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1、土壤微生生物群落落结构影影响因素素及研究究方法的的现状与与展望摘要: 土壤微微生物是是土壤生生态系统统的重要要组成部部分, 在土壤壤有机物物质分解解和养分分释放、能能量转移移等中起起着重要要作用。随随着人们们对生物物群落结结构多样样性重要要性认识识的不断断深入及及研究方方法的不不断改进进, 土壤壤微生物物群落结结构多样样性, 尤其是是群落结结构的研研究工作作逐渐受受到生态态学家的的重视。本本文从土土壤微生生物群落落结构多多样性的的影响因因素以及及研究方方法等方方面阐述述了目前前国内外外土壤微微生物群群落结构构多样性性的研究究现状, 并对对其未来来研究方方向进行行了合理理展望。关键词:微生物物,
2、群落落结构, 土壤壤 微微生物群群落Reviiew andd prrosppectts oon mmethhodoologgy aand afffecttingg faactoors of soiil mmicrrobiialcommmuniity strructturee Absttracct:Soiil mmicrroorrgannismms aare impporttantt coompoonennts of soiil eecossysttem andd pllaycenttrall rooless inn biiogeeochhemiicallcycclinng ssuchh ass
3、 orrgannic mattterr deecommpossitiion, miinerral nuttrieent relleasse, andd ennerggy ttrannsfoormaatioon. Aloong witth tthe inttenssivee coomprreheensiion of thee immporrtannce of miccrobbiallcommmunnityy sttruccturre ddiveersiity andd thhe rrapiid ddeveeloppmennt oof metthoddoloogy, moore andd moor
4、e stuudiees hhavee foocussed on soiil mmicrrobiial commmunnityy sstruuctuure divverssityy. TThiss reevieew iintrroduucess thhe ccurrrentt deevellopmmentt off meethoodollogyy annd aaffeectiing facctorrs oof ssoill miicroobiaal ccommmuniity strructturee diiverrsitty. We alsso ddisccusssed thee diirecc
5、tioons of futturee reeseaarchh onn sooil miccrobbiall coommuunitty sstruuctuure divverssityy.Key worrds: biiodiiverrsitty, commmunnityy sttruccturre ; sooil；miccrobbiall coommuunitty 引言土壤微生生物主要要指土壤壤中那些些个体微微小的生生物体,主要包包括细菌菌、放线线菌、真真菌,还还有一些些原生动动物和藻藻类等 1 。土土壤微生生物是影影响土壤壤生态过过程的一一个重要要因素, 土壤壤微生物物在土壤壤形成、生生态系统
6、统的生物物地球化化学循环环、污染染物质的的降解和和维持地地下水质质量等方方面都具具有重要要作用 2, 3, 4 。由由于土壤壤中微生生物个体体微小, 数量量多,土土壤微生生物分离离和鉴定定困难,土壤环环境条件件复杂等等原因, 目前前为止大大约仅11100%的土土壤微生生物被分分离和鉴鉴定,这这些限制制了对土土壤微生生物在陆陆地生态态系统中中重要作作用的认认识 5, 6 。虽虽然,对对土壤微微生物的的认识有有限,但但这并没没有影响响它们在在维护整整个陆地地生态系系统稳定定中的重重要作用用。近年年来,随随着研究究的日益益深入,对土壤壤微生物物群落结结构及其其影响因因素、土土壤微生生物结构构与生态态
