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1、PCR实验室常见问题及经验分享聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子 生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特 点是能将微量的DNA大幅增加。你在做PCR实验的时候遇到过哪些问题？来看看前辈们的经验。1、没有ct值检测结果遇到没有Ct值情况，排查是否有以下问题:1、循环数不够（一 般不超过45循环，不仅背景值提高，定量也不准）;2、PCR程序设置错误, 检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72延伸时采集，TaqMan 法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中;3、 引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;4、
2、模 板量可能降解或上样量不足（不超过500ng,根据试剂盒说明书即 可）,对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生 模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模 板样本小量分装储备，避免反复冻融;5、引物探针是否合适（尤其是引 物跨越内含子，以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4c以上 也会影响扩增）。2、 ct值过晚在相对定量中，Ct值一般控制在15-25之间比较好，如果在绝对定量 中，对低拷贝数的样品,Ct值会增大，但是一般不宜超过40循环，否 则定量不准确。因此，判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况，需要第1页共4页 根据具体实验设计和目的进行。
3、1、扩增效率低。引物之间或者引物 和探针的比例不合适，需要进行优化;引物或探针设计不合理，需要 重新设计;2、PCR程序不合适，改用三步法进行反应，或者优化退火/ 延伸温度，可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短（可以在推荐的 时间条件下延长10s）;3 MgCI2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足;4、PCR产物太长。PCR产物设 计超过500bp;5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或 将模板进行稀释。3、阴性对照扩增有信号照扩增有信号排查各操作环节是否有不当，造成交叉污染：1、引物设计 不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。2、引物浓
4、度不佳。 适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。3、镁离子浓度过 高。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒。4、模板有基 因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设 计避免非特异性扩增。5、交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染，或 操作环境中有气溶胶造成污染，建议对操作环境进行处理，或者更换 新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。4、标准曲线不佳标准曲线线性关系不佳R20.9,很有可能是以下环节存在问题：1、标准品稀释或者加样误差，使得标准品不呈梯度;2、标准品出现降 解。应避免标准品反复冻融，将高浓度DNA模板分装,保存于20或 -80C,现配现
5、用;3、引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或第2页共4页 探针;4、模板中存在抑制物。模板浓度过高，根据现有商品化荧光定量 试剂盒的要求，一般模板量以50-500ng为宜。5、熔解曲线峰不特异熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题:1、引物设计不够优 化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现；引物浓度不佳，尤其是涉 及二聚体存在时，适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度比 例;2、模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或 通过引物设计避免非特异性扩增。3、离子浓度不合适。适当降低镁 离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒，不同试剂盒在该方面的优化 能力不适合，有些情况
6、下可以通过更换试剂盒改善结果；6、扩增曲线异常遇到扩增曲线异常，比如“S”型曲线等等情况，有可能是以下环节存在 问题：1、模板的浓度太高或者降解;2、荧光染料的降解;3、在操作荧光定量 PCR时,带上新的一次性手套，盖上避免任何指纹或者字迹等;4、液体挥 发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里;5、气 泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。7、扩增效率低该情况适用于针对所有的基因，特别是内参基因仍无法获得较好的扩 增信号时，应考虑如下情况：1、反应试剂中部分成分比例是否最佳，另外考虑荧光染料是否降解;2、 反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延第3页共4页 长变性退火时间;3、反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板 时所引入的,应先把模板适度稀释，再加入反应体系，减少抑制物的影 响。第4页共4页