹苹果树腐腐烂病、梨梨干腐病病、苹果果及梨轮轮纹病、棉棉花褐斑
29、斑病、芹芹菜斑枯枯病、茄茄子褐纹纹病等。（4）无无孢菌:除产生生厚垣孢孢子外，不不产生任任何其它它孢子。只只有菌丝丝体，有有时可形形成菌核核。第二部分分 微生生物病理理实验基基本操作作21 植物物病理徒徒手制片片技术一、实验验目的 观察植植物病害害病原物物的形态态，进行行病原物物的分类类鉴定，研研究受病病组织的的组织结结构病变变，受病病植物组组织与病病原物的的解剖学学关系以以及对于于难得一一见病原原物的保保存备用用等，都都需将材材料制成成适当的的显微玻玻片标本本。因此此，徒手手制片技技术也是是植物病病理学研研究的重重要手段段之一。通通过本次次实验系系统学习习实践常常用的徒徒手制片片技术，为为普
30、通植植物病理理学和农农业植物物病理学学的深入入学习以以及以后后开展病病理学的的有关研研究工作作奠定坚坚实的制制片技术术基础。二、内容容、材料料和方法法 徒手手制片的的方法有有整体封封藏法、徒徒手切片片法、组组织透明明制片法法和涂抹抹制片法法等多种种。限于于时间本本实验实实践最为为常用的的整体封封藏法和和徒手切切片法两两种。(一)整整体封藏藏法 对于生生长在植植物病部部表面或或培基上上的菌丝丝体、分分生孢子子、分生生孢子梗梗和其他他孢子器器官以及及线虫等等，可直直接择取取少许封封藏在适适当的浮浮载剂中中，在显显微镜下下观察，根根据材料料的特点点和观察察的目的的可采用用不同的的方法封封藏制片片。常
31、用用的方法法的概括括为挑、刮刮、拨、撕撕四种。 1挑：对于在植物受病部位或基质表面生长繁茂的霉状病原体(如霜霉菌)粉状病原体(如锈菌、白粉菌)以及培养基上的许多培养菌，可用尖细的解剖针等直接挑取封埋制片，挑取病原体的量，在保证选材典型的前提下，越少越好，以免互相重叠，分辩不清。 取黄瓜霜霉病叶，小麦白粉病叶分别挑取霉状物和粉状物镜检病原菌的形态特点。 2刮：对病部病原体稀少，或用放大镜也难辩认霉层的病害标本，可采用两侧具刀的三角刮针(或可用刀片代替)刮取病原物制片。刮的方法是，用刮针的一刃，蘸浮载剂少许，在病部顺同一个方向刮取23次，将刮得的病原蘸在载玻片的浮载剂中封片镜检。浮载剂在保证浮载质
32、量的前提下要尽量少，否则少量的病原体在大滴的浮载剂中极易分散漂流，在显微镜下难以寻找。取玉米小斑病叶，在病斑背面刮制片，镜检分生孢子梗和分生孢子的形态。 3拨：对于产生在植物表皮下或半埋生于基物内的病原体孢子器官。如子囊壳、分生孢子器、闭囊壳等，可将病原体连同寄主组织一同拨下，放入浮载剂中，用两支解剖针，一支稳定材料，另一支拨出植物组织，使病原体外露制片。取小麦全蚀病或白粉病标本，拨小黑点制片，镜检子囊果的形态。 4撕：对于寄生在植物表皮细胞上的病原真菌，也可以将此有病原物的表皮撕下来制片镜检，这种方法不仅能看到病原物形态，而且可以观察病原物与寄主的解剖学关系。 在毛毛雨天自田间取回感染白粉病
33、的麦苗(或在保温箱中取接种染病的麦苗)。用刀片割破叶背表皮再用小镊子轻轻撕下，放在浮载剂中制片镜检白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形态。(二)徒徒手切片片法 欲观察察受病组组织病变变，病菌菌侵入和和寄主体体内扩展展过程，以以及埋生生在基物物内真菌菌子实体体的形态态结构等等，都需需将有关关材料切切成薄片片，进行行镜检，徒徒手切片片是最常常用的简简便易行行的方法法，不需需要特殊殊的设备备，而且且节省时时间，切切成的片片子不仅仅可作临临时观察察，也可可进一步步制成永永久性玻玻片标本本。 徒徒手切片片的基本本用具是是剃刀或或刀片。切切片时先先选取材材料并作作适当的的修整，以以左手的的食指和和姆指捏捏
