《[黄芪多糖的分离和纯化]兽药黄芪多糖的作用.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《[黄芪多糖的分离和纯化]兽药黄芪多糖的作用.docx（8页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、黄芪多糖的分离和纯化兽药黄芪多糖的作用 摘要：介绍和分析黄芪多糖的分别和纯化方法。 关键词：黄芪多糖；提取 中图分类号：Q53文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)04-0062-04 Separation and Purification of Astragalus Polysaccharides WU Li, LIU Ting-ting, LIANG Jian-feng, YU Jing-zhong (Light Industry and Food Engineering Institute, Guangxi University, Nanning 530004, Chin
2、a) Abstract：The separation and purification methods for astragalus polysaccharides are introduced and analyzed in this paper. Key words：astragalus polysaccharides; extract 黄芪（Radix Astragalus）又名黄耆1，是豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge)Hsiao或夹膜黄芪Astragulas membranaceus(Fisc
3、h.)Bge.的干燥根。黄芪是重要的益气补中药，味甘，性微温，可生用，亦可炙用。生用能固表，排毒、抗疮生肌；炙用能益气补中；其皮可利尿逐水湿，且持续时间较长。据报道，用黄芪注射液治疗失眠疗效显著。黄芪还有明显的降压作用，治疗病毒性心肌炎亦有较好疗效2。 药理探讨证明，黄芪皂苷和黄芪多糖是黄芪中最重要的自然有效成分，是黄芪药理作用的确定性因素。黄芪多糖能促进T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞的功能，对艾滋病等多种免疫缺陷症有防治效果，还可双向调整血糖，延缓细胞苍老。 黄芪多糖还对心血管系统、肝脏、肾脏等具有爱护作用。黄芪多糖和人参多糖配伍，可显著提高抗癌活性，降低化疗副作用。黄芪多糖注射液是平安
4、有效的抗肿瘤药。目前黄芪多糖主要出口国外，国内需求量也很大，具有广袤的发展前景34。现对黄芪多糖的提取、脱蛋白质、纯化、多糖含量测定等的探讨进展作一综述。 1黄芪多糖的提取 1.1黄芪多糖的提取方法 1.1.1水煮醇沉法2黄芪根粉不同次数不同量的水煮沸回流不同的时间合并滤液调为中性浓缩加入肯定浓度的乙醇或甲醇离心分别加水溶解过滤滤液浓缩至小体积加乙醇或甲醇至浓度的80%乙醇或丙酮洗涤冷冻（或25）真空干燥粗多糖。 1.1.2CaO水提5pH910的CaO水溶液煮沸提取，浓缩时调pH6.5左右，此后步骤同1.1.1 1.1.3Na2CO3水提5pH910的Na2CO3水溶液煮沸提取，浓缩时调pH
