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1、药学综合合实验教教学指导导书 SSepaarattionn Teechnnoloogy andd exxplooitaatioon oof NNatuurall Meediccal课程编号号：14420115 学学时/学学分：一一周/33.0一、指导导书说明明本指导书书根据长长沙理工工大学220066年版生生物工程程专业培培养计划划制定.先修课程程：有机机化学、分分析化学学、天然然药物提提取分离离与开发发利用、药药剂学二、教学学对象生物工程程专业学学生三、课程程性质与与总体要要求1、课程程性质：必修课2、教学学目的与与要求：通过本课课程实验验的学习习，检验验在课堂堂上所学学的理论论知识，使使学
2、生对对理性知知识的理理解更加加深入，掌掌握得更更加牢固固，通过过实验训训练学习习的基本本操作技技能，培培养学生生分析问问题和解解决问题题的能力力，使学学生获得得从事天天然药物物及药剂剂学科研研工作的的基本训训练。通通过实验验，要求求学生掌掌握天然然药物经经典提取取与分离离纯化方方法及其其制剂研研制的基本原理理及其应应用，熟熟悉运用用化学方方法、色色谱方法法来鉴定定化合物物以及原料料药与制剂的的分析测测定方法法等内容容。四、教学学方式、重重点1、教学学方式：实验课课2、重点点内容：天然药药物提取取分离基基本理论论与技术术，提取取分离及及分析方方法;五、考核核方式考查: 实验报报告和出出勤情况况。
3、一、前言言药学综合合实验是是生物工工程综合合实验的的重要组组成部分分。其主主要目的的是：通通过试验验，检验验在课堂堂上所学学的理论论知识。使使学生对对理性知知识的理理解更加加深入，掌掌握得更更加牢固固。通过过试验，训训练学生生的基本本操作技技能，培培养学生生分析问问题和解解决问题题的能力力，使学学生获得得从事天天然药物物科研工工作的基基本训练练。在实验中中，重点点是要加加强对学学生基本本操作技技能的训训练,要要求学生生掌握以以下技能能：要求掌握握常用的的经典方方法的原原理及操操作:其其中包括括液-固提取取法:超超临界提提取、超超声提取取、回流流提取等等）、掌掌握柱色色谱-吸附柱柱等的原原理和基
4、基本操作作和掌握握常用的的经典分分析方法法的原理理及操作作。二、实验验须知在天然药药物化学学实验中中，所用用的药品品多数是是挥发性性、易燃燃、有毒毒、有腐腐蚀性、刺刺激性、甚甚至爆炸炸性药品品，试验验操作又又常在加加温加压压等情况况下进行行，需要要各种热热源、电电器或其其他仪器器，操作作不慎易易造成火火灾、爆爆炸、中中毒、触触电等事事故。但但只要加加强爱护护国家财财产和保保障人民民生民安安全的责责任心，提提高警惕惕，消除除隐患，注注意实验验规则，事事故是可可以避免免的。一)实验验规则1.试验验前必须须先预习实实验内容容，了解解原理和和操作规规程。试试验前应应清点并并检查仪仪器是否否完整，装装置
5、是否否正确，合合格后方方可进行行试验。2.试验验时不准准做与本本实验无无关的事事情，严严禁吸烟烟，不得得擅自离离开，并并应随时时注意反反应情况况，仪器器有否漏漏气，破破裂等。随时记录试验应记的项目，以作正式报告。药品仪器器都是国国家财产产，须节节约爱护护使用，公公用物品品，用完完后立即即放回原原处。不不可调错错瓶塞，以以免污染染，仪器器要洗刷刷干净。操作易燃燃性有机机溶剂，回回流、蒸蒸馏、减减压蒸馏馏时，不不能明火火直接加加热，要要放沸石石或一端端封死的的毛细管管，若在在加热时时发现无无沸石则则应冷却却后再加加，防止止爆沸冲冲出。减减压系统统应装有有安全瓶瓶。加液液时应停停火或远远离火源源，一
