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1、离子液体双水相体系萃取分离牛血清白蛋白邓凡政*郭东方(淮北煤炭师范学院化学系,淮北235000)本文系安徽省教育厅自然科学研究项目(No. 2004kj319)资助摘要建立了由亲水性离子液体四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪唑(BmimBF4)和KH2PO4形成的双水相体系萃取分离牛血清白蛋白(BSA)的新方法。研究了不同盐及盐的浓度、离子液体浓度以及蛋白质用量、溶液酸度、其它共存物质对双水相成相及BSA萃取率的影响,结果表明,磷酸二氢钾盐浓度为80 g/L,离子液体浓度在160240 mL/L,BSA的浓度为3050 mg/L,溶液酸度在pH 48范围,离子液体双水相体系对BSA有较高的萃取率。用
2、加入不同类型表面活性剂探讨了离子液体与蛋白质之间的作用。关键词离子液体,双水相,牛血清白蛋白,萃取分离1引言离子液体是在室温或室温附近由离子构成呈液态的物质,具有优异的化学热力学稳定性,其液态温度区间大、溶解范围广、没有显著的蒸气压以及极性较强且酸性可调等优点。因此,它是一种极具吸引力的绿色溶剂,被称为环境友好液体、“可设计性”溶剂,是传统挥发性有机溶剂的理想替代品1。近年来,离子液体也被用于萃取分离领域, Jonathan等2以甲基咪唑类离子液体作为萃取剂对多种有机物进行了萃取,离子液体还用于生物技术中的分离提取,如从生物燃料ABE的发酵液中回收丁醇3;顾彦龙等4利用室温离子液体浸取分离牛磺
3、酸与硫酸钠固体混合物;刘庆芬等5利用离子液体双水相体系对青霉素进行分离。而利用该体系对于蛋白质萃取分离的报道还较少见。为了扩大该领域应用范围,本研究用亲水性离子液体BmimBF4和磷酸二氢钾,形成上相富集离子液体和下相富集磷酸盐的双水相体系对牛血清白蛋白进行萃取研究。结果表明,该离子液体双水相体系,对牛血清白蛋白有较高的萃取率,为提纯分离蛋白质,提供一种新的方法。2实验部分2.1仪器与试剂TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司); 721型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司); pHs-3型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。牛血清白蛋白(BSA)溶液: 200 mg/L
4、; BmimBF4按文献方法制备6, 7,称取23. 4 gN-甲基咪唑溶解在25 mL甲苯中,然后向其中滴加溴代正丁烷,加热温和回流23h后,加水分层除去大部分溶剂,再经过减压蒸馏除去残留的溶剂和未反应的原料,得红棕色粘稠状物体。将NaBF4(31. 29 g)溶于80mL蒸馏水中,慢慢滴入冷却且剧烈搅拌的1-甲基-3-丁基咪唑的水溶液中(0. 28 mol溶于60 mL蒸馏水中)。然后用30 mL CH2Cl2萃取3次,有机层用30 mL蒸馏水洗涤3次,用无水MgSO4干燥,过滤,真空旋干(减压),放在真空干燥箱内真空干燥过夜;磷酸二氢钾固体;考马斯亮蓝G-250溶液、Britton-Ro
5、binson(B-R)缓冲溶液,常规方法配制。所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。2. 2实验方法在10mL刻度比色管中加入2. 00mL的BmimBF4, 0. 80 g的KH2PO4,一定量的蛋白质溶液,在研究酸度影响时再加入不同pH值的缓冲溶液2. 00mL,用二次水稀释到刻度。剧烈震荡23min,放置,分相清晰后,取上相溶液用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量,从而计算BSA的萃取率(E% )。3结果与讨论3.1盐对体系成相及BSA萃取率的影响实验中分别用了NaCl、无水Na2SO4、Na2CO3、MgSO4、CaCl2、(NH4)2SO4,NH4Cl、NH4NO3、醋酸铵、硫酸亚铁、