5、6.5左右，此后步骤同1.1.1 1.1.4微波提取微波具有穿透力强、选择性好、加热效率高等特点。微波辐射可大大加快反应速度(最高达1 240倍)，反应时间以分、秒计。微波技术用于植物细胞破壁，有效地提高了收率6。王莉等首次用微波技术从黄芪中提取黄芪多糖，以石油醚、乙醚除去黄芪中的脂溶性杂质，用80%的乙醇除去单糖、低聚糖及苷类等干扰性成分；置MCL-3型连续微波反应器中接着以水回流提取20 min，调整功率为630，600，560，450 ，减压浓缩至1/2体积，加入0.1%活性炭脱色，过滤；滤液加入95%乙醇溶液使其含醇80%，静置过夜；过滤，残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤，即得黄芪多糖粗品
6、2。 1.1.5超滤法超滤作为膜分别技术，可在常温下操作，不需反复加热和相态转容，有利于保持中药成分的生物活性和物理化学稳定性。它不仅可用于混合液中悬浮和分散物质的纯化和分别，而且可用于去除溶液中的低聚物和大分子物质。因此，越来越多的学者致力于超滤技术在中药成分中的分别、除杂、浓缩等方面的应用与探讨7。李树珍8等用超滤法提取黄芪多糖，黄芪粉水煮后的上清液用中空纤维超滤，选用相对分子质量为6 000的超滤膜，截留下相对分子质量在6 000以上的大分子，经2次醇沉后即得多糖的粗提物。 1.2提取方法的比较 1.2.1水煮醇沉提取法工艺操作简洁，对多糖的提取比较充分，但收率（约2.5%）和含量较低，
7、周期长，提取过程中耗费大量有机溶剂，成本高。CaO和Na2CO3水提工艺收率显著提高，分别为11.7和5.7，成本也明显低于水煮醇提法。 1.2.2李红民等5报道，在用Na2CO3水溶液提取时，滤液不易过滤和浓缩，在浓缩过程中出现大量凝胶状不溶物，水溶时亦有大量不溶物存在，这是Na2CO3提取收率低于CaO水溶液提取法的主要缘由。由此推想，碱性的强弱对纤维多糖的结构影响很大，所以在提取黄芪多糖时相宜用较弱的碱性提取液。 1.2.3微波技术用于黄芪多糖提取可使反应时间缩短为其他方法的1/13左右，多糖含量可达到6.55左右。 1.2.4据报道，黄芪多糖的相对分子质量在1万5万左右，因此在不同提取
8、工艺中用超滤法选择超滤膜相对分子质量为6 000，可将多糖完全提取。 2黄芪多糖中蛋白质的脱除 自然植物中多糖与蛋白质2种高分子成分共存，相对分子质量相近。而且多糖常与蛋白质形成糖蛋白复合物，使蛋白质脱除困难。但或许正是由于与蛋白质结合，多糖才具有与蛋白聚糖、糖蛋白相同的生理功能9。据报道，黄芪多糖中蛋白质含量较高（15，凯氏定氮法），脱除蛋白质有助于提高其临床效果和扩展应用范围，是多糖精制过程中比较重要的一步。传统的脱蛋白质方法有Sevag法、三氯三氟乙烷法和三氯醋酸法。这几种方法脱除蛋白质的效果虽较好，但都有缺点，如有机溶剂用量大，耗时长，水相与有机相的分别困难，简单造成样品损失，且有机溶
9、剂有毒性和腐蚀性10。徐建祥等将酶法脱蛋白质技术用于螺旋藻多糖提取工艺，结果表明，用酶法脱蛋白质的效果优于Sevag法；刘成梅等探讨了百合多糖脱蛋白的方法，结果表明，酶法与Sevag法联用优于其他方法。现介绍Sevag法和酶法脱除黄芪多糖中的蛋白质。 2.1Sevag法脱除蛋白质 Sevag法以氯仿-正丁醇或异戊醇使蛋白质变性，然后离心分别去除。在肯定浓度的粗多糖溶液中加入其体积1/3的氯仿正丁醇（4:1）溶液，振摇30 min，3 000 r/min离心1 min，取少量水相测蛋白质含量，再加入相当于水相体积1/3的氯仿正丁醇溶液，重复若干次直到蛋白质含量较稳定为止。 2.2酶法脱除蛋白质
10、黄芪多糖溶液中加入适量蛋白酶，在最适温度下酶解肯定时间，100 沸水5 min灭酶，以4倍体积的无水乙醇醇沉，测定得到的多糖中蛋白质。为避开影响多糖的生理功能，酶解过程不调pH。闫巧娟等10用5种蛋白酶作用于黄芪多糖的探讨表明，中性蛋白酶1的脱蛋白质效果最好，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶2次之，酸性和碱性蛋白酶效果最差。 2.3酶法与Sevag法效果比较 用中性蛋白酶1在最适酶解条件下处理多糖粗品，多糖的得率为75.6%，最终蛋白质含量为0.72%；用Sevag法处理15次，有机溶剂用量约4 L，需耗时几天，多糖得率为62.8%，最终蛋白质含量为1.98%10。 2.4多糖中蛋白质含量的测定 依据有