6、般般无漏气气开口，冷冷凝水要要通畅。起起封易挥挥发溶剂剂瓶盖时时，脸面面要避免免开瓶口口慢慢启启开，以以防气体体冲脸上上。有毒具腐腐蚀药品品应妥善善保管，操操作后要要立即洗洗手。勿勿粘及五五官和创创口，以免中毒毒。实验验中，有有毒气或或腐蚀性性气体发发生时应在通通风橱中中进行操操作。必必要时可可戴好防防护用具具进行工工作。若将玻管管插入塞塞中时，可可在塞孔孔中涂些些水和甘甘油等润润滑剂，用用布包住住玻管使其其旋转而而入，防防止折断断割伤。试验台上上不放无无用的药药品、仪仪器，实实验时做做到水槽槽、仪器器、桌面面、地上清洁整整齐。3.试验验结束时时 应将将门、窗窗、水、电电、煤气气关好，室室内打
7、扫扫干净，清点仪器后方可离去。二)安全全防火须须知1.实验验室存放放易燃性性有机溶溶剂时要要远离火火源，不不得超过过5000ml。2.在进进行易燃燃性有机机溶剂实实验时，一一定要按按着操作作规程进进行。不不可将易易挥发、易燃燃性有机机溶剂倒倒入水槽槽或废液液缸内。3.烘箱箱内不能能烘盛有有易燃性性溶剂的的器皿。4.消防防器材，沙沙箱、石石棉布、灭灭火器等等应放在在方便固固定的地地点，不不能随意意移动，均均应处于于备用状状态。5.万一一不慎着着火，要要沉着冷冷静积极极抢救，应应立即切切断室内内电源和和火源，用用石棉布将将着火部部位盖严严，使其其断绝空空气而熄熄灭。或或是火势势情况选选用适当当灭火
8、器材进进行灭火火。在实实验室使使用二氧氧化碳灭灭火器较较好，它它具有不不腐蚀不不导电之优点点。在实实验室中中常发生生的事故故如下，应应予以特特别注意意。6.蒸馏馏或回流流加热时时，发现现未放沸沸石，未未等溶液液冷却就就补加沸沸石，结结果溶液液冲出瓶瓶外，于是引引起火灾灾。7.蒸馏馏易燃物物时，忘忘记通冷冷凝水，大大量蒸汽汽逸出亦亦易引起起火灾。8.蒸馏馏易燃物物时塞子子漏气引引起火灾灾。9.用三三角烧瓶瓶作减压压装置的的容器易引起起炸裂。10.加加压操作作结束后后，放气气太快，使使压力计计冲破。11.使使用真空空干燥器器时，用用完就直直接开干干燥器的的放气阀阀，结果果使泵内内的机油油被吸到干干
9、燥器中中，样品品被污染染。12.实实验室水水槽易发发生用抹抹布和碎碎拖布条条堵塞而而造成水水灾。三、实验验教学内容容与学时时冬凌草药材的预处理一)、技技术路线线优化工艺条件超临界流体萃取回流及超声提取减压真空浓缩大孔树脂柱层析与聚酰胺柱层析赤芍药材的预处理减压真空浓缩芍药苷薄层分析及含量测定二)、实实验项目目和学时时序号实验项目目名称学时数必/选开开1冬凌草甲甲素的超超临界流流体萃取取8选开2芍药苷的的提取8必3芍药苷的的分离纯纯化12必4冬凌草甲甲素及芍芍药苷的的薄层分分析及含含量测定定分析12选开备注：本本次实验验红色不不做四、综合合实验一、实验验目的：通过本课课程实验验的学习习，使学学生
10、了解解天然药药物/产产物开发发利用的的基本原原理，熟熟悉运用用化学方方法、色色谱方法法来鉴定定化合物物以及原原料药的的分析测测定方法法等内容容，培养养学生分分析问题题和解决决问题的的能力，要要求学生生掌握天天然药物物经典提提取及超超临界萃萃取与分分离纯化化方法及及其分析析的基本本原理、基基本操作作技能及及其应用用，使学学生获得得从事天天然药物物及药剂剂学科研研工作的的基本训训练。二、实验验原理:一）提取取中药成分分的提取取通常是是利用适适当的溶溶剂和适适当的方方法，尽尽可能地地将所需需要的成成分提取取完全提提取出来来。传统统的中药药提取方方法有溶溶剂提取取法、水水蒸汽蒸蒸馏提取取法和升升华法等