34、住材料料，中指指顶住材材料下端端，使材材料上端端突出于于手指以以上23毫米米。右手手握稳刀刀，从左左向右后后方斜向向切割。注注意刀口口必须以以材料面面垂直。否否则所得得切面不不正。同同时双手手不应紧紧靠身体体，而是是要活动动自如。用用臂力均均匀地沿沿刀口后后部起拉拉向前方方，连续续切割445片后后，用毛毛笔蘸水水轻轻沿沿刀口取取下，放放入盛有有水的浅浅玻皿中中，在此此过程中中左手握握着的材材料不要要放下，否否则再切切时难按按原位置置拿材料料，此外外，在切切片过程程中，必必须常用用毛笔蘸蘸水湿润润材料，以以免材料料干涸不不便切割割。 对对于过于于柔软或或较薄的的材料，可可以夹在在“夹持物物”中，
35、进进行切片片更为方方便。新新鲜胡鲜鲜卜和马马铃薯块块都可作作“夹持物物”用。实实验室中中通常将将通草、接接骨木或或向日葵葵的茎髓髓，剪成成适当大大小，浸浸于700%酒精精中备用用。 切切割一定定数量的的薄片后后，用移移置环在在浅玻皿皿中选取取合用的的材料薄薄片，放放在载玻玻片的水水滴中，镜镜检合格格者即酒酒精灯上上将水烘烘干并摆摆正材料料，然后后加一滴滴乳酚油油或其浮浮载剂；放在展展片台上上略加热热，镜检检如无气气泡，即即可小心心加盖片片，用吸吸水纸吸吸除多余余的浮载载剂，最最后贴好好标签，平平放于切切片板上上，待干干燥适宜宜时封固固。 徒徒手切片片的缺点点是对于于微小或或过大，柔柔软、多多汁
36、、肉肉质及坚坚硬的材材料不易易切取，也也难制成成连续切切片，此此外切片片的厚薄薄也难一一致。切切片机切切片即可可克服这这些缺点点。三、作业业和思考考题 1每每人交两两片符合合质量要要求的玻玻片标本本。 2整整体封藏藏法和徒徒手切片片法两种种基本徒徒手制片片技术都都在什么么情况下下使用? 徒手手切法制制片有什什么优缺缺点? 怎样解解决这种种方法本本身存在在的问题题?22 培养养基的配配制和灭灭菌一、 实实验目的的 微生物物的生长长发育都都有一定定的营养养需要，培培养基即即人工培培养微生生物、为为其生长长发育提提供所需需营养的的基质。培培养基配配好后必必须经过过灭菌方方能用于于分离培培养微生生物试
37、验验，因此此培养基基的配制制和灭菌菌是植物物病理实实验室中中最基本本的工作作，通过过本次实实验学习习植病实实验室中中常用培培养基的的配制方方法和高高压灭菌菌锅的使使用方法法。二、内容容、材料料和方法法 (一)培培养基的的配制 培养基基按组成成成分及及对这些些成分了了解的程程度分为为天然培培养基、半半组合培培养基和和组合培培养基三三类，从从物理性性质上又又分为液液体培养养基和固固体培养养基两类类，培养养基的种种类不同同，配制制方法也也有差异异，限于于时间，本本次实验验仅配制制马铃薯薯琼脂培培养基和和牛肉膏膏蛋白胨胨培养基基。1马铃铃薯蔗糖糖琼脂培培养基（PPSA） 这是植病实验室最常用的培养基(
