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1、1. 现代生物物技术包包括?2. 现代生物物技术的的发展趋趋势?3. 新型生物物反应器器?4. 生物技术术药物分分类5. 生物技术术药物的的特点6. 生物技术术在制药药中的应应用7. 基因的概概念与特特性8. DNA的的复制与与表达9. 基因工程程制药 医用用活性蛋蛋白和多多肽类10. 基因工程程技术生生产药品品的优点点11. 基因工程程药物生生产的过过程12. 目的基因因的获得得、克隆隆真核基基因常用用方法13. 人工化学学合成基基因的限限制14. 基因筛选选的新方方法、对对已发现现基因的的改造15. 最佳的基基因表达达体系16. 适合目的的基因表表达的宿宿主细胞胞应满足足哪些要要求17.
2、大肠杆菌菌中的基基因表达达18. 原核细胞胞的基因因组特点点19. 基因克隆隆载体的的定义、特特点20. 质粒的分分类21. 真核基因因在原核核细胞中中表达载载体必须须具备条条件22. 影响目的的基因在在大肠杆杆菌中表表达的因因素23. 基因工程程菌生长长代谢的的特点(菌菌体的生生长与能能量、前前体供应应的关系系)24. 基因工程程菌的不不稳定性性(质粒粒、分裂裂、结构构不稳定定)、其主要机机制25. 常见分裂裂不稳定定的两个个因素、提高质粒稳定性的方法26. 基因工程程菌的培培养方式式27. 影响发酵酵的因素素有28. 高密度发发酵特点点、影响因因素29. 实现高密密度发酵酵的方法法30.
3、基因工程程药物的的分离纯纯化31. 分离纯化化的方法法、基本本原理32. 分离纯化化工艺应应遵循的的原则33. 基因工程程药物的的质量控控制、保保存34. 动物细胞胞的形态态、生理理特点35. 动物细胞胞来源的的药物的的种类36. 动物细胞胞的培养养条件、培培养基37. 动物细胞胞大规模模培养的的方法、特特点、培培养方式式38. 动物细胞胞生物反反应器的的类型、理理想反应应器的基基本要求求39. 动物细胞胞产品纯纯化方法法、动物物细胞制制药的前前景40. 单克隆抗抗体及其其制备41. 基因工程程抗体及及其制备备42. 噬菌体抗抗体库技技术的基基本方法法、特点点43. 基因工程程抗体表表达44.
4、 抗体诊断断试剂的的类型45. 抗体治疗疗药物的的种类46. 植物组织织和器官官的培养养47. 次级代谢谢产物特特点、作作用48. 植物细胞胞培养的的培养基基的组成成、固定定化反应应器49. 影响植物物次级代代谢产物物生产和和累积的的因素50. 植物细胞胞大规模模培养生生物反应应器的类类型、性性能比较较51. 植物细胞胞固定化化培养优优缺点52. 植物细胞胞大规模模培养程程序53. 植物生物物反应器器选择标标准54. 植物细胞胞制药的的进展与与展望55. 酶的特点点、来源源56. 酶工程的的研究内内容57. 利用微生生物生产产酶制剂剂的优点点58. 固定化酶酶的特点点59. 酶和细胞胞固定化化
5、方法与与制备技技术60. 固定化细细胞的特特点61. 固定化细细胞反应应器的类类型和特特点62. 模拟酶的的的概念念及分类类63. 酶的化学学修饰的的目的和和意义64. 酶化学修修饰的方方法65. 修饰酶的的特性66. 酶化学修修饰的应应用及其其局限性性67. 酶的化学学修饰的的前景68. 有机相酶酶反应的的优点、有有机溶剂剂、影响响69. 酶工程优优点70. 发酵工程程的研究究内容71. 优良菌种种的选育育72. 诱变育种种的方法法和原理理73. 营养缺陷陷型的作作用74. 发酵类型型、特点点75. 发酵工艺艺控制76. 细胞破碎碎的方法法及其优优缺点77. 理想的微微生物细细胞生物物反应器
6、器基本要要求78. 基因工程程在发酵酵工程中中的应用用79. 基因工程程菌的遗遗传不稳稳定性的的两种主主要表现现形式是是什么? 主要要机制是是什么 ?80. 在人胰岛岛素ABB链分别别表达法法中,为为何将AAB链编编码序列列与b-半乳糖糖苷酶基基因融合合?81. 阐述基因因工程药药物研制制有那些些主要过过程?82. 对鼠源性性单克隆隆抗体进进行改造造的目的的是什么么?鼠源源性单克克隆抗体体改造后后的小分分子抗体体类型?83. 抗体治疗疗药物有有哪些?1.现代代生物技技术包括括:重组DDNA技技术细胞和和原生质质体融合合技术酶和细细胞的固固定化技技术植物物脱毒和和快速繁繁殖技术术动物和和植物细细