11、等。其中中溶剂提提取法使使用最为为广泛，它它是根据据各种化化学成分分在溶剂剂中的溶溶解度差差异，选选用对所所需有效效成分溶溶解度大大，对不不需要成成分溶解解度小的的溶剂，进进而将有有效成分分从药材材组织内内溶解出出来的方方法，常常用的溶溶剂主要要有水、乙乙醇、甲甲醇、乙乙酸乙酯酯、乙醚醚、苯和和石油醚醚等。提提取的基基本方法法有浸渍渍法(常温浸浸渍法、温温浸法、煎煎煮法)、渗沥沥法、回回流法。现现代提取取方法主主要有：超声提提取、微波萃萃取、超临界界流体萃萃取、酶法辅辅助提取取等；超临界流流体萃取取技术是是近代化化工分离离中的一一种新型型分离技技术，超超临界CCO2萃萃取是采采用COO2作溶剂
12、剂，超临临界状态态下的CCO2流流体密度度和介电电常数较大，对对物质溶溶解度很很大，并并随压力力和温度度的变化化而急剧变化化，因此此，不仅仅对某些些物质的的溶解解度有选选择性，且且溶剂和和萃取物物非常容易分分离。超超临界CCO2萃萃取特别别适用于于脂溶性性，高沸沸点，热热敏性物物质的提提取，同同时也适适用于不不同组分分的精细细分离，即即超临界界精镏。用用超临界界CO22作溶剂剂对生物物、食品品、药物物等许多多产物的的提取和和纯化。芍药苷溶溶于700%乙醇醇，经加加热其溶溶解性更更好，芍芍药苷在在60-80从药材材中溶出出进入770%乙乙醇溶液液，经11-2小小时提取取回流，可可以将其其提取出出
13、来，为为了提取取彻底，一般提取2-3次；第1次一般用药材重量8-10倍体积溶剂，2-3次一般用药材重量4-6倍体积溶剂即可提取干净。二）分离离纯化有时用合合适的方方法和溶溶剂，将将中药提提取液稍稍加浓缩缩，特定定的有效效成分就就会结晶晶析出，但但大多数数情况下下，仍然然是混合合物，还还需要进进一步除除去大分分子杂质质如糖类类、蛋白白和色素素等成分分，用特特定的方方法和技技术经分分离、纯纯化(精精制)才才能得到到所需要要的成分分或单体体。具体体的方法法与技术术线路则则随所需需要的成成分或单单体理化化性质不不同而异异。常用的分分离纯化化方法有有系统溶溶剂分离离法、两两相溶剂剂萃取法法等，系统溶溶剂
14、分离离法是研研究成分分不明的的中药的的最常用用的方法法，两相相溶剂萃萃取法有有简单萃萃取法、连连续萃取取法和液液滴逆流流分配法法，常用用的分离离纯化方方法还有有沉淀法法、结晶晶法、层层析法、分分馏法、色色谱法等等，但一一些新的的技术在在分离、纯纯化方面面比传统统方法具具有更大大的优越越性。中药提取取分离纯纯化技术术种类繁繁多，特特别是近近20年年以来，随随着科学学技术的的进步，出出现了许许多新的的高效分分离纯化化方法，如如大孔树树脂吸附附分离法法、离子子交换法法、有机机溶剂萃萃取法、柱柱层析色色谱法、薄薄层层析析法、凝凝胶色谱谱法、聚聚酰胺色色谱法等等。大孔树脂脂是一类类有机高高聚物吸吸附剂，
15、是是一种非非凝胶型型，注有有致孔剂剂，不含含交换基基团，有有含空隙隙结构的的“纯聚聚合物”。依依据树脂脂的结构构、孔径径和比表表面积的的不同，可可分为不不同的类类型和型型号。其其平均孔孔径在330-1000A，具具有比表表面积大大、附容容量大、择择性好、生生处理方方便、附附速度快快等特点点，特别别适合于于从水溶溶液中分分离化合合物，大大孔树脂脂的吸附附原理，主主要分为为分子间间力、氢氢键和机机械截留留。中药药中所含含成分不不同，与与树脂结结合的方方式也不不同。在在中药提提取中，因因同一工工艺，不不同型号号的树脂脂将会有有不同的的提取效效果。近近年来在在中草药药有效成成分的提提取分离离中受到到普