7、功能的的关系,土壤微微生物在在维持土土壤质量量等方面面的研究究越来越越受到土土壤学家家、生态态学家和和微生物物学家的的关注.许多研究究已经证证实，通通过传统统的分离离方法鉴鉴定的微微生物只只占环境境微生物物总数的的0.11% 10 %11, 22。传传统的土土壤微生生物研究究方法如如分离计计数法、显显微镜法法往往会会过低估估价土壤壤微生物物的群落落结构组组成，虽虽然使用用电子显显微镜或或荧光抗抗体染色色法可以以对土壤壤微生物物形态多多样性进进行观察察，但是是这两种种方法并并不能描描述出土土壤微生生物的群群落结构构组成方方面的信信息，也也无法描描绘出不不同群体体的生理理差异。随随着微生生物研究究
8、技术的的发展尤尤其是分分子生物物学技术术的发展展，土壤壤微生物物学家开开发出一一系列的的研究土土壤微生生物群落落结构的的方法。1土壤微微生物多多样性影影响因素素1.1土土壤生态态系统内内生物因因素对土土壤微生生物群落落结构的的影响1.1.1植物物多样性性对土壤壤微生物物群落结结构影响响陆地生态态系统中中植物多多样性是是影响土土壤微生生物群落落结构的的另一个个重要因因素 26 。植植物多样样性对土土壤微生生物群落落结构的的影响主主要是两两个方面面:一方面面是植物物为土壤壤微生物物提供营营养物质质,另一方方面植物物多样性性影响整整个生态态系统的的过程,进而间间接的影影响土壤壤微生物物的群落落结构
9、277, 228 。森森林植物物物种组组成影响响土壤微微生物数数量、群群落结构构及活性性 229 。Barrdgeett 等发现现栽种不不同草本本植物的的土壤具具有明显显不同的的土壤微微生物磷磷脂酸图图谱( PFLLA) 331 。Graaystton等等利用BB IOOLOGG系统研研究发现现长有不不同草本本植物的的土壤具具有不同同的土壤壤微生物物群落 322 。森林林植被能能影响林林地微环环境,通过根根系分泌泌物、地地上和地地下凋落落物以及及树冠的的拦截和和淋洗作作用改变变土壤微微生物生生长所需需能量物物质的数数量和质质量 29,33 。陆陆地生态态系统中中植物通通过凋落落物和地地下根系系
10、分泌物物为土壤壤中微生生物提供供营养物物质。不不同的植植物凋落落物理化化性状不不同,凋落物物分解过过程中释释放的有有机,无机物物也不同同,从而对对土壤中中微生物物生长具具有选择择性刺激激作用。另另外,不同植植物的根根系分泌泌物也有有很大差差异,很早的的研究就就发现活活的根系系能分泌泌种类繁繁多的可可溶性有有机物质质,包括糖糖、氨基基酸和有有机酸等等,这些分分泌物质质为土壤壤生物提提供C源引起起根际微微生物的的快速生生长,一般由由活根分分泌的可可溶性有有机物质质通常在在1 10gg/1000g根干干重 28 。随随着研究究手段的的进步发发现根际际中的真真菌微生生物比以以前认识识要丰富富得多 33
11、4 。植植物多样样性对土土壤微生生物群落落结构的的影响具具有几个个特点: ( i)植植物对土土壤微生生物特别别是根际际土壤微微生物群群落组成成有选择择性影响响( iii)这这种选择择影响的的强度随随植物不不同而有有差异( iiii) ,这种种选择性性影响具具有植物物特异性性 110 。植植物的这这种特异异性在菌菌根菌和和Fraankiia菌等等与植物物具有共共生关系系的微生生物中表表现的更更加明显显。1.1.2土壤壤微生物物间相互互作用土壤微生生物之间间存在复复杂的关关系,包括共共生,互生,捕食等等. 土壤壤微生物物之间相相互作用用维持着着整个土土壤生态态系统内内土壤微微生物群群落结构构的稳定
12、定。在森森林生态态系统中中不同土土壤微生生物相互互作用共共同完成成对凋落落物的分分解,推动整整个系统统的物质质循环、能能量流动动。此外外,在土壤壤中存在在着大量量的有益益菌群,目前研研究较多多的是根根际促生生菌( PGPPR) ,它们们能维持持土壤质质量的健健康,减少土土壤中病病源微生生物的生生长。土土壤微生生物之间间具有一一定的拮拮抗作用用。土壤壤中细菌菌产生的的挥发性性物质能能影响其其它土壤壤微生物物的生长长,直接影影响了土土壤微生生物的群群落结构构。细菌菌的挥发发物质影影响真菌菌的生长长和酶的的活性,这种作作用受细细菌种类类、年龄龄、环境境因素的的影响,并且真真菌对不不同细菌菌的产物物具
