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1、第二章细细胞生物物学研究究方法(thee reeseaarchh meethood iin tthe celll bbiollogyy)教学目的的1、了解解主要工工具和常常用方法法，侧重重掌握基基本原理理和基本本应用；2、认识识工具和和方法与与学科发发展的相相关性。教学内容容本章从以以下5个方面面介绍了了细胞生生物学的的研究方方法:1显微微成像技技术2细胞胞化学技技术3细胞胞分选技技术4细胞胞工程技技术5分离离技术6分子子生物学学方法计划学时时及安排排本章计划划3学时。教学重点点和难点点生命科学学是实验验科学，它它的很多多成果都都是通过过实验才才得以发发现和发发展的。许许多细胞胞生物学学的重要
2、要进展以以及新概概念的形形成,往往来来自新技技术的应应用。因因此,方法上上的突破破,对于理理论和应应用上的的发展具具有巨大大的推动动作用，这这是学习习本章应应确立的的基本思思想。1显微微成像包包括直接接成像和和间接成成像。显显微技术术是细胞胞生物学学最基本本的研究究技术, 包括括光学显显微技术术和电子子显微技技术。在在光学显显微技术术中要掌掌握几种种常用显显微镜成成像的基基本原理理,包括普普通双筒筒显微镜镜、荧光光显微镜镜、相差差显微镜镜、暗视视野显微微镜、倒倒置显微微镜。电电子显微微镜是研研究亚显显微结构构的主要要工具, 透射射和扫描描电镜的的是两类类主要的的电子显显微镜, 对其其基本结结构
3、、工工作原理理和样品品制备方方法则是是学习的的重点。2细胞胞化学技技术介绍绍了酶细细胞化学学技术、免免疫细胞胞化学技技术、细细胞分选选技术, 其中中流式细细胞分选选技术是是细胞生生物学和和现代生生物技术术中的重重要技术术, 应重重点掌握握。3细胞胞工程技技术是细细胞生物物学与遗遗传学的的交叉领领域，主主要利用用细胞生生物学的的原理和和方法，结结合工程程学的技技术手段段，按照照人们预预先的设设计，有有计划地地改变或或创造细细胞遗传传性的技技术。包包括体外外大量培培养和繁繁殖细胞胞，或获获得细胞胞产品、或或利用细细胞体本本身。主主要内容容包括：细胞融融合、细细胞生物物反应器器、染色色体转移移、细胞
4、胞器移植植、基因因转移、细细胞及组组织培养养。4分离离技术是是一大类类技术的的总称，包包括细胞胞组分的的分离和和生物大大分子的的分离, 应掌掌握各种种分离技技术的原原理和用用途。本章对分分子生物物学方法法作了简简要介绍绍, 为为今后的的学习奠奠定基础础。简言言之，本本章教学学重点是是仪器方方法的基基本原理理和基本本应用；教学难难点是电镜制制样及分分子杂交交技术。教学方法法讲授、参参观教学过程程2.1显显微成像像技术2.1.1、光学学和电子子显微镜镜成像原原理共同点：照明系系统；被被观察的的样品；聚焦和和成像的的透镜系系统不同点：光学显显微镜：以可见见光（或或紫外线线）为光光源。电子显显微镜：以
5、电子子束为光光源。表3-11电镜与与光镜的的比较利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜可见光（400-700） 紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）200nm100nmLMFMEM成像原理真空透镜光源分辨本领显微镜电镜与光光镜光路路图比较较电子显微微镜的基基本构造造2.2.2、常用用的光学学显微镜镜普通光光学显微微镜构成： 照照明系统统 光光学放大大系统 机机械装置置原理：经物镜镜形成倒倒立实像像，经目目镜进一一步放大大成像。分辨力力：指分分辨物体体最小