16、遍重重视。一般酸性性化合物物在酸性性条件下下的吸附附作用较较强；碱碱性化合合物在碱碱性条件件下吸附附作用较较强。中中药化学学成分在在吸附柱柱中常形形成吸附附梯度。一一般来说说，柱子子的直径径与长度度之比应应不低于于1:220才能能达到比比较好的的吸附效效果。大大孔树脂脂的用量量要足量量，使中中药成分分能充分分吸附。一一般树脂脂与药材材用量比比应不低低于1:0.6。树脂脂吸附时时，应控控制适度度的流速速，使药药物成分分吸附充充分。洗脱条件件主要依依据树脂脂的特性性和中药药中所含含化学成成分以及及需要的的有效成成分极性性而定。对中极性的树脂或中药所需要有效成分极性较大者，选用极性较大的洗脱剂；对非
17、极性树脂和所需有效成分极性较小者，选用极性较小的洗脱剂。一般选用60-80的乙醇，可洗脱吸附的大部分成份，如苷类、生物碱、黄酮、蒽醌等,我们选用20的乙醇洗脱芍药苷。三）分析析测定天然药物物有效成成份的分分析方法法很多，主主要有：定性分分析-薄层色色谱、定定量分析析-紫紫外可见见分光光光度法和和高效液液相色谱谱法等，其其中薄层层色谱法法和紫外外可见分分光光度度法操作作简单，灵灵敏度较较高，重重现性较较好，是是天然药药物/产产物常用用的分析析方法。三、实验验材料、仪仪器和试试剂：1、实验验材料：芍药和冬冬菱草2、仪器器：植物物粉碎机机、药物筛筛、CO2超临界界萃取设设备、CO2钢瓶、紫外/可见分
18、分光光度度计、烘箱、电炉、旋转蒸蒸发仪、回流冷冷凝装置置、5000mL磨磨口圆底底烧瓶、研研钵、550、55mL容容量瓶、刻刻度吸管管、层析析柱、三三角瓶等等。3、试剂剂：（1）CCO2 （2）芍芍药苷对对照品 （33）醋酸酸乙酯（4）薄薄层硅胶胶G（55）二氯氯甲烷（66）乙醇醇（7）大大孔树脂脂 （8）NaOH（9）氯仿（10）5香香草醛硫硫酸溶液液：5gg香草醛醛用100%硫酸酸乙醇1100mmL溶解解。（11）0.2%羟甲基基纤维钠钠水溶液液（12）冬菱草草甲素对对照品（13）三氯甲甲烷-甲甲酸（55：1）(14)萘萘酚酒精精溶液四、实验验步骤一、冬菱菱草甲素素的超临临界流体体萃取要求
19、学生生学习和和掌握冬冬凌草甲甲素的超超临界萃萃取方法法，要求求熟悉超超临界萃萃取设备备、工艺艺流程及及操作规规程，了了解超临临界萃取取在天然然产物提提取方面面应用。1、系统统组成及及工艺流流程（1)系系统组成成:该装装置主要要由萃取取釜、分分离釜、精精镏柱、CCO2高高压泵、副副泵、制冷系统统、COO2贮罐罐、换热热系统、净净化系统统、流量量计、温温度、压压力控制制（保护护）系统统等组成成。(2)超超临界流流体萃取取过程简简介被萃取原原料装入入萃取釜釜。采用用CO22为超临临界萃取取溶剂。CCO2气体经经热交换换器冷凝凝成液体体，用加加压泵把把压力提提升到工工艺过程程所需的的压力（应应高于CC
20、O2的超临临界压力力）同时时调节温温度，使使其成为为超临界界CO22流体。CCO2流体作作为溶剂剂从萃取取釜底部部进入，与与被萃取取物料充充分接触触，选择择性溶解解出所需需的化学学成分。含含溶解萃萃取物的的高压CCO2流体经经节流阀阀降压到到底于CCO2临界压压力以下下，进入入分离釜釜（又称称解析釜釜）。由由于COO2溶解度度急剧下下降而析析出溶质质，自动动分离成成溶质和和CO22气体二二部分。前前者为过过程产品品，定期期从分离离釜底部部放出，后后者为循循环气体体，经热热交换器器冷凝成成CO22液体再再循环使使用，整整个分离离过程是是利用CCO2流体在在超临界界状态下下对有机机物有特特殊增加加