13、有特特异性 166 。土壤壤微生物物之间更更多的是是半共生生关系,即“一种生生态依赖赖关系,一种生生物体改改变周围围的环境境,为其后后来的另另一种生生物体的的生长创创造条件件” 223 。在在植物凋凋落物分分解过程程中不同同土壤微微生物相相互协作作共同完完成对凋凋落物的的分解,分解过过程中微微生物具具有一个个演变的的过程. 通常常,真菌在在凋落物物分解过过程初期期占主要要地位,分解凋凋落物中中新鲜物物质,而细菌菌在分解解后期占占主要地地位完成成凋落物物的最终终分解和和矿化过过程 24 。1.1.3土壤壤动物多多样性对对土壤微微生物活活性与群群落结构构影响土土壤动物物对土壤壤微生物物群落结结构的
14、影影响主要要包括以以下3个方面面: (1)土土壤动物物的粉碎碎、搅拌拌、混合合作用。土土壤动物物通过这这些作用用使进入入土壤的的凋落物物等物质质充分的的与土壤壤混合,增加了了土壤微微生物与与这些物物质的接接触机会会。土壤壤动物消消化植物物残体后后通过粪粪便排出出体外,改变了了这些物物质的化化学成分分,大小等等理化性性状,导致了了土壤微微环境的的改变。改改变了土土壤中细细菌,真菌等等不同微微生物类类群的竞竞争能力力,引起土土壤微生生物群落落结构的的改变 255 。(2)土壤动动物的选选择性捕捕食作用用。土壤壤中的原原生动物物主要以以细菌和和酵母菌菌为食物物,最适合合的食物物来源是是一些假假单胞菌
15、菌( Psseuddom onaadacceaee)和肠细细菌( En terrobaacteeriaaeaee ) , 酵酵母菌中中的可勒勒克氏酵酵母(Klooeckkeraa) 、红红酵母( Rhhodootorrulaa ) 而有些些细菌,放线菌菌,真菌能能产生对对原生动动物有毒毒害作用用的细胞胞外物质质 225 。(3)土壤动动物的传传播作用用。土壤壤动物对对土壤微微生物体体或孢子子的散布布有作用用,特别是是在地表表下,在干燥燥条件下下,这时风风和水对对孢子的的散步作作用相对对小。土土壤动物物的传播播作用主主要通过过体表,口腔,粪便等等途径。1.2土土壤理化化性状对对土壤微微生物群群落
16、结构构的影响响1.2.1土壤壤物理性性状壤颗粒粒大小不同的的颗粒等等级的土土壤其中中的土壤壤微生物物差异很很大,粘粒部部分土壤壤微生物物多样性性较高,细菌数数量多,主要通通过减少少土壤微微生物被被土壤动动物捕食食的机会会,增加微微生物获获得营养养的机会会,增加土土壤环境境的多样样性如降降低氧气气浓度为为厌氧菌菌提供生生长条件件等,相反在在较大颗颗粒的土土壤中真真菌数量量相对增增加。土土壤微生生物群落落结构由由于土壤壤颗粒大大小的不不同而差差异很大大 113 。水分水分保保持能力力极大影影响了孔孔隙中的的氧气条条件, 进而影影响了相相关土壤壤中微生生物的活活性 14 。Coook等( 11970
17、0 ) 就注意意到土壤壤中细菌菌在高的的水势(watterppoteentiial)情况下下活性高高,而真菌菌,放线菌菌在相对对低的水水势情况况下活性性较高 155 。在森森林立地地条件中中土壤湿湿度是土土壤微生生物和土土壤动物物的一个个重要控控制因素素 116 。Josshuaa (119999)等研研究了桦桦树凋落落物分解解过程中中湿度对对微生物物活性和和群落结结构的影影响,发现长长时间干干燥导致致微生物物呼吸和和生物量量降低,微生物物群落结结构变化化,特别是是潮湿和和干燥的的时间长长度对土土壤微生生物影响响很大 177 。土壤温温度通通常每种种微生物物都有自自己的最最适生长长温度。微微生
18、物生生长速率率随温度度升高而而加快,当达到到最适生生长温度度后再升升高温度度,反而使使微生物物生长变变慢,而且不不同的微微生物种种类生长长的最适适温度不不同,所以,由于土土壤温度度的差别别,土壤微微生物群群落结构构组成也也不同,并且随随温度变变化而改改变。土土壤温度度变化导导致土壤壤中微生生物群落落结构发发生改变变,原因可可能是某某些微生生物群落落成员在在较高的的温度时时有能力力代谢那那些在较较低温度度时不能能被利用用的基质质 118 。不同的的气候条条件下,由不同同母岩发发育而来来的土壤壤其类型型不同,决定了了土壤颗颗粒组成成、湿度度、温度度、pHH值等理理化性状状的不同同。因此此,不同土土