6、间间隔的能能力。 R=0.661/n ssin(/22)或者者 R=0.661/NA其中为为入射光光线波长长；NA为物物镜的数数值孔径径（nuumerricaal aaperrturre)，ssin/2，nn=介质质折射率率；=镜口角角（样品品对物镜镜镜口的的张角） 。 思考考：如何何提高显显微镜的的分辨能能力？显微镜镜的几个个光学特特点： 制作作光学镜镜头所用用的玻璃璃折射率率为1.65-1.778，所所用介质质的折射射率越接接近玻璃璃的越好好。 siin/2的的最大值值必然小小于1；介质为为空气，镜镜口率一一般为00.055-0.95；油镜头头用香柏柏油为介介质，镜镜口率可可接近11.5。
7、 普通通光线的的波长为为4000-7000nmm，分辨辨力数值值不会小小于0.2m，人人眼的分分辨力为为0.22mm,因此显显微镜的的最大设设计倍数数为10000XX。 荧光光显微镜镜(Flluorresccencce miccrosscoppe) 特点点：光源源为紫外外线，波波长较短短；分辨力高高于普通通显微镜镜；有两个特特殊的滤滤光片；照明方式式通常为为落射式式。 用于于观察能能激发出出荧光的的结构。用途：免免疫荧光光观察、基基因定位位、疾病病诊断。 激光光共聚焦焦扫描显显微境(Lasser connfoccal scaanniing miccrosscoppe, LCSSM) 用激激光作
8、光光源，逐逐点、逐逐行、逐逐面快速速扫描。 能显显示细胞胞样品的的立体结结构。 分辨辨力是普普通光学学显微镜镜的3倍倍。 用途途类似荧荧光显微微镜，但但能扫描描不同层层次，形形成立体体图像。 相差差显微镜镜 把透透过标本本的可见见光的光光程差变变成振幅幅差，从从而提高高了各种种结构间间的对比比度，使使各种结结构变得得清晰可可见。在在构造上上，相差差显微镜镜有不同同于普通通光学显显微镜两两个特殊殊之处。环形光光阑（aannuularr diiaphhraggm）：位于光光源与聚聚光器之之间。相位板板（annnullar phaasepplatte）：物镜中中加了涂涂有氟化化镁的相相位板，可可将直
9、射射光或衍衍射光的的相位推推迟1/4。 用途途：观察察未经染染色的玻玻片标本本 倒置置显微镜镜（innverrse miccrosscoppe） 物镜镜与照明明系统颠颠倒，前前者在载载物台之之下，后后者在载载物台之之上，用用于观察察培养的的活细胞胞，通常常具有相相差物镜镜，有的的还具有有荧光装装置。2.2.3、 光学显显微镜的的样品制制备 样品品的固定定 包埋埋和切片片 染色色 放射射自显影影2.2.4、 电子显显微镜 透射射电子显显微镜（ttrannsmiissiion eleectrron miccrosscoppe, TEMM）原理： 以电电子束作作光源，电电磁场作作透镜。电电子束的的波
10、长短短，并且且波长与与加速电电压(通通常5001220KVV)的平平方根成成反比。 由电电子照明明系统、电电磁透镜镜成像系系统、真真空系统统、记录录系统、电电源系统统等5部部分构成成。 分辨辨力0.2nmm，放大大倍数可可达百万万倍。 用于于观察超超微结构构（ulltraastrructturee），即即小于00.2m、光光学显微微镜下无无法看清清的结构构， 又又称亚显显微结构构（suubmiicrooscoopicc sttruccturres）。制样技技术 超薄薄切片 电子子束穿透透力很弱弱，用于于电镜观观察的标标本须制制成厚度度仅500nm的的超薄切切片，用用超薄切切片机（uultrra