38、简称PSA)，主要用于植物病原真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌。 成分：马铃薯200克 蔗 糖 10克 琼 脂 20克加水至1000毫升 方法：将马铃薯洗净去皮切块，加水煮沸半小时，用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入琼脂，加热熔化，再加糖，待完全化后，乘热用双层纱布过滤分装，塞好棉塞高压灭菌。 马铃薯蔗糖琼脂培养基略带酸性，培养真菌无需调节pH，培养细菌则调节pH至中性，此培养基留作下次实验分离培养病原真菌用，故不必调节pH。 5人分作一组，1、2组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约10毫升，灭菌后摆成斜面；其余300毫升，分装在3个250300毫升的三角瓶中，每瓶
39、装100毫升左右，灭菌后妥善保存，留待下次实验使用。2牛肉肉膏蛋白白胨培养养基（NNA） 这种培培养基主主要用于于细菌的的分离和和培养 成分：牛肉浸浸膏 3克 蛋白胨胨 10克克 蔗糖糖 110克 酵母浸浸膏 1克 琼琼脂 20克克加水至至 10000毫升升 方法法：先将将琼脂加加热熔化化于大部部水中，再再将其它它各成分分用少量量水化开开加入，调调节pHH至7，趁趁热用双双层纱布布过滤，分分装，塞塞棉塞高高压灭菌菌。 牛牛肉浸膏膏和酵母母浸膏十十分粘稠稠，不易易称重，称称重时用用小烧杯杯盛装，以以玻璃棒棒沾取，故故要先称称好杯和和棒的重重量后，再再开始沾沾取浸膏膏称重，称称后将杯杯和棒上上粘着
40、的的浸膏洗洗净于锅锅中。 调节培培养基ppH至中中性的方方法如下下：配成成1N的的HCll和NaaOH，并并另分别别稀释配配成1/20 N的HHCl和和NaOOH。取取培养基基2毫升升，加蒸蒸馏水77.5毫毫升，加加指示剂剂溴百里里酚蓝指指示剂55滴，这这时如培培养基的的测样呈呈黄色则则用有刻刻度吸管管加入11/200 N的的NaOOH若呈呈蓝色则则加入11/2OO N的的HCll，使培培养基最最后呈草草绿色即即调节到到中性，此此刻所加加酸或碱碱的毫升升数的225倍即即等于在在10000毫升升培养基基中所需需要加入入lN 的NaaOH或或HCll的毫升升数(注注意这次次是作5500毫毫升培养养
41、基)，加加蒸馏水稀稀释的目目的防止止调节过过程中培培养基凝凝固。调节pHH至中性性的简便便方法是是用石蕊蕊示纸。也也可以用用多孔白白色瓷板板，在孔孔中加少少量培养养基和溴溴百里酚酚蓝或其其它指示示剂12滴，根根据颜色色反应，在在所配的的培养液液中加入入少量llN的NNaOHH或HCCl，然然后再取取样测定定，如此此反复多多次，达达到所需需求的反反应为止止。 55人分为为一组，33、4两两组各作作此培养养基5000毫升升，其中中2000毫升分分装试管管，每管管约1000毫升升，灭菌菌后摆成成斜面，其其余3000毫升升分装在在3个22503000毫升的的三角瓶瓶中，每每瓶装1100毫毫升左右右，灭
42、菌菌后妥善善存放，留留待下次次实验使使用。 图： 培培养基的的分装装装置与棉棉塞。A.培培养基的的分装 1.正确 2.管内太太短，外外部太松松B.棉棉塞的做做法 33.整个个棉塞太太松 44.管内内太紧，外外部太短短松此外，11、2、33、4各各组均制制备155管试管管装和22瓶三角角瓶装的的无菌水水。 (二二)培养养基的灭灭菌 为了得得到某种种病原物物的纯培培养，配配好的培培养基必必须经过过灭菌才才能使用用，灭菌菌是指用用物理或或化学方方法完全全杀死器器物表面面及其内内部的所所有微生生物，灭灭菌与消消毒的概概念不同同，消毒毒则是指指消灭器器物或植植物组织织表面的的某些微微生物(能常称称杂菌)