19、壤类型型的中的的微生物物区系多多样性及及组成的的差别很很大。MMarttinaa S. Giirvaan等(20003)用B IIOLOOG方法法, rrDNAA - DGGGE和16SS rRRNA多多种方法法对不同同管理条条件下土土壤微生生物群落落结构及及变化规规律进行行研究,发现所所用研究究的样地地明显分分为两组组,其土壤壤微生物物群落结结构的显显著差异异是由于于土壤类类型决定定的,而不同同有机物物管理对对土壤微微生物群群落结构构影响不不大。这这是因为为不同类类型的土土壤其物物理、化化学性状状差异较较大,而对于于同一类类型土壤壤来说由由于土壤壤具有一一定的缓缓冲能力力所以土土地不同同经营
20、措措施对土土壤微生生物群落落结构的的短期影影响较小小。但是是长期作作用下,管理措措施对土土壤微生生物影响响可能更更大,这些有有待进一一步研究究 220 。1.2.2土壤壤化学性性状土壤中的的微生物物除了受受土壤物物理性状状的影响响外,更主要要的是受受到土壤壤中微生生物可利利用营养养物质的的影响。土土壤中营营养物质质主要来来源于地地上植被被的凋落落物,植物根根系分泌泌物,根的残残体,此外还还有土壤壤动物死死后残体体等,它们可可以为微微生物提提供基本本的碳源源、氮源源等物质质 221 。壤C、N元素土壤微微生物群群落结构构受土壤壤C元素影影响比较较大,随着土土壤中可可利用CC含量的的减少土土壤微生
21、生物数量量降低, 微生生物群落落结构改改变 4 。Griiffiithss等(19999)研究发发现向土土壤中施施加含CC量高的的物质能能提高土土壤微生生物群落落中真菌菌和戈兰兰氏阴性性细菌的的比例, 降低低放线菌菌和戈兰兰氏阳性性菌的比比例 22 。Noaath F. 等(20003)研究土土壤微生生物在土土壤不同同层面的的分布得得到同样样的结论论,虽土壤壤层面加加深土壤壤中微生生物数量量减少,其中真真菌和戈戈兰氏阴阴性细菌菌的比例例减少,而放线线菌和戈戈兰氏阳阳性菌的的比例增增加 4 。土土壤的NN元素是是土壤微微生物生生长的又又一个限限制因素素,土壤中中的N元素被被微生物物吸收利利用后,
22、在体内内用于合合成具有有重要生生理作用用的蛋白白质、核核苷酸等等生物大大分子. 因此此,土壤中中N元素不不足将严严重限制制土壤微微生物的的正常生生长和活活性。土土壤微生生物对土土壤N源利用用能力也也有差别别,通常N源易利利用大小小顺序为为,铵态氮氮硝态氮氮有机氮氮。此外外,不同土土壤微生生物利用用N源能力力也不同同,这就使使得土壤壤中N源的多多少和种种类将影影响到土土壤微生生物的群群落结构构。土壤壤中可被被土壤微微生物利利用营养养的碳氮氮(C /N)比是表表征土壤壤微生物物生长是是受C限制或或是N限制的的重要指指标,影响到到土壤微微生物的的群落结结构。当当C /N比等等于或大大于300: 11
23、时土壤壤微生物物生长受受到N源限制制,当C /N比等等于或小小于200: 11时土壤壤微生物物的生长长受到CC源限制制。一般般, CC /NN比在255: 11时对土土壤微生生物生长长最有利利,也有利利于维持持土壤微微生物在在自然生生态系统统中的正正常功能能。壤pHH值因素素土壤壤pH值对对于土壤壤中的微微生物群群落结构构影响是是相当复复杂的,因pH对于于营养的的利用、微微生物吸吸附、胞胞外酶的的产生和和分泌都都会产生生不同的的影响。不不同微生生物适合合生长ppH值也也有差别别,细菌、放放线菌适适宜生长长在微碱碱性的条条件下,而真菌菌适合生生长在酸酸性条件件,在大多多数酸性性土壤中中( ppH
24、 值值低于55) ,真菌数数量相对对较多,因此在在这些土土壤中,真菌所所起的作作用也比比较大。除除了土壤壤碳氮元元素和ppH因素素外,土壤中中的其它它营养元元素,如磷、硫硫等也影影响土壤壤微生物物生长和和群落结结构。另另外,土壤中中一些CCa、Mg、Mn、Fe等微微量金属属元素,也影响响土壤微微生物生生长。1.3不不同经营营措施对对微生物物群落结结构的影影响1.3.1外施施农药、化化肥等措措施农药等杀杀虫剂作作为一种种外施入入土壤生生态系统统的物质质,它和土土壤中其其它物质质一样能能被土壤壤中的微微生物或或其分泌泌的酶降降解,从而刺刺激或抑抑制了土土壤中微微生物的的活性,引起土土壤微生生物群落