6、ZnSO4、H3BO3、柠檬酸、酒石酸、酒石酸氢钾、苯二甲酸氢钾、KH2PO4、柠檬酸钾、四丁基溴化铵等无机有机盐(酸),只有磷酸盐,柠檬酸钾可以与BmimBF4形成双水相,其中KH2PO4效果较好,用量少,溶解快,故实验中选用KH2PO4作为成相盐。KH2PO4加入量对相比有影响。按实验方法,随着盐量的增加,上下相体积比逐渐减小,当盐浓度达到80 g/L时,相比接近1;在80120 g/L时,相比继续减小,但变化不明显;盐浓度大于120 g/L时则其溶解不完全,实验中KH2PO4的浓度保持为80 g/L,此时体系的pH值为6。无机盐的量不仅对相比有影响,对BSA萃取率也有影响(见图1)。盐量
7、太少不分相或萃取不完全,成相盐加入量达80 g/L时萃取率最大,表明相比在11左右时有利于BSA的萃取,盐的浓度超过80 g/L后萃取率又有所减小。可能是盐的浓度过大,产生盐效应,影响离子液与BSA作用的稳定性,从而降低蛋白质的萃取率。图1KH2PO4浓度对萃取率的影响图2BSA浓度对萃取率的影响图3溶液pH对萃取率的影响Fig. 1Effect ofKH2PO4concentration on extraction efficiencyFig. 2Effect of bovine serum albumin (BSA) concentration on extraction efficien
8、cyFig. 3Effect of solution pH on extraction efficiency3. 2离子液加入量对体系成相及BSA萃取率的影响结果表明,随着离子液加入量的增大,上下相比先是减小;当离子液浓度在160240 mL/L之间时趋于一定,上下相体积比接近1。此时体系萃取率也达到最大(大于99% )。实验中保持离子液浓度为200 mL/L。3. 3蛋白质的量对成相和萃取率的影响按实验方法,固定其它条件。结果表明,相比不随蛋白质加入量改变而改变,其萃取率变化如图2。当蛋白质浓度小于30 mg/L时,萃取率随蛋白质加入量增大而增大,蛋白质浓度在3050 mg/L之间,BSA萃
9、取率趋于平稳;蛋白质加入量大于50 mg/L,萃取率又有所降低, 但变化不大。3. 4溶液酸度对成相和BSA萃取率的影响在其它条件固定不变的情况下,体系中加入2. 00 mL不同pH值的B.R缓冲溶液。结果表明,溶液酸度对成相影响不大,对BSA萃取率的变化如图3。由图3可知,溶液的酸度在pH 48范围对BSA萃取效果较好。酸度过大或过小,萃取率会有所降低。其原因可能是蛋白质与离子液之间主要有静电作用和氢键作用。BSA的等电点是4.9,在等电点及附近离子液体与蛋白质之间主要靠氢键作用,随着pH值减小,蛋白质带正电荷越来越明显,与离子液有机正离子产生排斥作用增强,萃取率降低;当溶液pH在一定范围内
10、大于等电点时,蛋白质带负电荷,增强了与离子液有机正离子之间静电引力,所以萃取率较高。3. 5加入不同物质对成相和BSA萃取率的影响按实验方法,再分别向比色管中加入一定量的无机离子或表面活性剂溶液。结果表明,当BSA浓度为40 mg/L时,以下离子对相比和萃取率没有影响(Er5% ): 100 mg/L的Na+、NH+4、Mg2+、Zn2+、Cl-、CO32-; 50mg/L的Al3+、SO2-4、Ac-、NO-3。体系中加入10 g/L的N-氯代十六烷基吡啶、十二烷基磺酸钠1. 00 mL后,上下相比变化不大,而加入同样量的Tween-80、Triton x-100使得下相体积变小相比增大;非
11、离子表面活性剂的加入,BSA萃取率变化不大;阳离子和阴离子表面活性剂的加入则萃取率有所降低。其原因可能是非离子表面活性剂不带电荷,不影响离子液与BSA的结合力;加入阳离子表面活性剂易与带负电的蛋白质基团发生静电作用,削弱了蛋白质与离子液作用。同理,阴离子表面活性剂的加入易与离子液中大的有机阳离子作用,削弱了离子液与BSA作用,从而都降低萃取率。3. 6离子液回收实验将实验过的富含离子液BmimBF4的上相溶液,用CH2Cl2反复萃取减压蒸馏,用考马斯亮蓝检验无蛋白质存在时,真空干燥过夜后按实验方法重新实验,BSA的萃取率仍在95%以上,说明离子液体经过简单处理后可以重复使用。3. 7结论(1)