11、miicrootomme）制制作。 通常常以锇酸酸和戊二二醛固定定样品，丙丙酮逐级级脱水，环环氧树脂脂包埋，以以热膨胀胀或螺旋旋推进的的方式切切片，重重金属（铀铀、铅）盐盐染色。 负染染技术 用重重金属盐盐(如磷磷钨酸)对铺展展在载网网上的样样品染色色；吸去去染料，干干燥后，样样品凹陷陷处铺了了一层重重金属盐盐，而凸凸的出地地方没有有染料沉沉积，从从而出现现负染效效果，分分辨力可可达1.5nmm左右。 冰冻冻蚀刻（ffreeeze-etcchinng） 亦称称冰冻断断裂。标标本置于于干冰或或液氮中中冰冻。然然后断开开，升温温后，冰冰升华，暴暴露出了了断面结结构。向向断裂面面上喷涂涂一层蒸蒸汽碳
12、和和铂。然然后将组组织溶掉掉，把碳碳和铂的的膜剥下下来，此此膜即为为复膜（rrepllicaa）。 扫描描电子显显微镜 200世纪660年代代问世，用用来观察察标本表表面结构构。 分辨辨力为66-100nm，由由于人眼眼的分辨辨力（区区别荧光光屏上距距离最近近两个光光点的能能力）为为0.22mm，扫扫描电镜镜的有效效放大倍倍率为00.2mmm/110nmm=2000000X。 工作作原理：是用一一束极细细的电子子束扫描描样品，在在样品表表面激发发出次级级电子，次次级电子子的多少少与样品品表面结结构有关关，次级级电子由由探测器器收集，信信号经放放大用来来调制荧荧光屏上上电子束束的强度度，显示示出
13、与电电子束同同步的扫扫描图像像。 为了了使标本本表面发发射出次次级电子子，标本本在固定定、脱水水后，要要喷涂上上一层重重金属膜膜，重金金属在电电子束的的轰击下下发出次次级电子子信号。 扫描描隧道显显微镜(scaanniing tunnnellingg miicrooscoope，SSTM) 原理理：根据据隧道效效应而设设计，当当原子尺尺度的针针尖在不不到一个个纳米的的高度上上扫描样样品时，此此处电子子云重叠叠，外加加一电压压（2mmV-22V），针针尖与样样品之间间形成隧隧道电流流。电流流强度与与针尖和和样品间间的距离离有函数数关系，将将扫描过过程中电电流的变变化转换换为图像像，即可可显示出出
14、原子水水平的凹凹凸形态态。 分辨辨率：横横向为00.1-0.22nm，纵纵向可达达0.0001nnm。 用途途：三态态（固态态、液态态和气态态）物质质均可进进行观察察。2.2 细胞化化学技术术2.2.1、 酶细胞胞化学技技术通过酶的的特异细细胞化学学反应来来显示酶酶在细胞胞内的定定位。如： 金属属沉淀法法：如磷磷酸酶分分解磷酸酸酯底物物后，反反应产物物最终生生成CooS或PPbS有有色沉淀淀，而显显示出酶酶活性。 Scchifff反应应：细胞胞中的醛醛基可使使Schhifff试剂中中的无色色品红变变为红色色。用于于显示糖糖和脱氧氧核糖核核酸（FFeullgenn反应）。 联苯苯胺反应应：过氧氧
15、化酶分分解H2202。产产生新生生氧，后后者再将将无色联联苯胺氧氧化成联联苯胺蓝蓝，进而而变成棕棕色化合合物。 脂溶溶染色法法：借苏苏丹染料料溶于脂脂类而使使脂类显显色。 茚三三酮反应应：显示示蛋白质质。2.2.2、 免疫细细胞化学学技术（iimmuunoccytoocheemisstryy）利用免疫疫反应定定位组织织或细胞胞中抗原原成分分分布的一一类技术术。 免疫疫荧光技技术（iimmuunoffluooresscennt ttechhniqque）快速、灵灵敏、有有特异性性，但其其分辨率率有限 免疫疫电镜技技术，包包括：免疫铁蛋蛋白技术术免疫酶标标技术免疫胶体体金技术术 应用：通通过对分分
16、泌蛋白白的定位位，可以以确定某某种蛋白白的分泌泌动态；胞内酶酶的研究究；膜蛋蛋白的定定位与骨骨架蛋白白的定位位等2.2.3、 其他细细胞化学学技术显微光谱谱分析技技术 细胞胞中有一一些成分分具有特特定的吸吸收光谱谱，核酸酸、蛋白白质、细细胞色素素、维生生素等都都有自己己特征性性的吸收收曲线。 可利利用显微微分光光光度计对对某些成成分进行行定位、定定性和定定量测定定。2.3 细胞分分选技术术流式细胞胞术 用途途：对单单个细胞胞进行快快速定量量分析与与分选的的一门技技术。 原理理：包在在鞘液中中的细胞胞通过高高频振荡荡控制的的喷嘴，形形成包含含单个细细胞的液液滴，在在激光束束的照射射下，这这些细胞