25、落结构的的改变。A. C. Das(2000)研究不同杀虫剂对土壤微生物影响,发现HCH部分的有机磷杀虫剂等在田间合理的剂量下使土壤中细菌迅速增加,对放线菌、真菌刺激作用则不显著。通过对微生物具体种属的研究发现,对土壤中的优势种群影响不大,而次优种可能受到抑制导致其他种群大量生长,从而引起土壤微生物多样性其及结构的变化 35 。同时,有一些杀虫剂不能被一种微生物降解,但可以微生物之间进行的共代谢分解 36 。另外,还有一些杀虫剂对土壤中微生物产生毒害的影响 37 。Novka等曾报道除草剂与微生物量的负相关性,尤其在水热条件差的情况下,增加剂量和高频率使用,以及几种除草剂的混合使用,微生物生物
26、量和呼吸强度降低,群落结构发生变化 38 。可见农药,除草剂等化学外源物质加入土壤对土壤微生物的影响比较复杂,受农药,除草剂类型、剂量、施用方式,以及土壤类型、温度和水分等条件的影响。施肥对土壤微生物影响也很大,张翔等(1998)通过15年定位研究发现施肥能明显增加微生物数量,长期施用化肥或配合施用有机肥和无机肥比不施肥,单施肥耕作层微生物数量增多 39 。W. Borken (2000)研究了长期堆肥处理对森林土壤微生物呼吸、土壤微生物生物量碳、氮,土壤有机碳,土壤总氮的影响,结果发现施用堆肥初期土壤中微生物活性,数量增加,但是2年后土壤有机层微生物活性,呼吸下降,而土壤矿物层微生物活性、呼
27、吸却升高,原因可能是由于熟化堆肥长期处理改变了堆肥养分的释放和土壤有机层的可溶性有机质量的改变,另外熟化堆肥使用量的不同对土壤微生物影响效应也有差异 40 。施用肥料除了直接影响土壤化学成分变化,引起土壤微生物活性,土壤微生物群落结构改变外,肥料能改变土壤的物理性状,影响地上植被的生长,从而间接的影响土壤微生物群落结构。Katarina and Erland ( 2004)研究了不同氮肥对根际微生物的影响,氮肥的增加引起根系分泌物的改变,铵态氮肥使根际微生物吸入胸腺嘧啶的量减少,根际pH值下降,植物茎长度比对照短,而硝态氮肥没有明显影响 41 。将石灰、木灰等施入土壤中进行土壤恢复在农林生态系
28、统管理上是一种常用的措施,并随近年来化肥施用引起环境污染, 使得这一措施更为重要。Zimmermann and Frey (2002)研究发现在酸性森林土壤中施入木灰(wood ash)以后土壤微生物活性短期急剧增加,而对土壤化学性状影响比较持久 42 。另外,B th and Arnebrant (1994)研究发现WA应用对土壤微生物活性增加有长期效应 43 。WA 应用于森林生态系统对森林土壤微生物影响,一方面增加了土壤中微生物可利用的营养元素,另一方面改变了土壤物理形状,从而引起土壤中微生物群落结构的改变。1.3.2连栽栽、轮栽栽等措施施在农业和和林业经经营上有有连载、轮轮作和间间作等
29、不不同的模模式,并且由由于栽种种不同的的植物,导致土土壤中微微生物差差别很大大。这是是因为不不同的植植被其凋凋落物,根系分分泌物等等进入土土壤可以以被土壤壤微生物物利用的的食物资资源不同同,而且地地上植被被能影响响到土壤壤温度、湿湿度等环环境因素素,从而对对微生物物结构产产生不同同的影响响。陈灏等通通过对种种植不同同农作物物的农田田进行116SrrNA分分析发现现种植不不同作物物的农田田中存在在其特殊殊的微生生物种群群 444 。在在森林生生态系统统中不同同林型条条件下土土壤微生生物群落落结构差差别更大大,因为在在森林系系统中土土壤微生生物主要要的营养养来源是是植被凋凋落物。在在人工林林系统研
30、研究中发发现混交交林土壤壤中微生生物多样样性比纯纯林多样样性高,纯林土土壤生物物多样性性下降可可能是近近年来人人工纯林林土壤衰衰退,森林生生产力下下降原因因之一 455, 446 。在在农业和和林业生生产上存存在一个个普遍的的现象是是连作障障碍。所所谓连作作障碍就就是指在在同一块块地上连连续栽种种同一种种作物或或树木后后,其生产产力下降降。对于于这种现现象科学学家对其其进行了了广泛的的研究,很多研研究发现现连栽后后土壤中中微生物物多样性性降低了了,土壤中中出现了了一些产产生有害害物质的的微生物物,从而导导致连栽栽杉木人人工林土土壤质量量下降 199 ;杜国国坚等(19995)研研究发现现连栽杉