7、胞的大大量培养养技术动物胚胚胎工程程技术现代微微生物发发酵技术术现代生生物反应应工程和和分离工工程技术术蛋白质质工程技技术海洋生生物技术术2现代代生物技技术的发发展趋势势主要体体现在下下列几个个方面:基因操操作技术术日新月月异,不不断完善。新新技术、新新方法一一经产生生便迅速速地通过过商业渠渠道出售售专项技技术,并并在市场场上加以以应用。基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明,21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。转基因植物和动物取得重大突破现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今
8、生命科学发展的一个主流方向,基因治疗取得重大进展,有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。蛋白质工程是基因工程的发展,它将分子生物学、结构生物学、计算机技术结合起来,形成一门高度综合的学科。信息技术的飞跃发展渗透到生命科学领域中,形成形成引人注目、用途广泛的生物信息学。3新型生生物反应应器有:1.气升升式生物物反应器器2.流化化床式生生物反应应器3.固定定床式生生物反应应器4.袋式或或膜式生生物反应应器5.中空空纤维生生物反应应器4.生物物技术药药物分类类1.重组组DNAA技术制制造的多多肽、蛋蛋白类药药物2.基因因药物,包包括基因因治疗药药、基因因疫苗、反反义药物物、核酶酶3.来自自动、植植物、
9、微微生物的的天然药药物4.合成成与半合合成的生生物药物物 按照照医学用用途分类类:1.治疗疗药物,治治疗疾病病是生物物药物的的主要功功能。22.诊断断药物,具具有速度度快、灵灵敏度高高、特异异性强的的特点。3.预防药物,对于许多传染性疾病来说,预防比治疗更重要。5.生物物技术药药物的特特性1.分子子结构复复杂2.具有有种属特特异性33.治疗疗针对性性强,疗疗效高44.稳定定性差55.基因因稳定性性6.免疫疫原性77.体内内t1/2短88.受体体效应99.多效效性和网网络性效效应100.检验验的特殊殊性6.生物物技术在在制药中中的应用用(1)基基因工程程药物品品种的开开发;(22)基因因工程疫疫
10、苗;(3)基因工程抗体;(4)基因诊断与基因治疗;(5)应用基因工程技术建立新药的筛选模型;(6)应用基因工程技术改良菌种,产生新的微生物药物;(7)基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用;(8)利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。7.基因因的概念念与特性性概念:DDNA分分子中含含有特定定遗传信信息的一一段核苷苷酸序列列,是遗遗传物质质的最小小功能单单位。特特性:基因可可自我复复制,基因决决定蛋白白质结构构,基因可可突变。 基因按按功能分分为:结构基基因 调控基基因DNNA的结结构与性性能DNAA的结构构:四种种核苷酸酸(A T CC G)连连接一级级结构、DDNA二二级结构构(,),双双螺
11、旋结结构。DNAA的性质质与功能能:吸收光光谱2660电场中中泳动变性、复复性、杂杂交8.DNNA的复复制与表表达基因因表达转录:在在RNAA聚合酶酶的催化化下以DDNA为为模板合合成mRRNA的的过程。22.翻译译:以mmRNAA为模板板,tRRNA作作为运载载工具,将活化化的氨基基酸在核核糖体上上合成蛋蛋白质的的过程。(1)分分为三个个阶段:起始延长终止(2)翻翻译后的的肽链加加工:羟基化化糖基化化磷酸化化乙酰化化9.基因因工程制制药医用用活性蛋蛋白和多多肽类包包括:免役性性蛋白,如如各种抗抗原和单单克隆抗抗体。细胞因因子,如如各种干干扰素、白白细胞介介素、集集落刺激激生长因因子、表表皮生
12、长长因子及及凝血因因子。激素,如如胰岛素素、生长长激素、心心钠素。酶类,如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物岐化酶等。10.基基因工程程技术生生产药品品的优点点1.利用用基因工工程技术术可大量量生产过过去难以以获得的的生理活活性蛋白白和多肽肽(如胰胰岛素、干干扰素、细细胞因子子等),为为临床使使用建立立有效的的保障。2.可以提供足够数量的生理活性物质,以便对其生理、生化和结构进行深入的研究,从而扩大这些物质的应用范围。3.利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。4.内源生理活性物质在作为药物使用时,存在不足之处,可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造。5.利用