12、离子液体双水相体系可以用来萃取分离生物活性物质蛋白质,萃取率较高。萃取的最佳条件是磷酸二氢钾盐的浓度为80 g/L、离子液体浓度160240 mL/L、BSA的浓度3050 mg/L、溶液酸度在pH 48。(2)离子液体双水相体系萃取分离蛋白质溶液酸度范围宽,分相迅速,界面清晰,萃取过程不发生乳化现象;离子液体经过简单处理可以重复使用。(3)离子液体双水相萃取分离蛋白质是一项新技术,对于该体系萃取机理以及被萃取物的回收等问题还有待于进一步深入研究。References1Seddon K R.J. Chem. Tech. Biotechnol.,1997, 68: 3513562Huddlest
13、on JG, W illauerH D, RogersR D.Chem. Commun.,1998, (16): 176517663FadeevA G, MeagherM M.Chem. Commun.,2001, (3): 2952964Gu Yanlong(顾彦龙), Shi Feng(石峰), Deng Youquan(邓友全).Acta Chimia Sinica(化学学报),2004, 62(5):5325365Liu Qingfen(刘庆芬),Hu Xuesheng(胡雪生),WangYuhong(王玉红).Chinese Sci.Bull.(科学通报),2005, 50(8):7
14、567596Varma R S, NamboodiriV V.Chem. Commun.,2001, 6436447Seddon K R, StarkA, TorresM J.PureAppl. Chem.,2000, 72(12): 22752287Extraction Separation ofBovine Serum Album in in Ionic Liquid Aqueous Two-phase SystemDeng Fanzheng*, Guo Dongfang(Department of Chemistry, HuaibeiCoal IndustryTeachersColleg
15、e, Huaibei235000)AbstractA newmethod to extractand separate bovine serum albumin (BSA) in a queous two-phase system (ATPS) formed by a room temperature water-soluble ionic liquid BmimBF4 (1-butyl-3-methylimidazolium -tetrafluoroborate) and phase-forming saltKH2PO4was studied. The effects of concentr
16、ation of ionic liquid, salt and BSA, solution pH value and other coexistence sulstance on the extraction efficiency and the formation two-phase were investigated systematically. W ith the solution pH value 4-8, the addition of BSA 30-50 mg/L, BmimBF4160-240 mL/L and KH2PO480 g/L, Ionic liquid-ATPS h
17、ad the highest extraction efficiency. W ith different surfactan,t the interaction ofprotein and ionic liquidwere discussed initiatively.KeywordsIonic liquid, aqueous two-phase system, bovine serum albumin, extraction separation(Received 10 February 2006; accepted 4May 2006)内容总结（1）离子液体双水相体系萃取分离牛血清白蛋白邓凡政*郭东方(淮北煤炭师范学院化学系,淮北235000)本文系安徽省教育厅自然科学研究项目(No. 2004kj319)资助摘要建立了由亲水性离子液体四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪唑(BmimBF4)和KH2PO4形成的双水相体系萃取分离牛血清白蛋白(BSA)的新方法