17、胞发出散散射光和和荧光，经经探测器器检测，转转换为电电信号，送送入计算算机处理理，输出出统计结结果，并并可根据据这些性性质分选选出高纯纯度的细细胞亚群群，分离离纯度可可达999%。包包被细胞胞的液流流称为鞘鞘液，所所用仪器器称为流流式细胞胞计（ffloww cyytommeteer）。2.4细细胞工程程技术2.4.1、 细胞培培养几个概念念： 原代代培养（pprimmaryy cuultuure）：即：培培养直接接来自动动物机体体的细胞胞群，将将细胞从从一个培培养瓶转转移到另另外一个个培养瓶瓶称为传传代或传传代培养养（Paassaage） 细胞胞株（ccelll sttraiin）：由单细细胞
18、分离离培养或或通过筛筛选的方方法由单单细胞增增殖形成成的细胞胞群称细细胞株(celll sstraain)。即通通过选择择法或克克隆形成成法从原原代培养养物或细细胞系中中获得的的具有特特殊性质质或标志志的培养养细胞。 细胞胞系（ccelll liine）：原代培培养物经经首次传传代成功功后即为为细胞系系(ceell linne)。 克隆隆（cllonee）：亦亦称无性性系。指指由同一一个祖先先细胞通通过有丝丝分裂产产生的遗遗传性状状一致的的细胞群群。 动物物细胞培培养 群体体培养（mmasss cuultuure）：将含有有一定数数量细胞胞的悬液液置于培培养瓶中中，让细细胞贴壁壁生长，汇汇合（
19、cconfflueencee）后形形成均匀匀的单细细胞层； 克隆隆培养（cclonnal cullturre）：培养高高度稀释释的细胞胞悬液，细细胞贴壁壁生长，每每一个细细胞形成成一个细细胞集落落，称为为克隆。 植物物细胞培培养 外植植体培养养：诱发发产生愈愈伤组织织。用于于研究植植物的生生长发育育、分化化和变异异；进行行无性繁繁殖；制制取代谢谢产物。 悬浮浮细胞培培养：适适合于进进行产业业化大规规模细胞胞培养，制制取植物物代谢产产物。 原生生质体培培养：培培养脱壁壁后的细细胞，特特点：比较容容易摄取取外来的的遗传物物质，如如DNAA；便于进进行细胞胞融合，形形成杂交交细胞；适宜条条件下可可产
20、生细细胞壁，经经诱导分分化成完完整植株株。 单倍倍体培养养：通过过花药或或花粉培培养可获获得单倍倍体植株株。2.4. 2、 细胞融融合与单单克隆抗抗体技术术 通过过培养和和介导，两两个或多多个细胞胞合并成成一个双双核或多多核细胞胞的过程程称为细细胞融合合（ceell fussionn）或细细胞杂交交。 同核核体：相相同基因因型的细细胞融合合而成。 异核核体：不不同基因因型的细细胞融合合而成。 自发发融合：同种细细胞在培培养过程程中自发发合并的的现象。 诱发发融合：异种间间的细胞胞必须经经诱导剂剂处理才才能融合合。 诱导导细胞融融合的方方法：生生物方法法（仙台台病毒、副副流感病病毒和新新城鸡瘟瘟
21、病毒）、化化学方法法（聚乙乙二醇PPEG）、物物理方法法（电击击和激光光）。举例：动动物细胞胞核移植植克隆技技术（DDollly的诞诞生）2.5分分离技术术2.5.1、 离心分分离技术术 是分分离细胞胞器（如如细胞核核、线粒粒体、高高尔基体体）及各各种大分分子基本本手段。 转速速为100-255kr/minn的离心心机称为为高速离离心机。 转速速255kr/minn，离心心力889K者称为为超速离离心机。 目前前超速离离心机的的最高转转速可达达10000000r/mmin，离离心力超超过5000Kgg。 差速速离心(Diffferrenttiall ceentrrifuugattionn) 特