13、基因工程技术可获得新型化合物,扩大药物筛选来源。11.基基因工程程药物生生产的过过程(步步骤)目的基基因的克克隆构建DDAN重重组体DANN重组体体转入宿宿主菌构建工工程菌工程菌菌发酵表达产产物的分分离纯化化产品的的检验等等基因工程程药物制制药的主主要程序序获得目的的基因组建重重组质粒粒构建工工程菌(或或细胞)培养工程菌 产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装12.目目的基因因的获得得 克克隆真核核基因常常用方法法:逆转转录法和和化学合合成法。逆转录录法 :逆转录录法就是是先分离离纯化目目的基因因的 mmRNAA,再反反转录成成 cDDNA,然然后进行行 cDDNA 的克隆隆表达。 mRN
14、A的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA的克隆 将重组体导入宿主细胞: cDNA文库的鉴定:抗性基因失活法、噬菌斑颜色改变法 目的cDNA克隆的分离和鉴定:核酸探针杂交法、免疫反应鉴定法化学合合成法 :较小小的蛋白白质或多多肽的编编码基因因可以用用化学合合成法合合成。必必须知道道目的基基因的核核苷酸顺顺序或目目的蛋白白质的氨氨基酸顺顺序。再再按相应应的密码码子推导导出DNNA的核核甘酸序序列。用用化学法法合成目目的基因因DNAA不同部部位的两两条链的的寡核苷苷酸短片片段,再再退火成成为两端端形成粘粘性末端端的DNNA双链链片段,然然后将这这些双链链片段按按正确的的次序进进
15、行退火火使连接接成较长长的DNNA片段段,再用用连接酶酶连接成成完整的的基因。13.人人工化学学合成基基因的限限制有: 不能合合成太长长的基因因 目前前 DNNA 合合成仪所所合成的的寡核苷苷酸片段段仅为 5060 bp,因因此只适适用于克克隆小分分子肽的的基因。遗传密码的简并使选择密码子困难,用氨基酸顺序推测核苷酸序列,得到的结果可能与天然基因不完全一致,易造成中性突变。费用高。14.基基因筛选选的新方方法1.编码码序列富富集法22.岛屿屿获救PPCR法法3.动物物杂交法法4.功能能克隆法法5.构建建cDNNA文库库6.差异异显示技技术的应应用对已已发现基基因的改改造应用用基因修修饰技术术和
16、点突突变技术术提高目目的基因因表达产产物的稳稳定性、tt1/22、提高高表达量量,降低低毒性或或免疫原原性。15.最最佳的基基因表达达体系:;目的的基因的的表达产产量高;表达产产物稳定定;生物物活性高高和表达达产物容容易分离离纯化16.宿宿主细胞胞的选择择适合目目的基因因表达的的宿主细细胞应满满足以下下要求:1.容易易获得较较高浓度度的细胞胞;2.能利用用易得廉廉价原料料;3.不致病病、不产产生内毒毒素;44.发热热量低、需需氧低、适适当的发发酵温度度和细胞胞形态;5容易进进行代谢谢调控;6.容易易进行DDNA重重组技术术操作;7.产物物的产量量、产率率高,产产物容易易提取纯纯化。17.大大肠
17、杆菌菌中的基基因表达达载体:是基因因工程的的目的和和基本手手段,是是选用合合适的载载体把供供体DNNA(外外源基因因)运载载到受体体细胞内内,从而而复制扩扩增大量量的目的的DNAA分子或或转录表表达为相相应的产产物。基基因工程程载体分分为:克克隆载体体,转录录载体,表达载载体;DDNA(克隆载载体)DNAA(转录录载体)RNA蛋白质(表达载体)18.原原核细胞胞的基因因组特点点:染色质质为环状状双股DDNA分分子 具有操操纵子结结构 结构基基因多为为单拷贝贝 特定区区域分布布特异DDNA顺顺序,因因此外源源DNAA分子可可以插入入原核细细胞DNNA复制制体系的的特定区区段19.基基因克隆隆载体
18、定定义:基基因克隆隆载体是是一类能能够承载载外源基基因并将将其带入入受体细细胞得以以稳定维维持的DDNA分分子。22)目前前经常使使用的载载体,有有质粒和和病毒两两类。各各种不同同的载体体,尽管管分子量量大小、结结构和用用途上存存在着较较大的差差异,但但是作为为载体,它它们应该该具备一一些共同同的特性性。特点点:具有复复制子有单一一限制内内切酶切切位点或或多克隆隆位点有选择择性遗传传标记如如抗药基基因拷贝数数高生物安安全性好好20.质质粒的分分类按复制制型式严紧型型 松弛型型按基因因转移性性传递性性质粒 非传递递性质粒粒按遗传传性状产产物分类类:抗生素素抗性限制酶酶、修饰饰酶系统统21.真真核