31、杉木林地地土壤微微生物中中的细菌菌、放线线菌数量量下降而而真菌数数量出现现增加 477, 448 ;也也有研究究发现杉杉木连栽栽后土壤壤中根际际微生物物数量增增加,非根际际微生物物下降的的现象,这可能能是连栽栽导致根根系分泌泌改变的的缘故 499 。而进进行轮作作或栽种种混交林林后能使使土壤微微生物群群落结构构改善,陆地生生态系统统中物质质、能量量循环得得以顺利利进行,使林地地生产力力得以提提高 45, 466 。1.3.3因物物种的引引入等措措施近年来,随着分分子生物物技术的的发展与与应用,越来越越多的转转基因植植物被用用于农林林生产中中. 转基基因植物物引入生生态系统统后,会对环环境产生生
32、怎样的的影响成成为科学学家关注注的问题题,转基因因植物对对土壤中中微生物物群落结结构产生生怎样影影响也引引起有关关学者的的重视。Donegan等(1995)研究了一种能产生内毒素的转基因棉花对土壤中细菌、真菌数量和结构的影响。他们发现产生内毒素的转基因棉花使土壤中微生物数量出现短暂的增多,用BIOLOG系统和DNA指纹技术等方法发现土壤微生物结构也发生变化。但是如果只加入纯净的毒素对微生物区系多样性影响则不显著。他们认为,不是由于外源底物引起微生物群落结构发生变化,可能是由于外源基因的引入使植物体内在的化学特性发生了改变,从而使植物分解加快,促使土壤微生物数量增加,土壤微生物群落结构变化 50
33、 。但是,究竟怎样影响土壤中微生物的群落结构,影响程度多大还有待今后进一步的研究。另外,也有大量转基因的微生物被释放到环境中用来降解环境中的污染物质,这些转基因微生物释放到环境中的会对土壤中原有的土著微生物群落结构产生怎样影响,都应该成为我们今后研究的问题。2土壤微微生物群群落结构构研究方方法2.1生生物标志志物（BBiommarkker）法法使用生物物标志物物来定量量描述土土壤微生生物的群群落结构构组成是是最常用用的方法法之一。这这种生物物标志物物通常是是微生物物细胞的的生化组组成成分分或是细细胞外分分泌产物物。当测测定土壤壤中这些些化合物物时，首首先使用用一种合合适的提提取剂直直接把其其从
34、土壤壤中提取取出来，然然后对提提取物进进行纯化化后用合合适的仪仪器加以以定量测测定。用用这种方方法来定定量描述述土壤微微生物的的群落结结构组成成的优点点是既不不需要把把微生物物的细胞胞从环境境样中分分离，同同时又能能克服由由于对微微生物培培养而导导致不同同微生物物种群可能会会发生选选择性生生长所造造成的麻麻烦。磷磷脂脂肪肪酸（pphossphoolippid fattty aciid, PLFFA）图图谱分析、脂脂肪酸（fatty acid, MFA）谱图以及甲基脂肪酸酯（fatty acid methyl ester, FAME）谱图分析在群落动态分析上的应用十分广泛。磷脂是构成生物细胞膜的
35、主要成分，约占细胞干重的5%3。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来4，然后用气相色谱分析，得出PLFA 谱图。群落的微生物结构发生变化，即可以通过谱图的变化得到快速有效的监测。甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，该法利用MIDI 系统（一种气相色谱分析系统）分析出全细胞的FAME 谱图。Wilkinson SC5等人用PLFA 谱图法找出了微生物群落与树木根系的关系。Haack6等人通过试验
36、验证了FAME谱图法分析土壤微生物群落的可行性，还同时进行了生物量、分类结构实验，结果表明FAME 谱图法能够监测土壤微生物群落细微变化。为人们提供了一个监测土壤微生物群落结构的常规方法。Yao Huiying7等应用PLFAs 分析了8 个不同肥力水平和种植历史的中国红壤的微生物群落结构，发现PLFAs 总量与土壤有机C、总N、微生物量C和基础呼吸呈显著正相关，种植历史和植被类型对土壤微生物群落结构有很大影响。FAME 分析法为种内关系的建立提供了一个快速而可靠的方法，但不同属甚至不同科的微生物的FAME 有可能重叠，因在区分关系较远的微生物应用上有一些困难。但以FAME 的多样性来表示一个
37、不太复复杂的生生态系统统的生物物多样性性仍有一一定的参参考价值值。2.2 BIIOLOOG 微微平板研研究单一一碳源底底物利用用能（SSolee-Carrbonn-SouurceeUtiilizzatiion，SCSSU）该方法最最初由美美国的BBIOLLOG 公司于于19889 年年开发成成功，最最初应用用于纯种种微生物物鉴定，至至今已经经能够鉴鉴定包括括细菌、酵酵母菌和和霉菌在在内的220000 多种种病原微微生物和和环境微微生物。1991 年Garland 和Mills开始将这种方法应用于土壤微生物群落的研究8,9。这种方法是基于微生物群落对95 种不同C 源的利用度来描述群落中微生物的