21、的溶解解度，而而低于临临界状态态下对有有机物基基本不溶溶解的特特性，将将CO22流体不不断在萃萃取釜和和分离釜釜间循环环，从而而有效地地将需要要分离提提取的组组分从原原料中分分离出来来。COO2萃取取釜分分离分离离回路路；2、超临临界二氧氧化碳萃萃取冬菱菱草甲素素最佳条条件萃取压力力为244 MPPa、温温度为555、萃萃取时间间为2.5 hh、分离离温度为为40。3、操作作步骤二、芍药药苷的提提取、分分离纯化化及分析析一) 药药材处理理1.药材材的预处处理药材先洗洗去泥沙沙,再切切片3-5mmm,最后后晒干,收藏于于干燥处处。2. 药药材的粉粉碎取干燥的的药材片经经植物粉粉碎机粉粉碎,再再过
22、筛二)药物物提取、分分离及分分析1、药物物的提取取-回回流提取取取一定量量的药材材粗粉置置圆底于于烧瓶中中,加入入一定体积积的提取取溶剂在在80左右进行行提取;1.1 正交设设计 考察提取取溶剂乙乙醇浓度度、体积积、提取取时间、提提取次数数对芍药药苷得率率的影响响，每因因素设计计3水平平 ，因因此采用用四因素素三水平平表 LL9(34)。表 1 因素素水平表表因素溶剂浓度度A溶剂体积积B提取时间间(h/minn)C提取次数数D160%乙乙醇61.0/301270%乙乙醇81.5/452380%乙乙醇102.0/6031.2 正交提提取每次实验验取赤芍芍饮片220g用用一定浓浓度乙醇醇回流提提取
23、,实实验设计计如下:表2 正交实实验表N0.ABCD得率111112122231333421235223162312731328321393321R1R2R3R合并提取取液，过过滤，计计算滤液液体积,60-70以下真真空浓缩缩至糖浆浆状的浸浸膏，再再用热水水溶解至至50mL。2、分离离纯化大孔吸附附树脂是是一类不不含离子子交换基基团的交交联聚合合物，理理化性质质稳定，不不受无机机盐类及及强 离离子、低低分子化化合物的的干扰，为为一类吸吸附和筛筛选性能能相结合合的分离离材料，已已广泛用用于分离离、纯化化中药有有效成分分。芍药药苷为具具有一定定极性的的单萜苷苷类化合合物，考考虑洗脱脱剂为乙乙醇，选
24、选择弱或或非极性性树脂较较为合适适。2.1树树脂柱预预处理 使用前前干燥大大孔树脂脂置于995%乙乙纯中浸浸泡过夜夜,再用用蒸馏水水洗至无无醇味备备用。2.2上上样干膏，以以适量水水加热溶溶解后，缓缓慢加到到处理好好的树脂脂柱(干干膏和树树脂 比比1:15)上，平平衡 22 h。2.3水水洗除杂杂先用水洗洗至还原原糖反应应成阴性性 (MMoliischh反应检检测：在在糖的水水溶液中中加入萘酚酚酒精溶溶液，然然后沿试试管壁小小心注入入浓硫酸酸，不要要震动试试管，则则在两层层液面之之间就能能形成一一个紫色色环。)且洗脱脱液无色色澄清。2.4洗洗脱芍药药苷用 200乙醇醇洗至芍芍药苷量量很少(uV
25、检检测)。uuV定性性检测芍芍药苷并并确定收收集含芍芍药苷洗洗脱液，减减压浓 缩得浸浸膏，置置真空干干燥箱，干干燥 224 hh即 得得。制得得 (总总)芍药药苷性状状为淡黄黄、疏松松粉末，味味苦。2.5大大孔吸附附树脂再再生使用后大大孔树脂用用 955乙醇醇洗脱至至呈灰白白色，用用蒸馏水冲冲洗至无无乙醇味味，或加加稀碱浸浸泡 224 hh，蒸馏馏水冲洗洗至中性性，显浅浅灰色即即可备用用。3、分析析测定3.1薄薄层分析析3.1.1薄层层板制作作在研钵中中加入一一定量00.2%羟羟甲基纤纤维素钠钠水溶液,再加入入适量硅硅胶G粉粉（固液液比为11：3）,调和均匀成黏稠状且无气泡,取一定量置于载玻片