19、基因因在原核核细胞中中表达载载体必须须具备条条件载体能能够独立立复制。载载体本身身是一个个复制子子,具有有复制起起点。应具有有灵活的的克隆位位点和方方便的筛筛选标记记,以利利于外源源基因的的克隆鉴鉴定和筛筛选。应具有有很强的的启动子子,能为为大肠杆杆菌RNNA聚合合酶所识识别。应具有有阻遏子子,使启启动子受受到控制制,只有有当诱导导时才能能进行转转录。应具有有很强的的终止子子,只转转录克隆隆的基因因,所产产生的mmRNAA较为稳稳定。所产生生的mRRNA必必须具有有翻译的的起始信信号AUUG和SSD序列列,以便便转录后后顺利翻翻译。22.影影响目的的基因在在大肠杆杆菌中表表达的因因素外源基基因
20、的拷拷贝数:外源基基因是克克隆到载载体上的的,因此此载体在在宿主菌菌种的拷拷贝数就就直接关关系到外外源基因因的拷贝贝数。外源基基因的表表达效率率启动子子的强弱弱核糖体体接合位位点的有有效性SD序序列和起起始密码码ATGG的间距距密码子子组成表达产产物的稳稳定性:组建融融合基因因,产生生融合蛋蛋白;利用大大肠杆菌菌的信号号肽或某某些真核核多肽中中自身的的信号肽肽,把真真核基因因产物搬搬动到胞胞浆周质质的空隙隙中;采用位位点特异异性突变变的方法法,改变变真核蛋蛋白质中中二硫键键的位置置,从而而增加蛋蛋白质的的稳定性性;采用蛋蛋白酶缺缺陷型大大肠杆菌菌,有可可能减弱弱表达产产物的降降解。细胞代代谢负
21、荷荷:工程菌菌的培养养条件:外源基基因的高高水平表表达,不不仅涉及及宿主、载载体和克克隆基因因三者之之间的相相互关系系,而且且与其所所处的环环境条件件息息相相关,必必须优化化基因工工程菌的的培养条条件,进进一步提提高基因因表达水水平。23.基基因工程程菌生长长代谢的的特点菌体的的生长与与能量的的关系 碳源物物质是组组成培养养基的主主要成分分。碳源源物质为为细胞提提供能量量,当菌菌体生长长所需能能量大于于菌体有有氧代谢谢提供的的能量时时,菌体体会产生生乙酸,导导致培养养基的ppH值下下降,从从而影响响菌体的的生长。提提高pHH,可减减少乙酸酸的抑制制作用。分分批培养养中选择择不同的的碳源,连连续
22、培养养中控制制稀释速速率等都都能一定定范围内内控制菌菌体的生生长,从从而控制制乙酸的的产生,减减少它的的抑制作作用。加加入甲硫硫氨酸和和酵母提提取物都都能减少少乙酸的的产生。大大肠杆菌菌中克隆隆携带氧氧能力的的VHBB蛋白的的基因可可提高菌菌体生长长速率。采采用磷酸酸乙酰化化酶缺陷陷株作为为宿主细细胞,阻阻止乙酸酸产生,可可提高产产量。 菌体生生长与前前体供应应的关系系 在基础础培养基基中加入入氨基酸酸(小分分子前体体)能使使菌体比比生长率率提高,蛋蛋白合成成增加。基基因工程程菌质粒粒的表达达需与宿宿主细胞胞竞争共共同的前前体和催催化结构构,致工工程菌生生长速率率降低。质质粒存在在对菌体体代谢
23、的的影响:中等拷拷贝质粒粒(566拷贝)的的工程菌菌中与前前体合成成有关的的酶增加加,这些些酶的基基因大多多受终产产物的反反馈调节节。如:三羧酸酸循环关关键酶、天天冬氨酸酸转酰基基酶等。高拷贝质质粒的工工程菌(2240拷拷贝)中中,生长长速率和和菌体总总蛋白合合成均减减少。这这与工程程菌大量量前体被被利用引引起前体体不足,从从而产生生“严紧反反应”有关。“严紧反反应”是当氨氨酰tRRNA不不足时,核糖体体在密码码子上停停留,并并合成被被称为魔魔点的pppGppp的结结果。24.基基因工程程菌的不不稳定性性、主要机机制质粒粒不稳定定:基因工工程菌在在传代(25代以上)过程中常出现的现象。分裂不稳
24、定:指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变产生机制:1受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解。2外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢。3重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配,这是重组质粒逃逸的基本原因。4受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排。25.常常见分裂裂不稳定定的两个个因素:含质粒粒菌产生生不含质质粒子代代菌的频频率(质质粒丢失失率);这两种种菌(含含质粒菌菌和不含含质粒菌菌)比生生长速率率差异的的大小。提高质粒稳定性的方法1.合适的宿主:宿主菌2.合适的载体:质粒拷贝数3