38、动态变化。微平板中有氧化还原指示剂和95 种不同C 源，加入样品后，由于样品对每种C 源的利用能力不同，导致氧化剂颜色变化不同，用分析系统分析结果，就可以得到群落代谢的变化情况。这样，这种C 源利用度的信息就可以用来研究不同环境条件引起的微生物群落变化。杨元根等10用Biolog方法研究了英国阿伯丁市城市土壤和邻近农村土壤的微生物群落结构和功能多样性。结果表明，在重金属元素的胁迫下，城市土壤的微生物群落与农村土壤相比发生了显著的变化。由于不同同的微生生物对同同一C 源的利利用能力力是有差差异的，微微生物对对不同单单一C 源的代代谢指纹纹差异并并不能简简单地归归纳为微微生物群群落数量量和结构构的
39、差异异，而且且土壤微微生物在在BIOOLOGG 系统统中生长长时，由由于温育育环境的的改变引引起微生生物对CC 底物物实际利利用能力力的改变变，使得得BIOOLOGG 方法法在准确确性方面面受到一一定限制制，但BBIOLLOG 方法因因快速、简简便而受受到人们们的欢迎迎。2.3 土壤壤总DNNA 复复性分析析通过测定定土壤DDNA 的碱基基组成和和复杂性性可估计计出总的的遗传结结构及其其复杂性性。分析析DNAA 的溶溶解曲线线可以得得到碱基基组成的的G+CC 百分分比。对对于一个个恒定的的DNAA 浓度度来讲，复复性速率率是DNNA 多多样性的的倒数。Britten 和Dohne11引入C0t
40、1/2 这个术语来表示基因组的大小，C0 表示实验开始时，单链DNA 中碱基对的原始摩尔浓度，t1/2 表示半数DNA 发生复性时所需要的时间，它是以秒为单位的（C0t1/2=K-1）。他们证实从一个种中分离所得的DNA，在没有DNA 重复序列存在时，它的C0t1/2值和这个种的基因组大小成正比。从土壤中抽提所得到的DDNA 是各种种不同类类型微生生物DNNA 的的混合物物，其比比例也有有着很大大的差异异。C00t1/2 值值提供了了DNAA复杂性性的资料料。目前前，已将将C0tt1/22 作为为多样性性的指标标，它是是测定群群落总的的遗传复复杂性的的方法之之一，它它反应了了群落中中信息的的量
41、以及及这些量量是如何何分布的的。Toorsvvik 等122用DNAA 复性性试验研研究了挪挪威一处处山毛榉榉树林土土壤的微微生物群群落多样样性。根根据试验验结果估估计每克克土壤中中大约有有40000 种种微生物物。土壤壤总DNNA 复复性分析析是较早早应用的的方法，该该方法对土土壤微生生物组成成结构的的估计是是比较粗粗放的，准准确性也也差，提提供的信信息少，现现在已很很少使用用。2.4 以PCRR 为基基础的rrRNAA 及rDNNA 的的分析方方法rDNAA 在细细胞中相相对稳定定，拷贝贝数多，并并存在于于所有细细菌中。rDNA 由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称
42、，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。原核生物的rRNA 分为3 种，分别为5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，并且它们位于同一操纵子上。其中，16S rRNA 序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，23S rRNA 分子比较大，并且只有少数种的核酸序列被报道，尚未在细菌分类和鉴定中得到广泛应应用。116S 223S rDNNA 间间区（IInteergeenicc SppaceerReegioon, ISRR）由于于没有特特定功能能和进化化速率比比16SSrDNNA 大大十多倍倍，近几几年来在在细菌系系统发育育学，特特别是在在相近种种和菌株株的区分分和鉴定定