22、点点： 介质质密度均均一； 速度度由低向向高，逐逐级离心心。 用途途：分离离大小相相差悬殊殊的细胞胞和细胞胞器。 沉降降顺序：核线粒体体溶酶酶体与过过氧化物物酶体内质质网与高高基体核蛋蛋白体。 可将将细胞器器初步分分离，常常需进一一步通过过密度梯梯离心再再行分离离纯化。 密度度梯度离离心 用介介质在离离心管内内形成一一连续或或不连续续的密度度梯度，将将细胞混混悬液或或匀浆置置于介质质的顶部部，通过过离心力力场的作作用使细细胞分层层、分离离。 类型型：速度度沉降、等等密度沉沉降。 常用用介质：氯化铯铯、蔗糖糖、多聚聚蔗糖。 分离离活细胞胞的介质质要求： 1）能能产生密密度梯度度，且密密度高时时，
23、粘度度不高； 2）PPH中性性或易调调为中性性； 3）浓浓度大时时渗透压压不大； 4）对对细胞无无毒。举例：CCsCll 密度度梯度离离心分离离DNAA 速度度沉降（vveloocitty ssediimenntattionn） 用途途：分离离密度相相近而大大小不等等的细胞胞或细胞胞器。 特点点：介质质密度较较低，介介质的最最大密度度应小于于被分离离生物颗颗粒的最最小密度度。 原理理：介质质密度梯梯度平缓缓，分离离物按各各自的沉沉降系数数以不同同的速度度沉降而而达到分分离。 等密密度沉降降(issopyycniic ssediimenntattionn) 用途途：分离离密度不不等的颗颗粒。 特
24、点点： 介质质密度较较高，陡陡度大，介介质的最最高密度度应大于于被分离离组分的的最大密密度。 所需需的力场场通常比比速率沉沉降法大大101000倍，往往往需要要高速或或超速离离心。 原理理：样品品各成分分在连续续梯度的的介质中中经过一一定时间间的离心心则沉降降到与自自身密度度相等的的介质处处，并停停留在那那里达到到平衡，从从而将不不同密度度的成分分分离。2.5.2、 层析分分离技术术三种方法法：凝胶过过滤层析析亲和层层析离子交交换层析析2.6分分子生物物学方法法2.6.1、基因工工程技术术基因工程程是以分分子遗传传学为理理论基础础，以分分子生物物学和微微生物学学的现代代方法为为手段，将不同来源
25、的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。2.6.2、基因作作图与人人类基因因组计划划2.6.3、 PCCR技术术PCR是是英文聚聚合酶链链式反应应 (ppolyymerrasee chhainn reeacttionn) 的的简称，是是80年代代发展起起来的一一项具有有重大意意义的分分子生物物学技术术2.6.4、选择性性基因剔剔除与转转基因鼠鼠基因敲除除(geene knoockoout)：是指一一个有功功能的基基因通过过基因工工程方法法完全被被剔除
26、的的人工突突变技术术。人为为的将小小鼠的某某一种有有功能的的基因完完全缺失失的技术术就称为为基因敲敲除技术术。这项项技术是是Marrrioo Caapeccchii于八十十年代末末在Uttah大大学发展展起来的的。实验验的动物物通常是是小鼠，被被敲除了了功能基基因的小小鼠就称称为敲除除小鼠(knoockoout micce)。2.6.5、乳腺生生物反应应器技术术乳腺生物物反应器器是根据据细胞生生物学中中蛋白质质合成与与分选的的机理，结结合基因因工程技技术、动动物转基基因技术术等，利利用动物物的乳腺腺分泌某某些具有有重要价价值的基基因产物物。复习与思思考题1. 与与光镜相相比， 用于电电子显微微镜的组组织固定定有什么么特殊的的要求? 2. 什什么是细细胞系和和细胞株株? 3. 动动物体细细胞克隆隆有什么么意义?