25、.选择压力:抗生素4.分阶段控制培养:先使菌体生长至一定密度; 再诱导外源基因的表达5.控制培养条件:温度、pH值、培养基组分、溶氧6.固定化:卡拉胶26.基基因工程程菌的培培养方式式:1分分批培养养;2补料分分批培养养;3连续续培养;4透析析培养;5固定化化培养27.影影响发酵酵的因素素有:培养基基接种量量温度溶解氧氧诱导时时机诱导表表达程序序7.pHH 288.高密密度发酵酵特点 :菌体体高密度度,总表表达量高高;生物反反应器体体积小;单位体体积生产产能力高高;生产周周期短,分分离成本本小影响响因素11.培养养基:CC源、NN源种类类和含量量;C:N含量量比值;微量元元素;无无机盐(磷磷影
26、响表表达质粒粒的复制制速率)2.溶氧浓度:空气分离系统提高氧分压;透明颤菌血红蛋白基因克隆到菌体中,提高氧传质能力;菌体与小球藻混合培养,藻细胞光合作用产氧供菌体呼吸。3.pH值:大肠杆菌产酸、CO2必须加碱调节pH值4.温度:控制菌体生长,温控诱导表达(诱导时机和持续时间,对数生长期,2min)5.代谢副产物: C源物质供应超过三羧酸循环或电子传递链能力,产生乙酸,抑制菌体生长和蛋白表达。采取流加补料法,或加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。29.实实现高密密度发酵酵的方法法1.发发酵条件件的改进进(1)培培养基的的选择:(2)建建立流加加式培养养方式;(3)提提高供氧氧能力22.构建建产乙酸
27、酸能力低低的工程程化宿主主菌(11)阻断断乙酸生生产的主主要途径径:(22)对碳碳代谢流流进行分分流:(33)限制制进入糖糖酵解途途径的碳碳代谢流流;(44)引入入血红蛋蛋白基因因。3.构建蛋蛋白水解解酶活力力低的工工程化宿宿主菌30.基基因工程程药物的的分离纯纯化 一.细胞破破碎1.物理破破碎法(11)高压压匀浆法法(2)高高速珠磨磨法(33)超声声破碎法法(4)高高压挤压压法2.化学破破碎法(11)渗透透冲击(22)增溶溶法(33)脂溶溶法3.生物破破碎法:酶溶法法二.固液液分离11.离心心沉淀法法2.膜膜过滤法法3.双双水相萃萃取三、重组组蛋白的的分离纯纯化技术术技术条条件温和和能保持持
28、产物生生物活性性。选择性性好,能能从复杂杂的混合合物中有有效的将将目的产产物分离离,达到到较高的的纯化倍倍数。收率要要高。两个技技术间能能直接衔衔接,不不需要对对物料加加以处理理。纯化过过程要快快,满足足高生产产率的要要求。目目的产物物的分离离纯化 蛋白质质分离纯纯化方法法的设计计根据其其分子的的理化性性质和生生物学特特性来决决定。31.分分离纯化化的方法法:色谱谱分离方方法 离子子交换层层析( IECC)离子子交换层层析的基基本原理理是通过过带电的的溶质分分子与离离子交换换剂中可可交换的的离子进进行交换换,从而而达到分分离的目目的。它它具有分分辨率高高容量大大操作容容易,该该法已成成为多肽肽
29、蛋白质质核酸分分离纯化化的重要要方法。反相色色谱和疏疏水色谱谱反相色色谱和疏疏水色谱谱是根据据蛋白质质疏水性性的差异异来分离离纯化的的。反相相色谱是是利用溶溶质分子子中非极极性基团团与非极极性固定定相之间间相互作作用力的的大小以以及溶质质分子中中极性基基团与流流动相中中极性分分子之间间在相反反方向作作用力的的大小差差异进行行分离的的。疏水水层析的的原理与与反相色色谱的原原理相似似,主要要是利用用蛋白质质分子表表面上的的疏水区区域和介介质中的的疏水基基团之间间的相互互作用,无无机盐的的存在能能使相互互作用力力增强。固固定相介介质表面面的疏水水性比反反相色谱谱介质表表面的疏疏水性弱弱。为有有机聚合
30、合物键合合相或大大孔硅胶胶键合相相。亲和层层析(AAC)是是利用固固定化配配基与目目的蛋白白质之间间特异的的生物亲亲和力进进行吸附附。配基基:在亲亲和层析析中起可可逆性结结合的特特异性物物质。载载体:与与配基结结合的支支撑物。亲亲和层析析可分三三步:配基固固定化吸附目目的物样品解解吸凝胶过过滤层析析凝胶过过滤是以以具有大大小一定定的多孔孔性凝胶胶作为分分离介质质,小分分子能进进入孔内内,在柱柱中缓慢慢移动,而而大分子子不能进进入孔内内,快速速移动,利利用这种种移动差差别可使使大分子子与小分分子分开开。根据据蛋白质质的相对对分子量量和蛋白白质分子子的动力力学体积积的大小小差异,可可以利用用凝胶过