11、关探讨对比11，采纳考马斯亮蓝G-250染色法，以牛血清蛋白为标准品进行测定12。 3黄芪多糖的纯化 黄芪多糖脱蛋白后的沉淀物溶于蒸馏水中，用DEAE纤维素(2.6 cm100 cm)柱13层析，相宜流速流出，蒸馏水洗脱，得单一洗脱峰，经SephadexG-150柱过滤水洗，收集单一对称峰，得黄芪多糖液体；将糖液置于透析膜中，在蒸馏水中透析48 h以上，除去小分子化合物等杂质，真空浓缩，冷冻干燥即得黄芪多糖精品14。 4黄芪多糖含量的测定 目前多糖含量的测定尚无统一标准，应用较广泛的是苯酚硫酸比色法。此法简洁、快速、无需多糖纯品和珍贵仪器，且水溶性样品和非水溶性样品均可测定。耿霞等发觉，多糖-
12、苯酚-硫酸显色反应体系的一阶导数光谱值与多糖含量成正比，可干脆用于测定中药中的多糖含量，因此建立了苯酚-硫酸显色导数光谱分析多糖的方法。 4.1苯酚硫酸比色法 苯酚硫酸比色法测定多糖含量是由Dubois等提出的。其原理是多糖或寡糖在适当高温下被浓硫酸水解，产生单糖，并快速脱水成糠醛衍生物。此衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长490 nm处和肯定浓度范围内，其吸光度A值与糖浓度C呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。详细方法见文献15。 4.2苯酚硫酸导数光谱法 苯酚硫酸比色法要求被测溶液本身无色或色较淡，而且溶液中其他组分在490 nm左右无明显汲取或汲取甚少。被测品颜
13、色较深时会对测定产生干扰，测定前需行活性炭脱色或其它处理，苯酚硫酸导数光谱法可干脆测定，不受干扰，此测定方法可参照文献16。 5结论 多糖和皂苷是黄芪的主要有效成分，目前多用水煮醇沉提取，取上清液部分或醇沉部分，此法奢侈药用资源。工业生产黄芪多糖时，可用超滤法分别黄芪水提液，得到富集多糖的浓缩液部分和富集皂苷的透过液部分，将浓缩液部分再精制得多糖精制品，透过液部分上AB8型树脂柱，用95乙醇洗脱，减压回收乙醇至无醇味，真空干燥得皂苷粗品，可更经济地利用黄芪的有效成份。 工业生产中可将黄芪根粉水煮改为CaO水溶液煮，以提高多糖收率，降低提取成本，在生产应用上具有现实意义。 酶法脱除黄芪多糖中蛋白
14、质的提取工艺中，加入蛋白酶的时机有2个方案可供选择；（1）在浓缩的提取液中加入乙醇并分别沉淀后，对沉淀物进行蛋白酶水解处理以除去其中的蛋白质；（2）干脆在黄芪粉溶液中加入蛋白酶对蛋白质水解后再作后续处理。试验结果表明，无论多糖粗制品收率还是从蛋白质脱除，方法二的效果更好些。提取黄芪多糖时可采纳方法二，既可保证多糖中蛋白质有较高的脱除率，又可使浓缩工艺简洁省时。含量测定时选取苯酚硫酸导数光谱法，适用范围广，受干扰小。 参考文献 1郭小清，唐莉苹，杜海. 黄芪多糖的药理作用及其在畜禽保健中的应用J. 中国动物保健，2004，（3）；45. 2姜俊艳，陈旭东，李长坤，等. 黄芪多糖的用途和提取J. 化学工程师，2003，（4）：55-56. 3贺珍俊，那日苏. 黄芪多糖提取工艺探讨综述R. 内蒙古石油化工，2003，29：5-6. 4黄桢. 黄芪多糖的药理探讨进展J. 中国临床药学杂志，2002，11（5）：315. 5李红民，黄仁泉，王亚洲. 提高黄芪多糖提取收率的工艺