43、方面占占据一席席之地。由由于以上上序列每每年都以以很快的的速度补补充到GGeneebannk 中中去，这这使得微微生物工工作者能能够比较较方便地地利用这这一数据据库进行行微生物物群体多多样性研研究。性梯度度凝胶电电泳（DDGGEE）和温温度梯度度凝胶电电泳（TTGGEE）自从Myyuzeer113首首先将DDGGEE 技术术应用到到分子微微生物生生态学后后，已证证明这类类电泳技技术是揭揭示土壤壤中微生生物群体体遗传多多样性的的有效手手段，可可用于污污染土壤壤中微生生物群落落结构的的研究、微微生物种种群动态态的分析析等。DDGGEE和TGGGE开始始时在医医学上用用于检测测基因突突变，后后来被广
44、广泛应用用于微生生物生态态的研究究。同样样大小的的DNAA 序列列由于含含有的碱碱基不同同，各片片段的TTm 值值也就不不同。甚甚至一个个碱基对对的不同同，都会会引起TTm 很很大的差差异，DDGGEE 或TGGGE 就就是应用用这种差差异来区区分不同同的基因因序列。这这种电泳泳方法在在聚丙烯烯酰胺中中加入甲甲酰胺（DGGE），从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度（TGGE）。电泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。而且染色后的凝胶用成像系统分析，还可以半定量地测定样品DNA 浓度的大小。反映微生物群落组成的变化。该方法扩增土壤样品
45、的16S rRNA 的部分基因序列（100 400bp），通过DGGE 或TGGE 分离收集不同条带的DNA 测序，再同GENEBANK 中现有的序列比较即可确定微生物种类。该方法分析土壤微生物群落结构组成具有快速、重复性好等优点，目前在土壤微生物群落结构分析上应用最为广泛。但该方法在对土壤微生物群落结构进行精细解析上具有一定的限制性，因为对于G+C 含量相同但碱基序列不同的片段难以区分。Said EL Fantroussl 等14提取了长期使用3 种Phenylurea 类除草剂（diuron, linuron, and chloro toluron）的土壤中总DNA，采用16Sr RNA
46、通用引物PCR 扩增了16S rDNA，通过分析DGGE 的条带模式，发现除草剂污染的土壤和没有使用过除草剂的土壤微生物群落结构有显著的不同，并且使用过除草剂的土壤微生物多样性减少了。而且还通过测序几种变化的DGGE 条带，发现diuron 和linuron 污染后影响最大的属于几种未被培养的微生物类群。6S rDNNA 的的限制性性片段长长度多态态性（RRFLPP）分析析（ARRDRAA）提取土壤壤中的微微生物总总DNAA，以通通用引物物扩增116S rRNNA 基基因，并并构建于于载体上上，转化化大肠杆杆菌，建建立166S rrRNAA 基因因文库，随随即选取取一定数数量的克克隆，以以特定
47、的的限制性性内切核核酸酶消消化166S rrRNAA 基因因，通过过电泳分分析消化化后的片片段长度度多态性性，来反反映微生生物群落落结构的的多样性性。Duunbaar 等等155同时时利用分分离培养养物和直直接从土土壤中提提取的116S rDNNA 基基因的RRFLPP 图谱谱分析了了松树根根圈土壤壤（piinyoon rrhizzosppherre ssoill）和树树间的土土壤（bbetwweenn-trree soiil）微微生物的的群落结结构，他他们通过过Rsaa_和BsttU_两两种限制制性内切切酶分别别分析了了1799 种分分离培养养物和8801 种直接接从土壤壤中提取取的166S
48、rDDNA 基因的的RFLLP 图图谱，发发现从土土壤中直直接提取取的有4498 种系统统型（PPhyllotyype）而而在分离离培养物物中却只只有344 种。并并且还发发现松树树根圈土土壤中的的微生物物丰富度度大于树树间的土土壤。AARDRRA 方方法是基基于碱基基的排列列顺序为为依据的的，更具具有精确确性，而而且，土土壤166S rrRNAA 基因因文库越越大，反反映土壤壤微生物物的结构构越全面面，该方方法获得得的序列列还能准准确的反反映菌株株的系统统发育信信息。AARDRRA 方方法最大大的缺点点是工作作量大，目目前，应应用该方方法进行行微生物物群落结结构分析析，还没没有人设设置重复复。16SS rDDNA 末端标标记限制制性片段段长度多多态性分分析（TT-RFFLPss）由于166S