31、过滤来分分离纯化化目的蛋蛋白。主主要应用用两个方方面:脱盐和和更换缓缓冲液蛋白质质分子的的分级分分离。在在产品的的形成阶阶段前用用于除去去产物的的多聚体体及降解解产物。32.分分离纯化化工艺应应遵循以以下原则则:具有良良好的稳稳定性和和重复性性尽可能能减少组组成工艺艺的步骤骤各技术术步骤间间要相互互适应和和协调工艺过过程中尽尽可能少少用试剂剂工艺所所用时间间要短工艺和和技术必必须收率率高、易易操作、能能耗低具有较较高的安安全性33.基基因工程程药物的的质量控控制 产产品的鉴鉴定、纯纯度、活活性、安安全性、稳稳定性和和一致性性。产品的保保存液态保保存低温保保存在稳定定pH条条件下保保存高浓度度保
32、存加保护护剂保存存固态保保存:冷冷冻干燥燥(预冻冻、升华华、解吸吸干燥去去除吸附附水)34.动动物细胞胞的形态态和生理理特点离离体培养养细胞类类型贴壁细细胞生长长须有贴贴附的支支持物表表面,自自身分泌泌或培养养基 中中提供的的粘附因因子才能能在该表表面上生生长。两两种形态态: 成成纤维细细胞型(来来源于中中胚层组组织的细细胞);上皮细细胞型(来来源于内内、外胚胚层组织织的细胞胞)悬浮细细胞生长长不依赖赖支持物物表面,在在培养液液中呈悬悬浮状态态生长。如如淋巴细细胞。兼性贴贴壁细胞胞生长不不严格依依赖支持持物。动动物细胞胞的生理理特点() 动物细胞的分裂周期长:()细胞生长需贴附于基质,并有接触
33、抑制现象。()正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。(4)动物细胞对周围环境十分敏感:对理化因素敏感,()动物细胞对培养基要求高:必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。()动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。35.动动物细胞胞来源的的药物的的种类() 动动物细胞胞多肽与与蛋白质质类药物物()动物物酶与辅辅酶类药药物()动物物核酸类类药物()动物物糖类药药物:()动物物脂类药药物动物细胞胞生产的的药物特特点优点点:分泌泌胞外、纯纯化方便便、翻译译后修饰饰蛋白糖糖基化,与与天然产产品一致致。缺点点:培养养条件高高、成本本贵、产产量低,安安全性问问题。36.动
34、动物细胞胞的培养养条件和和培养基基细胞体外外培养基基本条件件:无菌营养充充足,防防止有害害物质氧气随时清清除代谢谢有害物物质良好的的生存外外环境:pH、渗渗透压、离离子浓度度及时分分种,适适当的细细胞密度度动物细胞胞的培养养基的种种类和组组成天然培培养基:血清、羊羊水、腹腹水等。成成分复杂杂、成分分不稳定定,来源源少。2.合成成培养基基(常用用培养基基成分及及配方)氨基酸 维生素 糖类 无机盐 其它成分添加小牛血清的作用提供生长因子和激素提供贴附因子和伸展因子提供结合蛋白(识别离子、激素、维生素、脂质)提供必需脂肪酸和微量元素3. 无无血清培培养基优优点:提高重重复性(细细胞)减少微微生物污污
35、染(病病毒)供应充充足稳定定细胞产产品易纯纯化避免血血清因素素对细胞胞的毒性性减少血血清中蛋蛋白对生生物测定定的干扰扰动物细胞胞培养的的基本方方法细胞胞分离、细胞计计数、细细胞传代代、细胞胞的冻存存和复苏苏37.动动物细胞胞大规模模培养的的方法11.悬浮浮培养:悬浮培培养即让让细胞自自由地悬悬浮于培培养基内内生长增增殖。它它适用于于一切种种类的非非贴壁依依赖性细细胞(悬悬浮细胞胞),也也适用于于兼性贴贴壁细胞胞。优点点是操作作简便,培培养条件件均一,传传质和传传氧较好好,容易易扩大培培养规模模。缺点点是由于于细胞体体积较小小,较难难采用灌灌流培养养,因此此细胞密密度一般般较低22.贴壁壁培养:
36、贴壁培培养是必必须让细细胞贴附附在某种种基质上上生长繁繁殖的培培养方法法。它适适用于一一切贴附附依赖性性细胞(贴贴壁细胞胞),也也适用于于兼性贴贴壁细胞胞。优点点是适用用的细胞胞种类广广,较容容易采用用灌流培培养的方方式使细细胞达到到高密度度;缺点点是操作作比较麻麻烦,需需要合适适的贴附附材料和和足够的的面积,培培养条件件不均一一,传质质和传氧氧较差。3.贴壁-悬浮培养(假悬浮培养):微载体培养既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖,满足了绝大多数细胞的基本要求,载体体积小,比重较轻,在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内,充分发挥了悬浮培养的一切优点。操作方式1.分批式操作2.半连