26、上震动铺开摊平厚约0.2到0.3mm,晾干,再置于105-110烘箱中活化2-3小时,置于干燥器中冷却备用。3.1.2薄层层分析对照品溶溶液配制制精密称定定对照品品约10 mmg，置置 5 mLL量瓶中中，加 20乙醇溶溶解 ，稀稀释至刻刻度 ，摇摇匀 ，密密塞，即即得。 薄层层析析鉴定用点样微微量进样样器吸取取取赤芍芍总苷样样品供试试液 、芍芍药苷对对照品(含芍药药苷约 2 mmgmmL)溶溶液各55100L（分33-5次次点完，每每点一次次吹干再再点，点点同心园园）分别别点于同同一硅胶胶G薄层层板上，点样的直径不超过5mm，。点样距离一般为1-1.5cm，以氯仿/二氯甲烷一醋酸乙酯-甲醇-
27、甲酸(40：5：10：0.2)或者氯仿-甲醇5:1为展开剂展开，薄板浸入深度约为0.5cm。当展开剂前缘离顶端1cm时取出晾干，喷以5香草醛硫酸溶液 ，加热至斑点显色清晰 ，则供试品与对照品在相应的位置上显相同的蓝紫色斑点，计算比移值Rf并画图。3.2含含量测定定(芍药药总苷)3.2.1测定定波长的的选择 对照品溶溶液和供供试品溶溶液在 2000nm7000nm进进行扫描描，找出出在什么么波长下下有最大大吸收峰峰(阴性性对照溶溶液无吸吸收峰)，试验验选择测测定波长长(2330nmm)。3.2.2 对照照品溶液液的制备备 精密称取取干燥恒恒重芍药药苷对照照品200mg于于 1000 mml量瓶瓶
28、中，加加20%乙醇完完全溶解解并稀释释至刻度度，摇匀匀，即得得0.22mgml标标准储备备液备用用。3.2.3标准曲曲线的制制作 精密量取取标准储储备液00.0 ml、11.0mml、22.0 ml、33.0 ml、44.0 ml、55.0 ml于于5 mml量瓶瓶中，加加20%乙醇稀释释至刻度度，摇匀匀，制成成含芍药药苷系列列标准溶溶液。以以20%乙醇为空空 白，在在 2330nm波长长处测定定其吸光光度，以以浓度(x)为为横坐标标，吸收收度(YY)为纵纵坐标绘绘图，计计算回归归方程，分分析芍药药苷在什什么浓度度范围内内，吸收收度与浓浓度呈良良好的线线性关系系。3.2.4样品含含量测定定 吸
29、取供试试品溶液液，在2230nnm处测测定吸收收度(如如测定值值过大,其浓度度不在线线性范围围内,则则需要将将样品液液适当稀稀释)，按按当日标标准曲线线计算。周一 薄层板板制作:上午 1班 下午22班提取与浓浓缩两个个班全天天连续做做,安排排如下:班组 时时间/mmin班班组 时间/minn11 3011 223 660312 4522 225 660113 6033 221 330114 4533 229 445115 6011 227 660216 3022 228 330317 6022 226 330218 3033 222 445219 4511 224 4453N0.乙醇浓度度/A
30、溶剂体积积/B提取时间间/C提取次数数/D160%6301260%8452360%10603470%6453570%8601670%10302780%6602880%8303980%10451周二 分离纯纯化及薄薄层板制制作与活活化上午 下下午1班:分分离纯化化及浓缩缩 22班:分分离纯化化及浓缩缩2班:活活化 1班班:活化化周三 薄层分分析上午 下午午1班:薄薄层层析析 22班:薄薄层层析析周四 定量分分析上午 下午午1班:定定量分析析 22班:定定量分析析周五 结果统统计分析析及完成成实验报报告作业:1.完成成实验报报告(含含画图计计算Rff值,正正交设计计试验结结果分析析处理,结果分分析与结结论)窗体顶端端18