43、，而不不是消灭灭所有的的微生物物。 灭灭菌的方方法很多多，植病病实验室室常用的的有干热热灭菌和和高压蒸蒸汽灭菌菌两种方方法，一一般培养养皿、吸吸管等玻玻璃仪器器用干热热灭菌法法进行灭灭菌。而而培养基基和实验验用的土土壤，则则用高压压蒸汽灭灭菌法进进行灭菌菌，具体体灭菌方方法和步步骤如下下： 1干热热灭菌法法 (11)将培培养皿、吸吸管等玻玻璃器皿皿洗净干干燥后，用用旧报纸纸包好，或或装入特特制的铁铁筒中(每个吸吸管用纸纸包好后后装入铁铁筒)，包包纸时应应将吸取取的一端端放在取取时先折折开的一一端，以以便取用用时手勿勿触及要要求灭菌菌的一端端。 (2)将将包装好好的玻璃璃仪器摆摆入电热热烘箱中中
44、，彼此此间留有有一定的的空隙以以便流通通空气。 (3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。 (4)待箱内空气排出到一定程度时，闭上排气孔，继续加热至一定温度后，用定温固定温度，灭菌温度一般165175保持1小时即可。 (5)待自然降温冷却后(60以下)才能开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。 2高压压蒸汽灭灭菌法 高压蒸蒸汽灭菌菌法又称称湿热灭灭菌，它它的原理理是利用用高压来来提高蒸蒸汽的温温度，达达到灭菌菌的目的的，其操操作步骤骤如下： (11)关好好排水阀阀门放入入清水至至标度为为止，注注意水量量一定要要加足，否否则容易易造成事事故。 (2)将要灭灭菌的培培养基、灭灭菌水等
45、等装入铁铁丝笼中中，并用用牛皮纸纸盖好后后放入灭灭菌锅中中，关上上器盖，旋旋紧螺旋旋时，先先将每个个螺旋旋旋转到一一定程度度(不要要太紧)，然后后再旋紧紧相对的的两个螺螺旋，以以达到平平衡旋紧紧，否则则易造成成漏气，达达不到彻彻底灭菌菌的目的的。 (3)通通电加温温，同时时打开排排气活门门，排尽尽锅内的的空气，即即活门冲冲出的全全部是蒸蒸气时则则表示彻彻底，此此时可关关闭排气气活门，如如果过早早关闭活活门，排排气不彻彻底，也也达不到到彻底灭灭菌的目目的。通通常当压压力表指指针升至至5磅时，打打开排气气活门放放气，降降至零点点，再关关闭活门门。 (4)压压力表的的指针上上升时，锅锅内温度度也逐渐
46、渐升高，当当压力表表指针升升至155磅时，蒸蒸气温度度相当于于12001211(等于于一个大大气压)，此时时开始计计算灭菌菌时间，控控制热源源，使处处于155磅压力力保持330分钟钟，即能能达到完完全灭菌菌的目的的，然后后停止加加温。 (5)稍微打打开一点点排气活活门，使使锅内蒸蒸气缓慢慢排除，然然后逐渐渐开大活活门，气气压徐徐徐下降，注注意勿使使排气过过快，否否则会使使锅内的的培养基基沸腾而而冲脱或或沾湿棉棉花塞，但但排气太太慢又使使培养基基在锅内内，受高高温处理理时间过过长，这这样对培培养基也也是不利利的。一一般从排排气到打打开锅盖盖以100分钟左左右为好好。 (6)当当压力表表指针降降到零、锅锅内蒸气气完全排排尽时，打打开锅盖盖取出培培养基，如如需制备备固体斜斜面培养养基时，则则应趁热热将试管管斜放在在桌上，上上面盖上上报纸以以免落灰灰尘，冷冷却后便便可收起起。 (7)最最后将高高压灭菌菌器内的的剩余水水排出。 (8)抽取上述灭菌的培养基，放入25温箱中，4