37、续式操作3.灌流式操作:取出、补充培养基,细胞仍保留在反应器内。优点:1.营养好,代谢废物少。2.细胞密度高(107108个/mL)产量高。3.产品罐内停留时间短。4.培养基比消耗率低。38.动动物细胞胞生物反反应器的的类型搅拌罐罐式生物物反应器器气升式式生物反反应器中空纤纤维式生生物反应应器透析袋袋或膜式式生物反反应器固定床床或流化化床式生生物反应应器基本本要求11.生物物反应器器的材料料无毒22.生物物反应器器的结构构:满足足传质、传传热、混混合的功功能3.密封良良好,避避免污染染4.自自动检测测、调节节控制精精度高55.长期期连续运运转 66.容器器内表面面光滑,无无死角77.拆装装、连
38、接接、清洁洁方便,能能耐高压压蒸汽消消毒8.设备成成本低39.动动物细胞胞产品纯纯化方法法1.离离心2.离子交交换层析析3.凝凝胶过滤滤4.亲亲和层析析5.盐盐析和有有机溶剂剂沉淀66.透析析7.高高压液相相层析动动物细胞胞制药的的前景(一一)、改改进表达达载体,提提高表达达水平和和产量 (二二)、利利用代谢谢工程,改改进培养养工艺,降降低生产产成本 (三三)、抑抑制细胞胞凋亡,延延长培养养周期( 四)、采用用糖基化化工程,提提高产品品质量 (五) 转基基因动物物的研究究 (六)、组织工程的研究单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点,40.单单克隆抗抗体及其其制备制制备单
39、克克隆抗体体(MccAb)是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合,通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体,首先要制备用于免疫的适当抗原,再用抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成:地高辛。多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。为使杂交瘤细胞稳定,采用免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠,因此免疫动物也采用相应的品系。41.基基因工程程抗体及及其制备备杂交瘤单单抗为鼠鼠源性,应应用人体体产生人人抗鼠抗抗体及毒毒副作用用。对鼠鼠源性的的单抗进进行
40、基因因加工和和改造。目的:降低免疫源性;降低相对分子量。人-鼠嵌合抗体、改形抗体 、小分子抗体。基因工程程抗体的的类型:人鼠嵌嵌合抗体体、改形抗抗体、Fabb与Fvv抗体、单链抗抗体、单域抗抗体和分分子识别别单位(最最小识别别单位)42.抗抗体工程程噬菌体体抗体库库技术的的基本方方法获取目目的基因因抗体库库技术的的载体(噬噬菌体 phaagemmid)淘筛表达与鉴定特点()模拟天然全套抗体库()避开了人工免疫和杂交瘤技术()可获得高亲和力的人源化抗体43.基基因工程程抗体表表达()原核核细胞表表达(融融合表达达,分泌泌表达)()真核核细胞表表达(分分泌表达达)()转基基因植物物表达()转基因动
41、物表达44.抗抗体诊断断试剂的的类型: 一、血血清学鉴鉴定用的的抗体类类试剂 二二、免疫疫标记技技术用的的抗体类类试剂 三、导导向诊断断药物 四四、CDD单克隆隆抗体系系列45.抗抗体治疗疗药物的的种类:以抗体体为载体体的导向向治疗药药物一、放射射性同位位素标记记的抗体体治疗药药物:抗体作作为放射射性核素素的导向向载体,标标记操作作简便,用用量小。放放射性核核素标记记的抗体体对肿瘤瘤细胞杀杀伤较大大。二、抗癌癌药物偶偶联的抗抗体药物物:常用的的抗癌药药物氨甲甲喋呤(MMTX)、阿阿霉素(AADM)、丝丝裂霉素素(MMMC)等等。以人人血浆白白蛋白作作为中间间载体,可可明显提提高每分分子抗体体所
42、携带带的MTTX量,使使体外细细胞毒性性提高二二倍。抗体类类药物逆逆转耐药药性。3.抗抗体导向向酶-前前药疗法法(anntibbodyy diirecctedd ennzymme pproddrugg thheraapy,ADEEPT)关关键是选选择适当当的活化化酶前前药对。三、毒素素偶联的的抗体药药物第一代免免疫毒素素是包含含有A、BB链完整整毒素和和抗体的的交联物物,其中中B链非非特异性性结合,使使其仅在在体外应应用。第二代代免疫毒毒素是利利用抗体体或抗体体片段与与毒素的的A链或或与A链链相似的的单链核核糖体失失活蛋白白的结合合物。因因避免了了第一代代免疫毒毒素的非非特异性性,故能能在体内
43、内有一定定的抗肿肿瘤作用用。第三三代免疫疫毒素:重组免免疫毒素素用基因因克隆方方法改造造毒素基基因和小小分子抗抗体基因因重组表表达。特特异性好好、稳定定性强、渗渗透性佳佳、免疫疫源性低低、可大大量制备备。制备备方法:先克隆隆毒素基基因,再再利用基基因重组组技术去去除毒素素中非特特异性细细胞结合合部位基基因。经经改造的的毒素基基因,再再与载体体基因重重组,转转入受体体菌中表表达,形形成融合合蛋白,再再经过纯纯化就得得到重组组免疫毒毒素。46.植植物组织织和器官官的培养养 :植物物无菌培培养:(11)幼苗苗及植株株的培养养(2)愈愈伤组织织培养(外外植体,细细胞聚集集体)(33)悬浮浮培养(单单细
44、胞或或小细胞胞团的液液体培养养)(44)器官官培养(55)胚胎胎培养初初级代谢谢产物:核酸、蛋蛋白质、糖糖类外植体 (脱分分化)愈伤组组织(再再分化)生长点(形态发生)芽、根小植株47.次次级代谢谢产物:1.有有明显的的分类学学区域界界限2.其生物物合成需需要在一一定条件件下才能能发生33.缺乏乏明确的的生理功功能4.是生命命活动的的多余成成分主要要有:生生物碱、黄黄酮类、萜萜类、有有机酸、木木质素、皂皂苷类、多多元酚类类次级代代谢作用用是由特特异蛋白白质调控控产生的的内源化化合物的的合成、代代谢及分分解作用用的综合合过程。48.植植物细胞胞培养的的培养基基的组成(11)无机机盐(22)碳源源
45、(3)植植物生长长调节剂剂(5种种天然激激素:生生长素、分分裂素、赤赤霉素、脱脱落酸、乙乙烯 )(44)有机机氮源(55)维生生素。固定化反反应器:网状多多孔板;尼龙网网套;中中空纤维维膜 优优点:细细胞位置置固定,易易于获得得高密度度细胞群群及维持持细胞间间理化梯梯度,利利于细胞胞组织化化,易于于控制培培养条件件及获得得较高含含量的次次级代谢谢产物。49.影影响植物物次级代代谢产物物生产和和累积的的因素:1.生生物条件件:外植植体,季季节,休休眠,分分化2.物理条条件:温温度,光光(光照照时间,光光强,光光质),通通气(OO2),ppH和渗渗透压33.化学学条件:无机盐盐(N,P,KK),碳
46、碳源,植植物生长长调节剂剂,维生生素,氨氨基酸,核核酸,抗抗生素,天天然物质质,前体体4.工工业培养养条件:培养罐罐类型,通通气,搅搅拌和培培养方法法50.植植物细胞胞大规模模培养生生物反应应器的类类型、及及其性能能比较 1.机械搅搅拌式培培养系统统 :根据据植物细细胞的特特性,机机械搅拌拌式生物物反应器器通常是是在微生生物发酵酵罐的基基础上改改进设计计的。优优点:易易于控制制温度、 pH、溶溶氧及营营养物质质浓度,混混合均匀匀。2.鼓泡塔塔生物反反应器:反应器器底部的的喷嘴及及多孔板板实现气气体混合合分散。优点:适于对剪切敏感的细胞的培养,无运动部件,不易染菌,相对高的热量和质量传递,放大相
47、对容易。缺点:流体流动形式难以确定,混合不匀,缺乏非牛顿流体的流动与传递特性的数据。3.气升式培养系统是最适合培养植物细胞的反应器之一。优点:低剪切力,较好的混合,较高的氧传递效果。无运动部件,不易染菌,操作费用低。缺点:高密度培养时混合不均匀。4.转鼓式生物反应器通过转动促进反应器内氧及营养物的混合。优点:在高密度培养时有高的传氧能力。缺点:放大困难,大规模操作困难。5.固定化细胞生物反应器:指固定在载体(惰性基质)上,在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。采用固相培养,细胞有一定程度的分化发育,从而刺激调控代谢物合成的基因表达,促进次级代谢产物的产生。方法:吸附法(共价交联,表面固定化,膜固定化);包埋法(多孔载体,凝胶包埋);材料:聚氨基甲酸乙酯泡沫,中空纤维素固定化植物细胞培养系统:平床培养系统立体培养系统51.植植物细胞胞固定化化培养优优缺点:1.可保护护细胞免免受剪切切。2.细胞可可长时间间重复使使用,更更换培养养基带走走代谢物物。3